CN110283816A - 一种磁珠法微生物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、Triton X‑100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，裂解吸附液包括Tris‑HCl、氯化钠、EDTA、TrionX‑100以及核酸分离吸收促进剂；加强洗涤液包括Tris‑HCl、氯化锂和乙醇。采用本发明的试剂盒能够彻底破坏革兰氏阳性细菌和各种真菌的细胞壁，形成原生质体，在裂解吸附液的作用下迅速释放原生质体细胞DNA，并高效地吸附在硅胶磁珠上，经洗涤液洗涤并用洗脱液洗脱后，得到高浓度和纯度的微生物DNA。

Description

一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，具体涉及一种高效提取各种样本中不同微生物(包括革兰氏阳性细菌和各种真菌)基因组DNA的硅胶磁珠提取试剂盒及方法属于生物技术领域。

背景技术

宏基因组学是当今世界科研最热门的研究领域之一。宏基因组是以样品中的微生物群体基因组为研究对象，以高通量测序为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系，以及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。传统的微生物学研究是建立在分离培养基础上的，但是现有的培养技术只能分离培养极少数已知的微生物。采用研究方法在微生物与疾病的关系上已很难有所突破，极大地限制了人们对微生物与疾病关系的认识，因此，宏基因组在医学上的应用也就越来越重要。宏基因组学在医学上的应用主要表现在：发现新的致病微生物；微生物群体多样性与疾病关系；微生物之间协作的致病机理；从微生物中发现有医学应用价值的生物活性物质(比如酶及抗生素等)；不可培养微生物耐药情况及其在耐药传播机制中的作用等。宏基因组学避免了传统微生物学研究的限制，为充分认识和利用微生物提供了可能，为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇。

宏基因组学包括从样本中提取微生物基因组DNA、高通量测序分析和生物信息分析等工作。其前端关键性技术是微生物基因组DNA的提取，DNA提取方法的精确程度将直接决定微生物信息的精确度。运用现有的提取技术能够提取多少类型的微生物基因组，是否了导致“基因遗漏”的发生，这些我们仍然不清楚。

临床微生物主要包括：病毒、支原体、衣原体、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌，由于病毒、支原体、衣原体和革兰氏阴性细菌没有或者只有极薄的细胞壁，因此这些微生物基因组DNA的提取没有任何难度。而革兰氏阳性细菌和真菌含有较厚的细胞壁，细胞壁主要成分为多糖、蛋白质和脂类组成，这两类微生物基因组的提取首先必须完全破坏细胞壁，才能使基因组DNA充分释放。其中革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖主要由β-1.4糖苷键组成，能被溶菌酶水解；真菌细胞壁中的肽聚糖主要由β-1.3和β-1.6糖苷键组成，能被溶壁酶水解。相对革兰氏阳性细菌来说，真菌的细胞壁厚约100-250nm，更厚更复杂，水解难度更高。

目前微生物基因组DNA提取的技术壁垒主要是在同时破坏不同微生物的细胞壁这一关键环节。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、玻璃珠破壁法、酶解法和氯化苄法等。通常液氮研磨法一般是直接在液氮中研磨；玻璃珠机械破壁法则加入石英砂、玻璃珠等来帮助破壁；氯化苄法是利用氯化苄、尿素来溶解细胞壁。此外，还有用超声波辅助破壁的方法，以及使用高速匀浆器破壁的方法。但以上这些方法有一定的缺点：1、致病微生物污染环境和感染工作人员的风险；2、细胞壁破坏不完全，基因组释放不充分，导致“基因遗漏”的发生；3、有毒害物质(氯化苄)对环境和工作人员的危害；4、液氮容易造成冻伤且不易获得。

目前能够同时提取各种微生物包括真菌基因组DNA的产品主要为美国MoBioPowerSoil微生物提取试剂盒和Omega Fungal DNA提取试剂盒，由于其在微生物基因组DNA提取领域具有非常大的垄断性，因此价格十分昂贵。虽然价格昂贵，但是提取效果并不理想，而且提取试剂中含有有毒物质，对人员和环境容易造成危害。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，提高了微生物基因组DNA的提取效率，且能够满足同时提取各种样本中不同微生物基因组DNA的目的。

