WO2024092946A1 - 具有普适性的提取微生物dna的试剂盒及方法与应用 - Google Patents

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WO2024092946A1
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蔡伟文
范世睿
黄亦杭
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中山康源基因技术科技有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention belongs to the field of molecular biology, and particularly relates to a universal kit, method and application for extracting microbial DNA.
  • DNA extraction there are many methods for DNA extraction, mainly physical extraction, chemical extraction, membrane centrifugal column method and magnetic bead method.
  • Physical extraction methods include grinding and high-temperature heating. If the intensity is too intense, it is easy to damage the double-stranded DNA. If the intensity is insufficient, grinding cannot effectively destroy the cell structure of bacteria, and it is difficult to ensure that the cell structure is fully lysed.
  • Chemical extraction methods include CTAB method, SDS method and phenol chloroform extraction method. The operation method of chemical extraction is mature, but the DNA operation of chemical extraction method is cumbersome, requires multiple transfers, is time-consuming, and is easy to lose.
  • the phenol chloroform extraction method requires the use of organic toxic solvents such as chloroform during the extraction process, which poses a greater risk of harm to the human body.
  • the membrane centrifugal column method has a stable extraction effect and a fast operation speed, but it requires multiple transfers of liquid, and the extraction efficiency is not high for fungi and small fragments of DNA that contain more sugar substances.
  • the magnetic bead method can quickly separate and purify DNA.
  • the specific binding of magnetic beads to nucleic acids makes the nucleic acid specificity high.
  • the extraction process does not require centrifugation and filtration. It can be operated manually or on an automated work platform. It has a high extraction flux and a good automated process.
  • the magnetic bead method is often used for routine sampling and virus sampling specimens. It is difficult to extract trace amounts of microorganisms, especially fungi with cell walls, which must be specially processed before nucleic acid extraction.
  • a universal kit, method and application for extracting microbial DNA which has high throughput, high sensitivity, low risk and low pollution for detecting microbial species, is economical and practical, has simple steps and can be applied to automated processes, and is of great significance.
  • the primary purpose of the present invention is to overcome the shortcomings and deficiencies of the prior art and to provide a universal kit for extracting microbial DNA.
  • Another object of the present invention is to provide a universal method for extracting microbial DNA, which is implemented by the above-mentioned kit.
  • the method uses physical, chemical and enzymatic methods to extract DNA, which solves the problem of DNA structure damage caused by traditional physical extraction methods; solves the shortcomings of traditional chemical extraction methods, does not use toxic and contaminated reagents; and can extract DNA from ultra-trace microorganisms, greatly improving the sensitivity of extraction; it is easy to use and can be applied to automated equipment, reducing labor costs and being economical and affordable, and reducing human errors.
  • Another object of the present invention is to provide applications of the above-mentioned kit and method.
  • a universal kit for extracting microbial DNA comprising a pretreatment solution, an enzymatic solution, a lysis solution, a magnetic bead purification solution, an elution solution and a protective solution;
  • composition of the pretreatment solution is as follows: saponin 0.1-1 mg/mL, sodium hydroxide 0.2-1 mol/L, potassium chloride 0.05-0.1 mol/L, pH 11-13; preferably as follows: saponin 0.5 mg/mL, sodium hydroxide 0.5 mol/L, potassium chloride 0.05 mol/L, pH 13;
  • composition of the enzymatic hydrolysate is as follows: Tris 10-30mmol/L, EDTA 0.2-2mmol/L, NaCl 0.01-0.15mol/L, Triton X-100 0.1-3% (v/v), polyethylene glycol 35000 1-8% (w/v), trehalose 0.1-1mol/L, RNase A 0.1-0.5mg/mL, lysozyme 1-10mg/mL, snail enzyme 1-10mg/mL, pH 6.0-8.0; preferably as follows: Tris 20mmol/L, EDTA 1mmol/L, NaCl 0.1mol/L, Triton X-100 1% (v/v), polyethylene glycol 35000 5% (w/v), trehalose 0.5mol/L, RNase A 0.2mg/mL, lysozyme 5mg/mL, snail enzyme 5mg/mL, pH 7.5;
  • composition of the lysis buffer is as follows: Tris 10-30mmol/L, EDTA 0.2-2nmol/L, Triton X-100 0.1-3% (v/v), sodium chloride 0.5-1mol/L, protease 10-30mg/mL, pH 6.0-8.0; preferably as follows: Tris 25nmol/L, EDTA 1nmol/L, Triton X-100 1% (v/v), sodium chloride 0.8mol/L, protease 20mg/mL, pH 7.5;
  • composition of the magnetic bead purification solution is as follows: 4-6 mg/mL of magnetic nano-ferroferric oxide, and the solvent is isopropanol; preferably as follows: 5 mg/mL of magnetic nano-ferroferric oxide, and the solvent is isopropanol;
  • the eluent is 75-85% (v/v) isopropanol, preferably 80% (v/v) isopropanol;
  • the protective solution is TE solution.
  • the RNase A is preferably 60 U/mg RNase A.
  • the lysozyme is preferably 2000U/mg lysozyme.
  • the snail enzyme is preferably 10 mg/mL of snail enzyme.
  • the protease is preferably 20U/mg protease.
  • the ferroferric oxide particles are preferably magnetic ferroferric oxide particles with a diameter of 30 to 60 nanometers; more preferably, magnetic ferroferric oxide particles with a diameter of 50 nanometers.
  • composition of the TE solution is as follows: 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
  • a universal method for extracting microbial DNA, using the above kit to extract microbial DNA comprises the following steps:
  • the reaction conditions in step (1) are preferably 36-38°C for 5-15 min; more preferably 37°C for 10 min.
  • the centrifugation condition in step (1) is preferably 10,000-15,000 rpm for 1-5 min; more preferably 14,000 rpm for 2 min.
  • the drying conditions in step (1) are preferably drying at 65-75° C. for 3-6 minutes; more preferably drying at 65° C. for 5 minutes.
  • the enzymatic hydrolysis reaction conditions in step (2) are preferably 36-38° C. for 30-40 min; more preferably 37° C. for 5 min.
  • the conditions for the cleavage reaction in step (3) are preferably 68-72° C. for 30-40 min; more preferably 70° C. for 35 min.
  • the adsorption reaction conditions in step (4) are preferably room temperature reaction for 8 to 12 minutes; more preferably room temperature reaction for 10 minutes.
  • the room temperature is 10-40°C, preferably 20-30°C, and more preferably 24-26°C.
  • steps (2) to (4) are carried out in a stationary state or a rotating state.
  • the rotation speed is below 50 rpm, preferably 5 to 30 rpm, and more preferably 10 rpm.
  • the function of the rotation is to accelerate the reaction.