本发明采用如下技术方案：一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，还包括溶菌剂II、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂II包括2-吗啉代乙磺酸(2--Morpholinoethanesulfonicacid，MES)、EDTA、Triton X-100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris-HCl、氯化钠、EDTA、TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris-HCl、氯化锂和乙醇。

进一步的，所述溶菌剂II为10-500mM的MES，1-100mM的溶壁酶增强剂，5-150mM的EDTA，0.01％-5％的Triton X-100和0.1-10％的溶壁酶，所述溶菌剂II的pH5.5-8.0。

进一步的，所述溶壁酶增强剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

进一步的，所述裂解吸附液包括：10-100mM Tris-HCl，0.5-1.5M氯化钠，1-20mMEDTA，0.1％-5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为6.0-9.0。

进一步的，所述核酸分离吸附促进剂包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲。

进一步的，所述加强洗涤液中包括10-100mM Tris-HCl、0.5-2M氯化锂和50-70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH6.5-7.5。

采用权利要求1所述的一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒的提取方法：包括如下步骤：

(1)将各种样本如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌放入微生物保存缓冲液中，充分混匀后离心，保留沉淀；

(2)向沉淀中加入50-200μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为10-60s，孵育处理时间为10-60min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；

(3)向混合物Ⅰ中加入50-200μL的溶菌液II，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为10-60s，孵育处理时长为10-60min，使真菌细胞壁水解，得到混合物II；

(4)向混合物II中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物II与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：100-300：200-600：5-20，使原生质体(细胞)DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，所述振荡速度为500-1500rpm，所述孵育处理温度为55-70℃，孵育处理时间为5-30min；

(5)向混合物Ⅲ中加入异丙醇和硅胶磁珠进行振荡混匀，异丙醇的加入量与裂解吸附液的比例按照体积份数比为0.4-1.5：1，加入硅胶磁珠的量为5-20μL，使混合物Ⅲ中释放的DNA高效地吸附在硅胶磁珠上，所述振荡速度1500-3000rpm，所述孵育处理温度为15-30℃，所述孵育处理时长为1-10min；

(6)吸附完成后，使用磁力架分离磁珠，磁力架吸附硅胶磁珠的时长为3-10min或至液体清澈，再依次使用洗涤液I和80％乙醇水溶液对硅胶磁珠分别进行洗涤后分离，洗涤液I使用量为0.5-1mL，对洗涤分离后的硅胶磁珠进行烘干，烘干温度为37-60℃，烘干时长为1-5min，得到去除杂质的含有原生质体(细胞)基因组DNA的硅胶磁珠；

(7)利用洗脱液对硅胶磁珠进行振荡孵育洗脱，洗脱液的使用量为50-200μL，洗脱温度为37-60℃，振荡速度为500rpm-1500rpm，弃去磁力架分离的硅胶磁珠，收集洗脱液，得到基因组DNA。

溶菌剂II中各组分的功能和作用：

(1)MES能够提供pH5.5-6.7之间的稳定环境，细胞壁在酸性环境下不稳定，容易水解，而在此环境下溶壁酶能够保持较高活性。

(2)溶壁酶能够水解真菌细胞壁中的β-1.3糖苷键，对真菌有较好的脱壁效果，最适pH为5-6，一般工作浓度为1-2％。

(3)TCEP、DTT和beta-巯基乙醇均为一种还原剂，能将-SH基保持在还原态，常用于还原蛋白和多肽中的二硫键，更普遍用于防止蛋白半胱氨酸残基形成分子内和分子间的二硫键。对一些隐藏的二硫键(如细胞膜中的蛋白)，beta-巯基乙醇、DTT和TCEP可借助蛋白变性剂来还原二硫键，如高温、盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、SDS或硫脲。在三种还原剂中，TCEP还原能力最强，DTT其次，beta-巯基乙醇最差。与β-巯基乙醇和DTT相比，TCEP的刺激性和毒性都处于安全水平，在pH2.5-11的范围内TCEP均具有很好的稳定性。