  • the number of repeated cleanings in step (5) is preferably 2 times.
  • step (5) The drying conditions described in step (5) are preferably drying at 65-75° C. for 3-6 minutes; more preferably drying at 70° C. for 5 minutes.
  • the application of the kit and method in the extraction of microbial DNA is suitable for the extraction of ultra-trace microbial DNA.
  • the applications include applications for scientific research purposes and applications for diagnostic purposes.
  • the microorganisms include bacteria and fungi.
  • the fungi include yeast and Candida.
  • the Candida species include Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida lusutica and Candida krusei.
  • the bacteria include Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus and Enterococcus faecium.
  • the ultra-trace amount refers to a bacterial content as low as 10 2 cells/mL.
  • the present invention has the following advantages and effects:
  • the present invention is suitable for the extraction of most microorganisms, including most bacteria and fungi, such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, etc.; fungi such as Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida portuguesa, etc.
  • bacteria and fungi such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, etc.
  • fungi such as Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida portuguesa, etc.
  • the reagents used in the extraction process of the present invention are non-toxic and pollution-free reagents, and all of them are cheap biochemical reagents.
  • the instruments and equipment used in the extraction process of the present invention are all commonly used conventional laboratory instruments and equipment.
  • the present invention does not require cumbersome physical wall breaking processes such as liquid nitrogen grinding, thus avoiding cross contamination.
  • the process of the present invention is gentle, avoids DNA damage, and has high extraction efficiency.
  • the present invention realizes the extraction in a test tube or a centrifuge tube without transferring the test solution.
  • the method provided by the present invention only requires a bacterial concentration of 10 2 to extract effective DNA, and the extraction sensitivity is higher.
  • the present invention can be applied to automated machine operation, thereby reducing labor costs and human errors.
  • Figure 1 is a standard curve of Staphylococcus aureus.
  • FIG. 2 is a fluorescence PCR curve diagram of the Staphylococcus aureus DNA templates a1 and a2 extracted by the kit.
  • FIG. 3 is a fluorescence PCR curve diagram of Staphylococcus aureus DNA templates a3 and a4 extracted by commercially available kits.
  • FIG. 4 is a fluorescence PCR curve diagram of Staphylococcus aureus DNA templates a5 and a6 extracted by commercially available kits.
  • FIG. 5 is a graph showing a standard curve of Candida glabrata.
  • FIG6 is a fluorescence PCR curve diagram of the Candida glabrata DNA templates b1 and b2 extracted by the kit.
  • FIG. 7 is a fluorescence PCR curve of Candida glabrata DNA templates b3 and b4 extracted using a commercially available kit.
  • FIG8 is a fluorescence PCR curve of Candida glabrata DNA templates b5 and b6 extracted using a commercially available kit.
  • FIG. 9 is a fluorescence PCR curve diagram of the Enterococcus faecium DNA templates d1-d7 and D1-D7 extracted by the present invention.
  • FIG. 10 is a fluorescence PCR curve diagram of the Enterococcus faecium DNA templates e1-e7 and E1-E7 extracted by the present invention.
  • FIG. 11 is a fluorescence PCR curve graph of the Candida albicans DNA template k1 obtained using the pretreatment solution of the present invention, the Candida albicans DNA template k2 obtained after replacing the treatment solution, and the Candida albicans DNA template k3 obtained by treating with physiological saline.
  • FIG. 12 is a diagram showing the initial morphology and quantity of Candida glabrata under a microscope.
  • FIG. 13 is a microscopic image of the morphology and quantity of Candida glabrata after treatment.
  • composition and function of the enzymatic hydrolysate are as follows:
  • the concentration of tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride is 20mmol/L, and its function is to provide a buffer environment to keep the pH of the solution within a certain range;
  • the concentration of EDTA is 1mmol/L, and its function is to chelate divalent metal ions, which can inhibit the activity of endonucleases;
  • the concentration of sodium chloride is 0.1 mol/L, and its effect is that this concentration of sodium chloride can reduce the solubility of DNA;
  • Triton X-100 concentration of Triton X-100 is 1% (v/v), and its function is to act as a cell permeabilizer, dissolving lipids on the cell membrane;
  • the concentration of polyethylene glycol 35000 was 5% (w/v), and its function was to precipitate DNA;
  • the concentration of trehalose was 0.1 mol/L, and its role was as a protective agent
  • the concentration of RNase A (60 U/mg) is 0.5 mg/mL, and its function is to remove non-specifically bound RNA; the concentrations of lysozyme (20000 U/mg) and snail enzyme (original concentration 10 mg/mL) are both 5 mg/mL, and their function is to dissolve various cell walls.
  • Tris tris(hydroxymethylaminomethane) hydrochloride
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • NaCl sodium chloride
  • Triton X-100 Triton X-100
  • trehalose Triton X-100
  • polyethylene glycol 35K dissolve in an appropriate amount of sterile water, adjust the pH value to 7.5, and sterilize at 121°C for later use; add lysozyme, snail enzyme, and RNase after cooling, and store at 2-8°C.
  • composition and function of the lysis buffer are as follows:
  • the concentration of tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride is 25nmol/L, and its function is to provide a buffer environment to keep the pH of the solution within a certain range;
  • the concentration of EDTA is 1 nmol/L, and its function is to chelate divalent metal ions, which can inhibit the activity of endonucleases;
  • Triton X-100 concentration of Triton X-100 is 1%, and its function is to act as a cell permeabilizer, dissolving lipids on the cell membrane;
  • protease 20 U/mg
  • its function was to hydrolyze protein to produce amino acids
  • the concentration of sodium chloride is 0.8 mol/L. Sodium chloride at this concentration provides a high salt environment to break the cell membrane and expose the DNA.
  • the commercially available magnetic nano-ferroferric oxide has a diameter of 50 nanometers. Its function is to adsorb nucleic acids and purify them. Weigh the magnetic nano-ferroferric oxide, dilute it to 5 mg/mL with isopropanol and set aside.
  • the elution solution is 80% (v/v) isopropanol, which is used to elute impurities on nucleic acids. Take isopropanol and dilute it with sterile water for later use.
  • the protective solution is TE solution, prepared with 50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0, which is used to maintain the pH of the solution and maintain the stability of DNA.
  • TE solution prepared with 50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0, which is used to maintain the pH of the solution and maintain the stability of DNA.
  • the pretreatment solution is a saponin solution in an alkaline buffer system, and the alkaline buffer system is composed of sodium hydroxide-potassium chloride.
  • the concentration of sodium hydroxide in the pretreatment solution is 0.5 mol/L, and the concentration of potassium chloride is 0.05 mol/L, and its function is to liquefy the viscous body fluid sample.