本发明溶菌液II中TCEP、DTT或beta-巯基乙醇的作用在于：

(1)破坏细胞壁中蛋白质的二硫键，破坏细胞间连丝，使细胞壁结构不稳定；(2)溶菌液II中溶壁酶的活性需要-SH基保持还原态，TCEP、DTT或beta-巯基乙醇能够保持或增强溶壁酶的活性，细胞壁的水解效果更好；

(3)溶菌液Ⅰ中溶菌酶的活性依赖分子间二硫键维持，在溶菌液Ⅰ之后加入溶菌液II是为了避免TCEP破坏溶菌酶的分子间二硫键，从而影响酶的活性。

(4)TritonX-100能够溶解细胞壁中的脂类成分，破坏细胞壁的稳定性。

(5)EDTA作为螯合剂用于螯合二价金属离子，由于核酸内切酶的活性需要Mg2+，因此EDTA可以抑制核酸内切酶活性，达到保护核酸防止DNA降解的目的。

裂解吸附液中各组分的功能和作用：

(1)Tris-HCl能够提供pH6.5-9.0稳定的缓冲液，使核酸磷酸基团与磁珠表面的硅胶处于带电性状态，利于氢键的形成；

(2)十二烷基硫酸三乙醇胺是一种较强的表面活性剂，能够迅速溶解蛋白质，促使核酸与蛋白质分离，释放大量的核酸；

(3)硫脲能增加变性蛋白质的溶解性，与十二烷基硫酸三乙醇胺一起保证了变性蛋白处于溶解状态；

(4)异硫氰酸胍能够提供高盐环境，在十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲的共同作用下使蛋白质和核酸变性，促进核酸与蛋白质彻底快速分离；另外，异硫氰酸胍使变性核酸表现出更高的热动力学稳定性，促使核酸的磷酸基团与硅胶表面的硅烷醇基团之间更容易形成氢键，利于核酸吸附于磁珠的硅胶表面；

氯化钠为核酸的磷酸基团与硅烷醇基团之间的阳离子桥提供Na+离子，进一步加强核酸与磁珠表面硅胶的吸附作用；另外，异硫氰酸胍能灭活核酸内切酶，避免核酸被水解，从而保持核酸处于受保护状态；由于核酸内切酶的活性需要Mg2+，因此本申请加入EDTA，用于螯合二价金属离子，从而进一步抑制核酸内切酶活性，完全达到保护核酸的目的；

(5)TritonX-100可以溶解脂质，防止脂质对核酸吸附的干扰，同时具有促进氢键形成的作用。因此，本申请使用的裂解吸附液不但可以溶解蛋白质和脂质，还利用异硫氰酸胍和EDTA抑制核酸内切酶活性从而保护核酸不被裂解，同时利用Tris-HCl、TritonX-100和异硫氰酸胍提供的高盐环境促进核酸与硅胶之间氢键的形成。

加强洗涤剂中各组分的功能和作用：

(1)Tris-HCl能够提供pH6.5-9.0稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利于氢键的保持；

(2)氯化锂提供高盐环境，保持已形成的氢键；

(3)乙醇能够保持核酸在硅胶膜表面的沉淀状态，使其与硅胶形成的氢键更牢固；

因此，本发明所使用洗涤液I通过维持核酸与硅胶之间的氢键使核酸稳定地固定在硅胶吸附膜上，在洗涤掉非特异性结合蛋白的同时保证已吸附的核酸不被洗掉

本发明的有益效果：1、本发明中溶菌液II中含有溶壁酶增强剂，在溶菌液Ⅰ的配合下，能够彻底水解革兰氏阳性细菌和各种真菌的细胞壁，产生原生质体；在含有核酸分离吸附促进剂的裂解吸附液和在其他试剂的配合下，原生质体或者细胞迅速裂解，促进蛋白质与DNA分离，并且保持蛋白质处于溶解状态，彻底地释放出基因组DNA，在核酸裂解吸附液的作用下，释放出的基因组DNA与磁珠表面的硅胶高效地吸附在硅胶磁珠上；洗涤液I去除非特异性结合在硅胶磁珠上的蛋白，80％乙醇去除硅胶磁珠上残留的胍、氯化钠等盐离子，确保了提取的基因组DNA纯度和浓度；