  • the concentration of saponin is 0.5 mg/mL, and its function is to dissolve red blood cells, preventing a large number of red blood cells from affecting the detection, while not destroying the microbial cell structure.
  • Candida albicans standard number ATCC10231, supplier code LWCC2005
  • Candida glabrata standard number ATCC15126, supplier code LWCC2008
  • Candida parapsilosis standard number ATCC22019, supplier code BNCC263246
  • Candida krusei standard number ATCC6258, supplier code BNCC185429).
  • Staphylococcus aureus (standard number CMCC(B)26003, supplier code NW2003), Enterococcus faecium (standard number ATCC35667, supplier code NW2019).
  • Example 1 Comparative experiment of extracting bacterial DNA using this method and a commercially available kit
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, primer F1 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, primer R1 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F1 5′-GAAGCTTGCTTCTCTGATGTT-3′;
  • Primer R1 5’-CAGCAAGACCGTCTTTCACT-3’.
  • Table 1 CT value and extraction efficiency of the standard curve and the comparison kit for Staphylococcus aureus amplification curve
  • the efficiency of bacterial DNA extraction by the method provided by the present invention is higher than that of other kits.
  • Example 2 Comparative experiment of extracting fungal DNA using this method and a commercially available kit
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, primer F2 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, primer R2 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F2 5′-CGATTTTTTCGTGTACTGGAATG-3′;
  • Primer R2 5’-CGCCAAGCCACAAGGACTT-3’.
  • Table 2 CT value and extraction efficiency of Candida glabrata amplification curve of standard curve and comparison kit
  • the efficiency of extracting fungal DNA by the method provided by the present invention is higher than that of other kits.
  • Example 3 This method was used to extract bacterial DNA and perform a concentration gradient test.
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, primer F3 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, primer R3 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F3 5′-CGAACGCTTCTTTTTCCACC-3′;
  • Primer R3 5’-CTTTCAAATCAAAACCATGCGGTT-3’.
  • Table 3 CT values of amplification curves of Enterococcus faecium at different concentrations
  • Example 4 This method was used to extract fungal DNA and perform a concentration gradient test.
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, primer F4 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, primer R4 (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F4 5′-GTACTTCCATATCCAAGACCTTT-3′;
  • Primer R4 5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’.
  • Table 4 CT values of amplification curves of Candida auris at different concentrations
  • Example 5 Comparative experiment after increasing or decreasing the components of the enzymatic hydrolysate.
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, upstream primer (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, downstream primer (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F5 5′-GGACGGTCTACCTATGGTAA-3′;
  • Primer F6 5′-CCTTCTGGCTAGCCTTTTTG-3′;
  • Primer R4 5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’.
  • Primer F7 5′-TTCCTTCTGGGTAGCCATTT-3′;
  • Primer R4 5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’.
  • Table 5 Comparison of CT values and extraction efficiency of amplification curves of full components and only containing snail enzyme
  • Example 6 Comparative experiment after replacement of pretreatment solution.
  • Control group k2 Take 1 mL of Candida albicans suspension diluted to 5 ⁇ 10 6 cells/mL with blood, add an equal amount of 0.5% (w/v) SDS + 1% (v/v) Triton X-100 + 0.5M NaCl mixture, react at 37°C for 10 min, centrifuge at 14000 rpm for 2 min, collect the bacteria to the bottom of the tube, pour off the supernatant, and absorb as much visible residual liquid as possible. The precipitate is placed at 65°C for drying for 5 minutes.
  • Control group k3 Take 1 mL of Candida albicans suspension diluted to 5 ⁇ 10 6 cells/mL with blood, add an equal amount of physiological saline and react at 37°C for 10 minutes, centrifuge at 14000 rpm for 2 minutes, collect the bacteria to the bottom of the tube, pour off the supernatant, and absorb as much visible residual liquid as possible. The precipitate is placed at 65°C for 5 minutes for drying.