2、采用本发明的试剂盒提取的微生物基因组DNA质量好、提取效率高、操作简单，成本低，根据实验结果数据表明，本发明方法提取的微生物DNA浓度远远高于Omega产品；

3、本发明的试剂盒提取的微生物基因组DNA可广泛应用于微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及微生物与环境和疾病之间的关系的研究；在考古学和大中小学的生物试验领域也有应用，因此具有广泛的应用前景和巨大的市场推广价值。

4、微生物污染和工作人员感染的风险较小，不含毒害物质，对环境和工作人员无危害。

附图说明

图1为本发明提取的培养物中细菌基因组DNA结果。Lane1：Mark；Lane2：大肠杆菌；Lane3：产单核李斯特菌；Lane4：肺炎克雷伯菌；Lane5：铜绿假单胞菌；Lane6：无乳链球菌；Lane7：金黄色葡萄菌。

图2为本发明提取的阴道拭子中基因组DNA结果；Lane1：Mark；Lane2：样本1；Lane2：样本2；

图3为本发明提取的培养物中假丝酵母菌基因组DNA结果与Omega方法的比较；Lane1：Mark；Lane2：空白对照；Lane3-6：Omega提取的假丝酵母菌基因组DNA，从左到右分别为：近平滑假丝酵母菌光滑假丝酵母菌；热带假丝酵母菌；白念假丝酵母菌。Lane7-10：本发明提取的假丝酵母菌基因组DNA，从左到右分别为：近平滑假丝酵母菌光滑假丝酵母菌；热带假丝酵母菌；白念假丝酵母菌。

图4为本发明提取的阴道拭子基因组DNA中阴道加德纳菌和阿托波菌的qPCR结果。A：阴道加德纳菌；B：阿托波菌。

图5为本发明提取的阴道拭子基因组DNA中微生物拷贝数NGS结果与华大公司乳酸杆菌的NGS结果图；

图6为本发明提取的阴道拭子基因组DNA中微生物拷贝数NGS结果与华大公司革兰氏阳性菌的NGS结果；

图7为本发明提取的阴道拭子基因组DNA中微生物拷贝数NGS结果与华大公司真菌及病毒的NGS结果。

具体实施方式

本发明中所使用的溶壁酶外购于北京索莱宝科技有限公司，异硫氰酸胍、硫脲、TrionX-100、氯化锂、TCEP、MES、EDTA、Triton X-100、MES、异丙醇、乙醇和溶菌酶等均外购于上海生物工程有限公司，150nm硅胶磁珠外购于苏州为度生物技术有限公司，蛋白酶K干粉外购于上海雅心生物技术有限公司，本发明实施案例中的微生物来自无锡第二人民医院微生物室，并经梅里埃质谱鉴定确认。

2×qPCR Buffer购自江苏昱安生物技术有限公司，引物和探针由上海生物工程有限公司合成。

实施例中涉及的实验材料：

1)引物和探针

为了验证本发明提取微生物基因组的效率，发明人设计了阴道拭子中阴道加德纳菌和阿托波菌的qPCR检测程序。阴道加德纳菌的引物及探针序列如下所示：

上游引物：5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3'

下游引物：5'-AGTTGGCGAAAAGATTGCTG5'-

探针序列：5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3'，其5'端带有6-FAM基团，3'端带有基团BHQ1基团。

阿托波菌的引物及探针序列如下所示：

上游引物：5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3'

下游引物：5'-TGAAATGCGCAGATATTTGG-5'-

探针序列：5'-CAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGAA-3'，其5'端带有6-FAM基团，3'端带有基团BHQ1基团。

实施例1：依次配制本发明试剂盒中的各个试剂：

溶菌剂II：采用常规配制方法配制50mM MES，以50mM MES为溶剂溶解相当于0.1M的TCEP、20mM的EDTA、1％的TrionX-100和1％的溶壁酶。调节pH至6.0后即得溶菌液II。