  • the amplification reaction system was: SYBR Green qPCR mix 12.5 ⁇ L, upstream primer (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, downstream primer (0.2 mmol/L) 2 ⁇ L, DNA template 1 ⁇ L, and sterile water 3.5 ⁇ L.
  • Primer F7 5′-TTCCTTCTGGGTAGCCATTT-3′;
  • Primer R4 5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’.
  • Example 7 Changes in bacterial morphology and quantity after treatment with enzymatic solution and lysis solution

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Abstract

提供一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒及方法与应用。该试剂盒包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液。使用该试剂盒进行微生物DNA的提取，包括预处理、前解、裂解、吸附、洗脱提纯等步骤。该试剂盒适用于大部分细菌和真菌的提取，且无有毒、有污染试剂，提取过程简单，适用于自动化设各提取，灵敏度高，仅需10 2菌浓度就能提取有效DNA。

Description

具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒及方法与应用 技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒及方法与应用。
背景技术
病菌感染一直以来影响人身体健康的重大问题，近年来，随着各种病症问题不断普及，人们对病菌感染的认知也越来越广泛。大多数疾病的发生都和细菌、真菌有密切关系，然而传统的检测方法如：通过增菌、分离培养、生化反应与血清凝集等检测方法已经远不能满足现代社会快速检测的要求。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、稳定性好、灵敏度高、检测速度快等优点在医疗临床检测领域得到广泛的应用，其中模板DNA的提取是其中的重要步骤之一，如何快速提取DNA模板是提高实时荧光定量PCR法检测灵敏度和速度的关键。
目前，DNA的提取方法有很多，主要有物理提取法、化学提取法、滤膜离心柱法和磁珠法等。物理提取法有研磨和高温加热法，若强度过于激烈，容易破坏DNA双链，若强度不足，对于细菌来说研磨并不能有效的破坏细胞结构，难以保证细胞结构裂解充分；化学提取法包括CTAB法、SDS法和苯酚氯仿抽提法等，化学提取法操作方法成熟，但化学提取法DNA操作繁琐、需要多次转移，耗时长，易损失，并且苯酚氯仿抽提法在提取过程中需要使用氯仿等有机毒溶剂，对人体伤害险较大；滤膜离心柱法提取效果稳定，操作速度快，但是需要多次转移液体，对于含糖物质较多的真菌和小片段DNA提取效率不高。
此外，研磨、离心、多次转移反应液、滤膜离心柱等需人工操作步骤，不利于自动化设备的实施，不易适用于自动化提取流程，提取通量小，人工个体间操作误差大，人工成本高，所以难以适应高效的检测工作。磁珠法可以快速分离纯化DNA，磁珠与核酸特异性结合使得核酸特异性高，提取过程无需离心和过滤，既可以手工操作，也可以适用自动化工作平台，提取通量高、自动化流程好，但磁珠法常用于常规取样和病毒取样标本，对微量的微生物提取难度大，特别对于有细胞壁的真菌更是要特别进行处理后方可进行核酸提取；
目前市场上常规试剂盒对于每种真菌的细胞膜和细胞壁有不同的处理方式和方法，常常是单一提取试剂盒对应单一种类的真菌，提取种类通量小，对于其他真菌的核酸提取，提取效率和灵敏度有明显的下降甚至无法提取。对于有着复杂成分的血液、痰液样本，常规提取试剂盒不能有效的对样本中微量细菌和真菌进行DNA的提取，或者多菌复合感染中不能对全部的微生物进行DNA的提取，容易造成误检、漏检。
因此，为了适应于医疗机构和检测机构样品量大的特点，发明一种普适性的提取微生物DNA的试剂盒及方法与应用，其具有检测微生物种类高通量、高灵敏度、低风险低污染、经济实惠、步骤简捷可适用于自动化流程，有着重大意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种具有普适性的提取微生物DNA的方法，采用上述试剂盒 实现。该方法通过物理法、化学法和酶法提取DNA的方法，解决了传统物理提取法对DNA结构破坏的问题；解决了传统化学提取法的缺点，不使用有毒和有污染的试剂；并且能从超微量微生物中提取DNA，大大的提高了提取的灵敏度；使用简便可适用于自动化设备、降低人工成本经济实惠、减少人为误差。
本发明的再一目的在于提供上述试剂盒和方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液；其中：
预处理液的组成如下：皂苷0.1～1mg/mL、氢氧化钠0.2～1mol/L、氯化钾0.05～0.1mol/L，pH 11～13；优选如下：皂苷0.5mg/mL、氢氧化钠0.5mol/L、氯化钾0.05mol/L，pH 13；
酶解液的组成如下：Tris 10～30mmol/L、EDTA 0.2～2mmol/L、NaCl 0.01～0.15mol/L、曲拉通X-100 0.1～3％(v/v)、聚乙二醇35000 1～8％(w/v)、海藻糖0.1～1mol/L、RNA酶A 0.1～0.5mg/mL、溶菌酶1～10mg/mL、蜗牛酶1～10mg/mL，pH6.0～8.0；优选如下：Tris 20mmol/L、EDTA 1mmol/L、NaCl 0.1mol/L、曲拉通X-100 1％(v/v)、聚乙二醇35000 5％(w/v)、海藻糖0.5mol/L、RNA酶A 0.2mg/mL、溶菌酶5mg/mL、蜗牛酶5mg/mL，pH7.5；
裂解液的组成如下：Tris 10～30mmol/L、EDTA 0.2～2nmol/L、曲拉通X-100 0.1～3％(v/v)、氯化钠0.5～1mol/L、蛋白酶10～30mg/mL，pH6.0～8.0；优选如下：Tris 25nmol/L、EDTA 1nmol/L、曲拉通X-100 1％(v/v)、氯化钠0.8mol/L、蛋白酶20mg/mL，pH7.5；
磁珠提纯液的组成如下：磁性纳米四氧化三铁4～6mg/mL，溶剂为异丙醇；优选如下：磁性纳米四氧化三铁5mg/mL，溶剂为异丙醇；
洗脱液为浓度是75～85％(v/v)的异丙醇；优选为80％(v/v)的异丙醇；
保护液为TE溶液。
所述的RNA酶A优选60U/mg的RNA酶A。
所述的溶菌酶优选2000U/mg的溶菌酶。
所述的蜗牛酶优选10mg/mL的蜗牛酶。
所述的蛋白酶优选20U/mg的蛋白酶。
所述的四氧化三铁颗粒优选直径为30～60纳米的磁性四氧化三铁颗粒；更优选直径为50纳米的磁性四氧化三铁颗粒。
所述的TE溶液的组成如下：50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0。
一种具有普适性的提取微生物DNA的方法，使用上述试剂盒提取微生物DNA，包括如下步骤：
(1)取1～5mL的样品，加入等量预处理液反应，离心，倒去上清，尽量吸干可见残留液体；得到的沉淀烘干；
(2)加入100μL酶解液，涡旋振荡混匀，进行酶解反应；
(3)加入250μL裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，进行裂解反应；
(4)加入350μL磁珠提纯液，涡旋混匀，进行吸附反应，反应后弃上清；
(5)用1mL洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清；重复清洗沉淀，将所得沉淀烘干；
(6)加入30μL保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀，即得到微生物DNA。
步骤(1)中所述的反应的条件优选为36～38℃反应5～15min；更优选为37℃反应10分 钟。
步骤(1)中所述的离心的条件优选为10000～15000rpm离心1～5min；更优选为14000rpm离心2分钟。
步骤(1)中所述的烘干的条件优选为于65～75℃烘干3～6分钟；更优选于65℃烘干5分钟。
步骤(2)中所述的酶解反应的条件优选为36～38℃反应30～40min；更优选为37℃反应5分钟。
步骤(3)中所述的裂解反应的条件优选为68～72℃反应30～40min；更优选为70℃反应35分钟。
步骤(4)中所述的吸附反应的条件优选为室温反应8～12分钟；更优选为室温反应10分钟。
所述的室温为10～40℃；优选为20～30℃；更优选24～26℃。
步骤(2)～步骤(4)中所述的反应是在静置状态或旋转状态下进行反应。
所述的旋转的转速在50rpm以下；优选为5～30rpm；更优选为10rpm。旋转的作用是加速反应。
步骤(5)中所述的重复清洗的次数优选为2次。
步骤(5)中所述的烘干的条件优选为于65～75℃烘干3～6分钟；更优选为于70℃烘干5分钟。
上述试剂盒和方法在微生物DNA提取中的应用，适合超微量微生物DNA的提取。