裂解吸附液：采用常规配制方法配制50mM Tris-HCl，以50mM Tris-HCl为溶剂溶解相当于4M的异硫氰酸胍、1M的氯化钠，5mM的EDTA，1％的TrionX-100，2％的十二烷基硫酸三乙醇胺和1M的硫脲，调节pH至8.5后即得裂解吸附液。

加强洗涤液：采用常规配制方法配制50mM Tris-HCl，以50mM Tris-HCl为溶剂溶解相当于1M的氯化锂，60％的乙醇，调节pH至6.5后即得加强洗涤液。

微生物保存缓冲液：10mM Tris-HCL，100mM NaCL，5％甘油，pH7.5。

溶菌液Ⅰ：10mM Tris-HCL，2mM EDTA，1％的溶菌酶，1％Triton X-100，pH7.0。

蛋白酶K溶液：10mmol/L Tris-HCl，40mg/mL蛋白酶K，50％甘油，pH＝7.5。

实施例2：培养微生物的DNA提取

利用实施例1中所述的试剂盒进行提取。

(1)样本的处理：

用接种环刮取一定量的微生物(包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌)，加入1mL微生物保存缓冲液中，充分混匀后，12,000rpm离心2分钟，弃上清，保留沉淀。

(2)细胞壁的水解

2.1在沉淀中加入100μL的溶菌液Ⅰ，闭盖，35℃1500rpm振荡孵育30分钟，得到混合液Ⅰ，

2.2加入100μL的溶菌液II，闭盖，35℃1500rpm振荡孵育30分钟，得到混合液II。

(3)裂解

在混合液II中加入400μL裂解吸附液和10μL蛋白酶K，闭盖，60℃1500rpm振荡孵育10分钟，得到混合物Ⅲ；

(4)DNA的吸附

在混合物Ⅲ中加入异丙醇400μL和10μL混匀的磁珠，闭盖，室温15-30℃条件下3000rpm振荡2min；

(5)洗涤

DNA吸附完成后，将样品放于磁力架上，吸附磁珠直至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠，再加入600μL洗涤液I，充分混匀使磁珠完全分散至洗涤液I中，将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠。加入600μL 80％乙醇，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中，将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠，重复600μL 80％乙醇洗涤1次，开盖，50℃晾干3分钟；

(6)DNA的洗脱

向晾干的磁珠中加入50μL加强洗脱液，充分吹打混匀磁珠，50℃1500rpm振荡孵育3min，

吸附DNA的磁珠在低盐高pH值情况下释放DNA，本发明使用的洗脱液pH8.5不含盐离子，保证了DNA完全释放。加入洗脱液的量必须完全覆盖磁珠，同时又能保证洗脱后的DNA达到一定浓度，因此优选洗脱液的使用量为50μL。

以不同微生物的培养物为样本，采用本发明方法提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳基因组DNA，凝胶成像系统拍照，电泳结果如图1所示。根据图1所示的电泳图可知，琼脂糖凝胶电泳中出现明显的基因组DNA条带，表明本发明方法提取对不同微生物基因组DNA均有良好的提取效果。

实施例3：

溶菌剂II为10mM的MES，1mM的溶壁酶增强剂，5mM的EDTA，0.01％的Triton X-100和0.1％的溶壁酶，溶菌剂II的pH5.5。

裂解吸附液包括：10mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，1mM EDTA，0.1％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，裂解吸附液的pH为6.0。

加强洗涤液中包括10mM Tris-HCl、0.5M氯化锂和50％乙醇，加强洗涤剂的pH6.5。

其余溶剂的配制同实施例1。

提取方法：

向沉淀中加入50μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为10s，孵育处理时间为10min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；

向混合物Ⅰ中加入50μL的溶菌液II，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为10s，孵育处理时长为10min，使真菌细胞壁水解，得到混合物II；

向混合物II中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物II与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：100：200：5，使原生质体或细胞的DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，振荡速度为500rpm，孵育处理温度为55℃，孵育处理时间为5min；