所述的应用包括科研目的的应用、诊断目的的应用。
所述的微生物包括细菌、真菌。
所述的真菌包括酵母菌、假丝酵母菌。
所述的假丝酵母包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和克柔念珠菌。
所述的细菌包括金黄葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和屎肠球菌。
所述的超微量指的是低至10 2个细胞/mL的菌含量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明适用于大部分微生物的提取，包括大部分细菌的真菌，细菌如：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌等；真菌如：克柔念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌等。
(2)本发明的提取过程使用的试剂无毒、无污染试剂，使用的均为廉价生化试剂。
(3)本发明的提取过程使用的仪器设备均为常用常规的实验室仪器设备。
(4)本发明不需要液氮研磨等繁琐的物理破壁过程，避免交叉污染。
(5)本发明的过程温和，避免DNA损坏，提取效率高。
(6)本发明的提取步骤简捷，无复杂步骤，人工操作易上手。
(7)本发明实现了无试液转移，一支试验管或离心管上完成提取。
(8)本发明相较于市售提取试剂盒需在10 3-10 4左右菌浓度才能提取有效DNA，本发明 提供的方法提取仅需10 2菌浓度就能提取有效DNA，提取灵敏度更高。
(9)本发明可适用于自动化上机，减少人工成本和人为误差。
附图说明
图1是金黄葡萄球菌标准曲线图。
图2是本试剂盒提取得到的金黄色葡萄球菌DNA模板a1和a2的荧光PCR曲线图。
图3是市售试剂盒提取得到的金黄色葡萄球菌DNA模板a3和a4的荧光PCR曲线图。
图4是市售试剂盒提取得到的金黄色葡萄球菌DNA模板a5和a6的荧光PCR曲线图。
图5是光滑念珠菌标准曲线图。
图6是本试剂盒提取得到的光滑念珠菌DNA模板b1和b2的荧光PCR曲线图。
图7是市售试剂盒提取得到的光滑念珠菌DNA模板b3和b4的荧光PCR曲线图。
图8是市售试剂盒提取得到的光滑念珠菌DNA模板b5和b6的荧光PCR曲线图。
图9是本发明提取得到的屎肠球菌DNA模板d1-d7和D1-D7的荧光PCR曲线图。
图10是本发明提取得到的屎肠球菌DNA模板e1-e7和E1-E7的荧光PCR曲线图。
图11是使用本发明预处理液得到的白色念珠菌DNA模板k1、替换处理液后得到的白色念珠菌DNA模板k2和使用生理盐水处理得到的白色念珠菌DNA模板k3，得到的荧光PCR曲线图。
图12是初始光滑念珠菌显微镜下形态和数量图。
图13是处理后光滑念珠菌显微镜下形态和数量图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
试剂配制：
1、配制酶解液：
(1)酶解液的成分和作用如下：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为20mmol/L，其作用是提供缓冲环境，使溶液的pH保持在一定范围内；
乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L，其作用是螯合二价金属离子，可以抑制核酸内切酶的活性；
氯化钠的浓度为0.1mol/L，其作用是该浓度的氯化钠可降低DNA溶解度；
曲拉通X-100的浓度为1％(v/v)，其作用是作为细胞的通透剂，溶解细胞膜上的脂质；
聚乙二醇35000的浓度为5％(w/v)，其作用是沉淀DNA；
海藻糖的浓度为0.1mol/L，其作用为保护试剂；
RNA酶A(60U/mg)的浓度为0.5mg/mL，其作用为除去非特异结合的RNA；溶菌酶(20000U/mg)和蜗牛酶(原浓度10mg/mL)的浓度均为5mg/mL，其作用为溶解各种细胞壁。
(2)酶解液的配制:
称取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris，分子量121.14)、乙二胺四乙酸(EDTA，分子量372.24)、氯化钠(NaCl，分子量58.44)、曲拉通X-100、海藻糖、聚乙二醇35K，溶于适量无菌水中，调节pH值至7.5，121℃高压灭菌后备用；冷却后加入溶菌酶、蜗牛酶和RNA酶，2-8℃保存。
2、配制裂解液
(1)裂解液的成分和作用如下：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为25nmol/L，其作用是提供缓冲环境，使溶液的pH保持在一定范围内；
乙二胺四乙酸的浓度为1nmol/L，其作用是螯合二价金属离子，可以抑制核酸内切酶的活性；
曲拉通X-100的浓度为1％，其作用是作为细胞的通透剂，溶解细胞膜上的脂质；
蛋白酶(20U/mg)的浓度为20mg/mL，其作用是将蛋白质水解生产氨基酸；
氯化钠的浓度为0.8mol/L，该浓度下的氯化钠提供高盐环境使细胞膜破碎使DNA暴露出来。
(2)裂解液的配制：
称取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(分子量121.14)、乙二胺四乙酸(分子量372.24)、氯化钠(分子量58.44)、曲拉通X-100，溶于适量无菌水中，调节pH值至7.5，121℃高压灭菌后备用；冷却后加入蛋白酶，2-8℃保存。
3、配制磁珠提纯液：
市购磁性纳米四氧化三铁，直径为50纳米。其作用是为吸附核酸，进行提纯；称取磁性纳米四氧化三铁，异丙醇稀释至5mg/mL后备用。
4、配制洗脱液
洗脱液为80％(v/v)异丙醇，其作用为洗脱核酸上的杂质。量取异丙醇，无菌水稀释后备用。
5、配制保护液
保护液为TE溶液，配制50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0，其作用是维持溶液酸碱度，保持DNA的稳定性。称取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(分子量121.14)、乙二胺四乙酸(分子量372.24)，溶于适量无菌水中，调节pH值至8.0，121℃高压灭菌后备用。
6、配置预处理液
预处理液为碱性缓冲体系下的皂苷溶液，碱性缓冲体系组成为氢氧化钠-氯化钾。预处理液中氢氧化钠的浓度为0.5mol/L、氯化钾的浓度为0.05mol/L，其作用是液化粘稠的体液样本。
皂苷的浓度为0.5mg/mL，其作用是溶解红细胞，防止大量的红细胞对检测造成影响，同时不会破坏微生物细胞结构。
称取皂苷、氢氧化钠、氯化钾，溶于无菌水中，调节pH13。
菌种选取:
(1)选取真菌：
白色念珠菌(Candida albicans，标准号ATCC10231，供应商编码LWCC2005)；光滑念珠菌(Candida glabrata，标准号ATCC15126，供应商编码LWCC2008)；近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，标准号ATCC22019，供应商编码BNCC263246)；克柔念珠菌(Candida krusei，标准号ATCC6258，供应商编码BNCC185429)。
选取细菌：
金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus，标准号CMCC(B)26003，供应商编码NW2003)、屎肠球菌(Enterococcus faecium，标准号ATCC35667，供应商编码NW2019)。
实施例1：本法与市售的试剂盒进行提取细菌DNA对比实验
1.本发明试剂盒提取细菌DNA
1.1取稀释至5×10 6个/mL的金黄葡萄球菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
1.2加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃、10r/min旋转保温35分钟。
1.3加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃、10r/min旋转保温35分钟。
1.4加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，离心机14000转/分钟离心5分钟，弃上清。
1.5用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
1.6加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀，即得DNA。
1.7做两组试验，得到DNA模板a1和a2。
2.市售天根试剂盒(货号：PD302)提取细菌DNA
2.1取培养至5×10 6个/mL的金黄葡萄球菌悬液1mL，离心机11000转/分钟离心1分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。
2.2向菌体沉淀中加入110μL缓冲液和70μL溶菌酶溶液，37℃处理30min。
2.3向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
2.4加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液变清亮后，简短离心5秒。
2.5加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，简短离心5秒。
2.6将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000转/分钟离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
2.7向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000转/分钟离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
2.8向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000转/分钟离心30esc，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
2.9重复操作步骤2.8。
2.10将吸附柱CB3放回收集管中，12000转/分钟离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置8分钟。
2.11将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000转/分钟离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.12做两组试验，得DNA模板a3和a4。
3.市售omega试剂盒(货号：PD3350)提取细菌DNA
3.1取培养至5×10 6个/mL的金黄葡萄球菌悬液1mL，离心机4000转/分钟离心10分钟，倒去上清。
3.2加入100μL的TE缓冲液，涡旋振荡使沉淀悬浮，在37℃下保温10分钟。
3.3加入100μL BTL缓冲液和20μL蛋白酶K溶液，涡旋振荡混合。
3.4在水浴箱中水浴55℃20分钟，短暂涡旋振荡后在水浴20分钟。
3.5加入5μL RNase A，翻转多次混合，在室温下孵育5分钟。
3.6以10000转/分钟离心2分钟，将上清液转移到一个新的1.5mL微离心管中。
3.7加入220μL的BDL缓冲液，涡旋混合，在65℃下孵育10分钟。
3.8加入220μL乙醇，涡旋振荡混合。
3.9将离吸附柱插入到一个2mL的收集管中，将整个样品转移到吸附柱中，10000转/分钟离心1分钟，弃去滤液和收集管，将吸附柱插入一个新的2mL收集管中。
3.10加入500μL HBC缓冲液，以10000转/分钟离心1分钟，弃去滤液，重新使用收集管。
3.11加入700μL的DNA洗涤缓冲液，以10000转离心1分钟，弃去滤液，重新使用收集管。
3.12重复3.11步骤。
3.13将吸附柱和收集管用12000转/分钟离心，烘干2分钟。
3.14将吸附柱插入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入100μL洗脱缓冲液，在室温下静置5分钟后10000转/分钟离心1分钟。
3.15重复3.14步骤。
3.16做两组试验，得DNA模板a5和a6。
4.荧光PCR扩增
4.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
4.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、引物F1(0.2mmol/L)2μL、引物R1(0.2mmol/L)2μL，DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
4.3以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增的引物信息(例)：
引物F1：5’-GAAGCTTGCTTCTCTGATGTT-3’；
引物R1：5’-CAGCAAGACCGTCTTTCACT-3’。
4.4 PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 15s、55℃ 30s、72℃ 15s，40个循环。
4.5以a1-a6的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其CT值。
4.6由标准曲线各浓度CT值得金黄葡萄球菌标准曲线公式y＝-3.4757x+33.931，计算提取效率。
表1：标准曲线与对比试剂盒金黄葡萄球菌扩增曲线CT值和提取效率
Figure PCTCN2022136171-appb-000001
Figure PCTCN2022136171-appb-000002
5.结果分析：
根据表1数据，本发明提供的方法提取细菌DNA效率均高于其他试剂盒。
实施例2：本法与市售的试剂盒进行提取真菌DNA对比实验
1.本发明试剂盒提取真菌DNA
1.1取稀释至5×10 6个/mL的光滑念珠菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
1.2加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃10r/min旋转保温35分钟。
1.3加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃10r/min旋转保温35分钟。
1.4加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，弃上清。
1.5用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
1.6加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀后，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀。即得DNA。
1.7做两组试验，得DNA模板b1和b2。
2.市售天根试剂盒(货号：PD307)提取真菌DNA
2.1取稀释至5×10 6个/mL的光滑念珠菌悬液1mL，离心机12000转/分钟离心1分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。
2.2向菌体沉淀中加入600μL山梨醇缓冲液和50U溶壁酶(Lyticase)，充分混匀。30℃处理30min。4000转/分钟离心10分钟，弃上清液，收集沉淀。
2.3向沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀。
2.4加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
2.5加入220μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后短暂离心5秒。
2.6加入220μL无水乙醇，充分颠倒混匀，短暂离心5秒。
2.7将上一步所得溶液都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000转/分钟离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
2.7向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000转/分钟离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
2.8向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000转/分钟离心30esc，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
2.9重复操作步骤2.8。
2.10将吸附柱CB3放回收集管中，12000转/分钟离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置8分钟。
2.11将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000转/分钟离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.12做两组试验，得DNA模板b3和b4。
3.市售omega试剂盒(货号：PD3370)提取真菌DNA
3.1取稀释至5×10 6个/mL的光滑念珠菌悬液1mL，离心机4000转/分钟离心10分钟，倒去上清。
3.2加入480μL的SE缓冲液、10μL 2-羟基乙醇和20μL裂解酶溶液，重悬菌液，30℃孵育保温30分钟。
3.3在室温下4000转/分钟离心5分钟。
3.4在样品中加入200μL缓冲液YL和50mg玻璃珠(0.4-0.6mm)，快速旋转混匀5分钟，将上清液转移到一个新的1.5mL离心管中。
3.5加入25μL蛋白酶K溶液，涡旋混合均匀，在65℃的振荡水浴中培养30分钟。
3.6加入5μL RNase A，翻转多次混合，在室温下孵育10分钟。
3.6以10000转/分钟离心5分钟，将上清液转移到一个新的的1.5mL微离心管中。
3.7加入220μL的YDL缓冲液和220μL无水乙醇，快速旋转混合20秒。
3.8将吸附柱插入到一个2mL的收集管中，将整个样品转移到吸附柱中，10000转/分钟离心1分钟，弃去滤液和收集管，将吸附柱插入一个新的2mL收集管中。
3.9加入500μL HB缓冲液，以10000转/分钟离心1分钟，弃去滤液，重新使用收集管。
3.10加入700μL的DNA洗涤缓冲液，以10000转离心1分钟，弃去滤液，重新使用收集管。
3.11重复3.10步骤。
3.13将吸附柱和收集管用12000转/分钟离心，烘干2分钟。
3.14将吸附柱插入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入100μL洗脱缓冲液，在室温下静置5分钟后10000转/分钟离心1分钟。
3.15重复3.14步骤。
3.16做两组试验，得DNA模板b5和b6。
4.荧光PCR扩增
4.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