在混合物3中加入异丙醇400μL和10μL混匀的磁珠，闭盖。室温15℃3000rpm振荡2min；

DNA吸附完成后，将样品放于磁力架上，吸附磁珠直至液体清澈。吸弃液体，保留磁珠。再加入600μL洗涤液I，充分混匀使磁珠完全分散至洗涤液I中。将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠。加入600μL 80％乙醇，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠。重复600μL 80％乙醇洗涤1次。开盖，50℃晾干3分钟。

向晾干的磁珠中加入50μL洗脱液，充分吹打混匀磁珠，50℃1500rpm振荡孵育3min。

实施例4：

溶菌剂II为100mM的MES，100mM的溶壁酶增强剂，150mM的EDTA，5％的Triton X-100和10％的溶壁酶，溶菌剂II的pH8.0。

裂解吸附液包括：100mM Tris-HCl，1.5M氯化钠，20mM EDTA，5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为9.0。

加强洗涤液中包括100mM Tris-HCl、2M氯化锂和70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH7.5。

其余溶剂的配制同实施例1。

提取方法：

向沉淀中加入200μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为60s，孵育处理时间为60min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；

向混合物Ⅰ中加入200μL的溶菌液II，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为60s，孵育处理时长为60min，使真菌细胞壁水解，得到混合物II；

向混合物II中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物II与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：300：600：20，使原生质体或细胞的DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，所述振荡速度为1500rpm，所述孵育处理温度为70℃，孵育处理时间为30min；

在混合物3中加入异丙醇400μL和10μL混匀的磁珠，闭盖。室温(15-30℃)3000rpm振荡2min；

DNA吸附完成后，将样品放于磁力架上，吸附磁珠直至液体清澈。吸弃液体，保留磁珠。再加入600μL洗涤液I，充分混匀使磁珠完全分散至洗涤液I中。将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠。加入600μL 80％乙醇，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。将样品放回磁力架，吸附磁珠至液体清澈，吸弃液体，保留磁珠。重复600μL 80％乙醇洗涤1次。开盖，50℃晾干3分钟。

向晾干的磁珠中加入50-200μL洗脱液，充分吹打混匀磁珠，50℃1500rpm振荡孵育3min。

实施例5：阴道拭子中基因组DNA的提取

将阴道拭子在1mL微生物保存缓冲液中振荡15秒，12,000rpm离心2分钟，弃上清，保留沉淀。以下步骤同实施例2。

以本发明方法提取的阴道拭子基因组DNA为样本，用1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，电泳结果如图2所示。根据图2所示的电泳图可知，琼脂糖凝胶电泳中出现明显的基因组DNA条带，表明本发明方法对阴道拭子也有良好的提取效果。

对阴道拭子中提取的基因组进行阴道加德纳菌和阿托波菌定量分析。

以实施例3提取的阴道拭子中基因DNA为模板，用荧光定量PCR对阴道加德纳菌和阿托波菌进行定量检测，其中，该qPCR体系在Bio-Rad荧光定量PCR仪上进行反应。

扩增条件为：94℃预变性30秒；95℃5秒，60℃40秒，共40个循环，qPCR结果如图4所示。根据图4所示的结果可知，实施例3提取的阴道拭子样本中，出现阴道加德纳菌(图4A)和阿托波菌(图4B)阳性，这表明采用本发明提取的结果能很好的应用于下游实验。

对比例1：Omega真菌DNA提取试剂盒与实施例2中的的提取效果的比较。

Omega真菌DNA提取的方法如下：

(1)用接种环刮取一定量克柔假丝酵母菌，加入800μL Buffer FG1中，充分混匀，65℃孵育10分钟，中间混匀2次；

(2)加入140μL Buffer FG2，混匀后，10,000×g离心10分钟。吸取上清，加入0.7倍的异丙醇，混匀。10,000×g离心2分钟。吸弃上清，保留沉淀。

(3)用300μL预热至65℃的双蒸水悬浮沉淀，加入4μLRNase A，混匀。

(4)加入150μL Buffer FG3和300μL无水乙醇，混匀。转移全部液体至HiBind DNA柱中(已放至2mL收集管中)，10,000×g离心1分钟。