4.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、引物F2(0.2mmol/L)2μL、引物R2(0.2mmol/L)2μL、DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
4.3以光滑念珠球菌DNA为模板PCR扩增的引物信息：
引物F2：5’-CGATTTTTTCGTGTACTGGAATG-3’；
引物R2：5’-CGCCAAGCCACAAGGACTT-3’。
4.4 PCR反应程序：94℃5min；94℃15s、55℃30s、72℃15s，40个循环。
4.5以b1-b6的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其CT值。
4.6由标准曲线各浓度CT值得光滑念珠菌标准曲线公式y＝-3.3977x+29.992，计算提取效率。
表2：标准曲线与对比试剂盒光滑念珠菌扩增曲线CT值和提取效率
Figure PCTCN2022136171-appb-000003
Figure PCTCN2022136171-appb-000004
5.结果分析：
根据表2数据本发明提供的方法提取真菌DNA效率均高于其他试剂盒。
实施例3：本法提取细菌DNA，做浓度梯度试验。
1.取稀释至10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8个/mL的屎肠球菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
2.加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃、10r/min旋转保温35分钟。
3.加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃、10r/min旋转保温35分钟。
4.加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，弃上清。
5.用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
6.加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀后，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀。即得DNA。
7.做2组试验，得DNA模板d1～d7和重复组D1～D7。
8.荧光PCR扩增
8.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
8.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、引物F3(0.2mmol/L)2μL、引物R3(0.2mmol/L)2μL、DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
8.3以屎肠球菌DNA为模板PCR扩增的引物信息：
引物F3：5’-CGAACGCTTCTTTTTCCACC-3’；
引物R3：5’-CTTTCAAATCAAAACCATGCGGTT-3’。
8.4 PCR反应程序：94℃5min；94℃15s、55℃30s、72℃15s，40个循环。
8.5以d1-d7和D1-D7的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其CT值。
表3:不同浓度的屎肠球菌扩增曲线CT值
名称 编码 浓度 CT值 编码 浓度 CT值
屎肠球菌 d1 10 8 12.064 D1 10 8 12.728
屎肠球菌 d2 10 7 16.145 D2 10 7 15.540
屎肠球菌 d3 10 6 20.835 D3 10 6 21.605
屎肠球菌 c4 10 5 25.224 D4 10 5 25.465
屎肠球菌 d5 10 4 26.840 D5 10 4 26.651
屎肠球菌 d6 10 3 27.927 D6 10 3 27.113
屎肠球菌 d7 10 2 29.956 D7 10 2 29.881
屎肠球菌-阴性   - -   -  
9.结果分析
结果如图9所示，所得CT值制成表3，随着细菌-屎肠球菌液浓度降低，CT值呈比例升高，且在低浓度下仍有扩增表现，即本发明提供的方法在样本低浓度下仍然有提取效果。
实施例4：本法提取真菌DNA，做浓度梯度试验。
1.取稀释至10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8个/mL的耳念珠菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
2.加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃10r/min旋转保温35分钟。
3.加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃10r/min旋转保温35分钟。
4.加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，弃上清。
5.用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
6.加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀后，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀。即得DNA。
7.做2组试验，得DNA模板e1～e7和重复组E1～E7。
8.荧光PCR扩增
8.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
8.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、引物F4(0.2mmol/L)2μL、引物R4(0.2mmol/L)2μL、DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
8.3以耳念珠菌DNA为模板PCR扩增的引物信息：
引物F4：5’-GTACTTCCATATCCAAGACCTTT-3’；
引物R4：5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’。
8.4 PCR反应程序：94℃5min；94℃15s、55℃30s、72℃15s，40个循环。
8.5以e1-e7和E1-E7的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其CT值。
表4：不同浓度的耳念珠菌扩增曲线CT值
Figure PCTCN2022136171-appb-000005
Figure PCTCN2022136171-appb-000006
9.结果分析
结果如图10所示，所得CT值制成表4，随着真菌-耳念珠菌液浓度降低，CT值呈比例升高，且在低浓度下仍有扩增表现，即本发明提供的方法在样本低浓度下仍然有提取效果。
实施例5：酶解液组分增减后对比实验。
1.选克柔念珠菌、近平滑念珠菌和白色念珠菌，避免组分减少降低提取效率而导致无数据体现的情况，把菌液均稀释至中高浓度10 8、10 6、10 4个/mL，取悬液1mL。加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
2.1加入100μL的酶解液(含RNA酶A 0.2mg/mL、溶菌酶5mg/mL和蜗牛酶5mg/mL)，涡旋振荡混匀，放置37℃10r/min旋转保温35分钟。
2.2对照组加入100μL无溶菌酶和RNA酶A的酶解液(即仅含蜗牛酶10.2mg/mL)，涡旋振荡混匀，放置37℃10r/min旋转保温35分钟。
3.加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃10r/min旋转保温35分钟。
4.加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，弃上清。
5.用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
6.加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，除去沉淀后，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀。
7.做2组试验，得克柔念珠菌DNA模板f1～f3、重复组F1～F3、对照组f4～f6、对照组重复F4～F6；近平滑念珠菌DNA模板g1～g3、重复组G1～G3、对照组g4～g6、对照组重复G4～G6；白色念珠菌模板i1～i3、重复组I1～I3、对照组i4～i6、对照组重复I4～I6。
8.荧光PCR扩增
8.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
8.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、上游引物(0.2mmol/L)2μL、下游引物(0.2mmol/L)2μL、DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
8.3以克柔念珠菌、近平滑念珠菌、白色念珠菌DNA为模板PCR扩增的引物信息：
克柔念珠菌：
引物F5：5’-GGACGGTCTACCTATGGTAA-3’；
引物R5：5’-ACTCTAATTTCCTCAAAGTAATCGT-3’。
近平滑念珠菌：
引物F6：5’-CCTTCTGGCTAGCCTTTTTG-3’；
引物R4：5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’。
白色念珠菌：
引物F7：5’-TTCCTTCTGGGTAGCCATTT-3’；
引物R4：5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’。
8.4 PCR反应程序：94℃5min；94℃15s、55℃30s、72℃15s，40个循环。
8.5以克柔念珠菌、近平滑念珠菌、白色念珠菌的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其 CT值。
表5:全组分和仅含蜗牛酶扩增曲线CT值和提取效率对比表
Figure PCTCN2022136171-appb-000007
9.结果分析
实验结果如表5所示，使用全组分酶解液后提取效率均高于仅含蜗牛酶。因此，本发明提供的方法所使用的酶解液经调配是最适比例，如果减少本发明提供的方法中其他试剂组分，同样将影响提取效率。
实施例6：预处理液替换后对比实验。
1.1取用健康人血液稀释至5×10 6个/mL的白色念珠菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
1.2对照组k2取用血液稀释至5×10 6个/mL的白色念珠菌悬液1mL，加入等量0.5％(w/v)SDS+1％(v/v)Triton X-100+0.5M NaCl混合液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
1.3对照组k3取用血液稀释至5×10 6个/mL的白色念珠菌悬液1mL，加入等量生理盐水37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残 留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
2.加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃10r/min旋转保温35分钟。
3.加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃10r/min旋转保温35分钟。
4.1加入350μL的磁珠提纯液，涡旋混匀，室温10r/min旋转10分钟，弃上清。
5.用1mL的洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清，重复步骤清洗沉淀2次。沉淀置于70℃烘干5分钟。
6.加入30μL的保护液，涡旋振荡混匀，除去沉淀后，置于70℃处理5分钟，涡旋振荡10-20秒混匀。得白色念珠菌DNA模板k1、对照组k2、对照组k3。
8.荧光PCR扩增
8.1设备：天隆Gentier 48E全自动PCR分析系统
8.2扩增反应体系为：SYBR Green qPCR mix 12.5μL、上游引物(0.2mmol/L)2μL、下游引物(0.2mmol/L)2μL、DNA模板1μL、灭菌水3.5μL。
8.3以白色念珠菌DNA为模板PCR扩增的引物信息：
白色念珠菌：
引物F7：5’-TTCCTTCTGGGTAGCCATTT-3’；
引物R4：5’-GCCTGCTTTGAACACTCT-3’。
8.4 PCR反应程序：94℃5min；94℃15s、55℃30s、72℃15s，40个循环。
8.5以白色念珠菌的DNA模板进行荧光PCR扩增并记录其CT值。
表6:预处理液替换后对比实验扩增曲线CT值对比表
Figure PCTCN2022136171-appb-000008
9.结果分析
实验结果如表6所示和图11所示，使用本发明的预处理液明显有较好的效果。
实施例7：经酶解液和裂解液处理后，菌形态和数量变化
1.培养光滑念珠菌的菌液，适当稀释后，使用显微镜观察菌体原始形态和数量。
2.取上述菌悬液1mL，加入等量预处理液37℃反应10min，离心机14000转/分钟离心2分钟，收集菌体至管底，倒去上清，尽量吸干可见残留液体。沉淀置于65℃烘干5分钟。
3.加入100μL的酶解液，涡旋振荡混匀，放置37℃、10r/min旋转保温35分钟。
4.加入250μL的裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，放置70℃、10r/min旋转保温35分钟。
5.再取上述处理后的菌液，使用显微镜观察菌体形态和数量。
6.结果分析
实验结果如图12和图13所示，经处理后存在细胞结构的光滑念珠菌，数量有明显的减少，存在有细胞破裂后的组织结构。因此，本发明提供的方法能有效的对微生物进行破壁和裂解作用，并不影响后续提取核酸的效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

  1. 一种具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：包括预处理液、酶解液、裂解液、磁珠提纯液、洗脱液和保护液；其中：
    预处理液的组成如下：皂苷0.1～1mg/mL、氢氧化钠0.2～1mol/L、氯化钾0.05～0.1mol/L，pH 11～13；
    酶解液的组成如下：Tris 10～30mmol/L、EDTA 0.2～2mmol/L、NaCl 0.01～0.15mol/L、曲拉通X-100 0.1～3％(v/v)、聚乙二醇35000 1～8％(w/v)、海藻糖0.1～1mol/L、RNA酶A 0.1～0.5mg/mL、溶菌酶1～10mg/mL、蜗牛酶1～10mg/mL，pH6.0～8.0；
    裂解液的组成如下：Tris 10～30mmol/L、EDTA 0.2～2nmol/L、曲拉通X-100 0.1～3％(v/v)、氯化钠0.5～1mol/L、蛋白酶10～30mg/mL，pH6.0～8.0；
    磁珠提纯液的组成如下：磁性纳米四氧化三铁4～6mg/mL，溶剂为异丙醇；
    洗脱液为浓度是75～85％(v/v)的异丙醇；
    保护液为TE溶液。
  2. 根据权利要求1所述的具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：所述的预处理液的组成如下：皂苷0.5mg/mL、氢氧化钠0.5mol/L、氯化钾0.05mol/L，pH 13；
    所述的酶解液的组成如下：Tris 20mmol/L、EDTA 1mmol/L、NaCl 0.1mol/L、曲拉通X-100 1％(v/v)、聚乙二醇35000 5％(w/v)、海藻糖0.5mol/L、RNA酶A 0.2mg/mL、溶菌酶5mg/mL、蜗牛酶5mg/mL，pH7.5；
    裂解液的组成如下：Tris 25nmol/L、EDTA 1nmol/L、曲拉通X-100 1％(v/v)、氯化钠0.8mol/L、蛋白酶20mg/mL，pH7.5；
    磁珠提纯液的组成如下：磁性纳米四氧化三铁5mg/mL，溶剂为异丙醇；
    洗脱液为浓度是80％(v/v)的异丙醇。
  3. 根据权利要求1或2所述的具有普适性的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于：
    所述的RNA酶A为60U/mg的RNA酶A；
    所述的溶菌酶为2000U/mg的溶菌酶；
    所述的蜗牛酶为10mg/mL的蜗牛酶；
    所述的蛋白酶为20U/mg的蛋白酶；
    所述的四氧化三铁颗粒是直径为30～60纳米的磁性四氧化三铁颗粒。
  4. 一种具有普适性的的提取微生物DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
    (1)取1～5mL的样品，加入等量预处理液反应，离心，倒去上清，尽量吸干可见残留液体；得到的沉淀烘干；
    (2)加入100μL酶解液，涡旋振荡混匀，进行酶解反应；
    (3)加入250μL裂解液，涡旋振荡混匀沉淀，进行裂解反应；
    (4)加入350μL磁珠提纯液，涡旋混匀，进行吸附反应，反应后弃上清；
    (5)用1mL洗脱液，涡旋震荡清洗沉淀，弃上清；重复清洗沉淀，将所得沉淀烘干；
    (6)加入30μL保护液，涡旋振荡混匀，吸取上清，除去沉淀，即得到微生物DNA。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
    步骤(1)中所述的反应的条件为36～38℃反应5～15min；
    步骤(1)中所述的离心的条件为10000～15000rpm离心1～5min；
    步骤(1)中所述的烘干的条件为于65～75℃烘干3～6分钟；
    步骤(2)中所述的酶解反应的条件为36～38℃反应30～40min；
    步骤(3)中所述的裂解反应的条件为68～72℃反应30～40min；
    步骤(4)中所述的吸附反应的条件为室温反应8～12分钟。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
    步骤(1)中所述的反应的条件为37℃反应10分钟；
    步骤(1)中所述的离心的条件为14000rpm离心2分钟；
    步骤(1)中所述的离心的条件为14000rpm离心2分钟；
    步骤(2)中所述的酶解反应的条件为37℃反应5分钟；
    步骤(3)中所述的裂解反应的条件为70℃反应35分钟；
    步骤(4)中所述的吸附反应的条件为室温反应10分钟。
  7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
    步骤(5)中所述的烘干的条件为于65～75℃烘干3～6分钟。
  8. 权利要求1～3任一项所述的试剂盒或权利要求4～7任一项所述的方法在微生物DNA提取中的应用。
  9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的微生物包括细菌和真菌。
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