(5)将HiBind DNA柱转移至新的收集管中，加入700μL DNA Wash Buffer，10,000×g离心1分钟。用700μL DNA Wash Buffer重复洗涤1次。最高转速离心HiBind DNA柱2分钟，使柱干燥。

(6)将HiBind DNA柱转移至新的收集管中，加入50μL预热至65℃的洗脱液，室温放置5分钟。10,000×g离心3分钟，收集DNA。

结果比较：以实施例二和上述Omega方法提取的微生物基因组DNA为模板，用1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，电泳结果如图3所示。根据图3所示的电泳图可知，采用本发明实施例2中的提取方法的结果出现明显的基因组DNA条带，而采用Omega方法无明显DNA条带出现，这表明采用本发明提取的真菌DNA效果优于Omega提取的结果。

对比例2：将实施例3中提取的基因组进行NGS测定，主要从提取的微生物种类和拷贝方面与华大公司的结果进行比对，具体操作及试验结果如下：

将实施例3中的样本平均分配成2管，1管按照本发明的提取步骤提取DNA，将提取的DNA和另1管原始样本送华大进行微生物宏基因组NGS测定，NGS结果如图5-图7所示。根据图5-图7所示的结果可知，本发明提取阴道拭子中微生物的效率在微生物种类和拷贝方面均优于华大的提取结果。

Claims (7)

1.一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，其特征在于：还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、Triton X-100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris-HCl、氯化钠、EDTA、TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris-HCl、氯化锂和乙醇。

2.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶菌剂Ⅱ为10-100mM的MES，1-100mM的溶壁酶增强剂，5-150mM的EDTA，0.01％-5％的Triton X-100和0.1-10％的溶壁酶，所述溶菌剂Ⅱ的pH5.5-8.0。

3.如权利要求2所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶壁酶增强剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

4.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述裂解吸附液包括：10-100mM Tris-HCl，0.5-1.5M氯化钠，1-20mM EDTA，0.1％-5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为6.0-9.0。

5.如权利要求4所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述核酸分离吸附促进剂包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲。

6.如权利要求1所述的用于不同微生物基因组DNA的磁珠法提取试剂盒，其特征在于：所述加强洗涤液中包括10-100mM Tris-HCl、0.5-2M氯化锂和50-70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH6.5-7.5。

7.采用权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将各种样本如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌放入微生物保存缓冲液中，充分混匀后离心，保留沉淀；

(2)向沉淀中加入50-200μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为10-60s，孵育处理时间为10-60min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；

(3)向混合物Ⅰ中加入50-200μL的溶菌液Ⅱ，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为10-60s，孵育处理时长为10-60min，使真菌细胞壁水解，得到混合物Ⅱ；

(4)向混合物Ⅱ中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物Ⅱ与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：100-300：200-600：5-20，使原生质体或细胞的DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，所述振荡速度为500-1500rpm，所述孵育处理温度为55-70℃，孵育处理时间为5-30min；

(5)向混合物Ⅲ中加入异丙醇和硅胶磁珠进行振荡混匀，异丙醇的加入量与裂解吸附液的比例按照体积份数比为0.4-1.5:1，加入硅胶磁珠的量为5-20μL，使混合物Ⅲ中释放的DNA高效地吸附在硅胶磁珠上，所述振荡速度1500-3000rpm，所述孵育处理温度为15-30℃，所述孵育处理时长为1-10min；

(6)吸附完成后，使用磁力架分离磁珠，磁力架吸附硅胶磁珠的时长为3-10min或至液体清澈，再依次使用洗涤液I和80％乙醇水溶液对硅胶磁珠分别进行洗涤后分离，洗涤液I使用量为0.5-1mL，对洗涤分离后的硅胶磁珠进行烘干，烘干温度为37-60℃，烘干时长为1-5min，得到去除杂质的含有原生质体(细胞)基因组DNA的硅胶磁珠；

(7)利用洗脱液对硅胶磁珠进行振荡孵育洗脱，洗脱液的使用量为50-200μL，洗脱温度为37-60℃，振荡速度为500rpm-1500rpm，弃去磁力架分离的硅胶磁珠，收集洗脱液，得到基因组DNA。