CN102575220B - 用于直接化学裂解的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

直接化学裂解组合物包括检验相容性缓冲剂成分和检验相容性表面活性剂。当与样品储存组合物组合时，此类组合物防止对于从生物样品中的细胞裂解而来的核酸和蛋白的不想要的修饰。来自此类组合物的样品的检验无需昂贵的和耗时的步骤，例如离心和延长的高温处理。本发明的直接化学裂解组合物允许从生物样品中的细胞直接进行核酸提取，无需倒掉转运培养基或更换转运培养基为检验相容性缓冲剂。无需将样品与蛋白酶K或其它酶组合以从细胞中提取核酸。还涉及用于裂解细胞以获得用于检验的靶核酸的方法，以及用于组合直接化学裂解组合物和样品的试剂盒。

Description

用于直接化学裂解的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年9月3日提交的美国临时专利申请号61/239,553的申请日的权益，其公开内容在此通过引用方式并入本文。
背景技术
本发明总体上涉及在保存的生物样品上进行诊断测试的方法和组合物，尤其涉及在此类保存的样品上进行核酸提取和扩增的方法。
在医学诊断和医学研究的领域，会从患者或受试者(例如，人类患者、人类受试者、人类疾病的实验动物模型)获取样品(例如，组织)以测定该受试者的状况以支持研究，确定该患者的当前状况以进行医学诊断，确定该患者对目前的治疗或处理进程的应答，等等。
为了分析而获取的样品，无论是为了进行医学诊断抑或用于科学研究，通常被置于特殊的转运/保存介质中以防止从受试者中取出时样品降解或分解。因此，样品将尽可能地接近其从受试者中被取出时所处的状况。这确保了该样品精确地反映在取样时患者或受试者的状态，并因此将会在任何随后的样品研究中产生最准确的结果。这些研究中的一些研究将包括核酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))提取和扩增。
从生物样品中提取DNA和/或RNA尤其需要细胞壁的裂解(在原核细胞的情况下)、细胞膜的裂解(在某些真核细胞的情况下)或病毒衣壳的裂解(在病毒的情况下)。部分地，随后的扩增需要引物与靶核酸内的特定位点的结合。
有多种程序可用于核酸的提取和随后的扩增。这些程序中的一些程序利用高通量设备。高通量设备是自动化的，意指：样品与合适的化学品一起被置于设备内，进行提取和扩增步骤、无需操作者进一步进料(例如，ViperTM XTR系统，见Becton BD ProbeTecQx Amplified DNA Assay Package Insert，Becton Dickinson 2008)。其它的程序利用复杂度没这么高的设备，通常被称作人工程序。然而，不论何种程序，总是需要裂解细胞或病毒衣壳以释放核酸，需要使核酸附着至颗粒、例如氧化铁，以便从样品的其余部分提取核酸，需要使引物与靶核酸结合以扩增核酸。
转运介质(例如，液体细胞培养基)通常包含以一种或多种方式保存某些细胞的一种或多种成分(例如，防止细胞壁分解或细胞膜被细胞裂解)。另外，这些成分中的一些具有保存样品和去污染的双重目的。已知的是，这些成分会干扰裂解细胞膜和细胞壁的能力，干扰提取的核酸与核酸提取中所使用的颗粒附着的能力，以及干扰扩增靶核酸的能力。
基于液体的细胞学组合物例如(Tripath Imaging，Inc.，N.C.)溶液或溶液(Hologic Inc.，MA)会对从暴露于其中的样品提取可扩增的靶核酸的能力产生不利影响。已经提出了很多理由来解释所观察到的这种不利影响，包括：1)核酸被介质中的成分降解；2)介质中的成分使核酸发生化学变化；和3)组织中细胞裂解机制的抑制，其抑制用于提取和扩增的核酸的释放。为了避免液体细胞学组合物对提取的DNA造成的不利影响，在裂解之前从组合物中将细胞提取出来。通常而言，提取需要离心以轻轻倒出液体细胞学组合物，与细胞分离。然后，将细胞重悬于缓冲剂中并以酶裂解之。这样的额外步骤通常与很多高通量设备、例如上述的ViperTM系统是不相容的。即使是在不涉及自动化的情况下，此类步骤也是耗时的。这些步骤所需的额外时间会使测试结果的获得被延后，最好能避免之。
用于纯化核酸的介质试剂盒的一个实例是来自Qiagen的QIAamp MinElute Media Kit。该介质试剂盒描述于日期为2004年2月的QIAmp MinElute Media Handbook中。所描述的QIAamp程序具有4个步骤：裂解、结合、洗涤和洗脱。在该程序中，使用蛋白酶K将样品裂解，然后使核酸通过吸附至硅胶溶解产物而与QIAmpMinElute柱结合。虽然QIAamp程序是经证明可行的方法，但是其仅仅对于250μl的液体细胞培养基的纯化是优化的，并且既费力又耗时(即其需要18个步骤，包括65分钟的不同温度的温育，5次离心步骤，2次真空过滤步骤和数个混合步骤)。迄今仍然需要使用此类多步骤方法以成功地从固定样品、例如液体细胞培养基和石蜡包埋的组织中纯化核酸。众所周知的是，从固定的介质中纯化核酸比从新鲜组织中更困难，因为介质中的固定剂会向样品中的靶分子引入不想要的化学修饰。这些反应的发生会使样品中的核酸交联或修饰样品中的核酸。转运介质中的其它添加物也会引起不想要的交联。例如，由于转运介质中福尔马林的存在而引起的交联，其描述于Rai，V.K.等人″Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovinepancreatic ribonuclease A：I-Structural and functional alterations，″Lab.Invest.Vol.84(3)：292-299(March 2004)。甲醛还会在核酸与蛋白之间产生交联，其描述于Solomon，M.J.，″Formaldehyde-mediatedDNA-protein crosslinking：A probe for in vivo chromatinstructures，″Proc.Natl. Acad.Sci. Vol.82，pp.6470-6474(1983年10月)。如Sepp，R.等人″Rapid techniques for DNA extraction fromroutinely processed archival tissue for use in PCR，″J.Clin.Pathol.Vol.47：318-323(1994)中所描述，从福尔马林固定的石蜡中获取的细胞中提取DNA通常需要加工步骤(例如，延长的煮沸)，这会对用于扩增的DNA的量造成不利影响。根据Sepp，R.等人，需要煮沸样品，这尤其是为了使蛋白酶K失活。此外，蛋白酶K被很多固定剂中的成分抑制，这直接利用了其在分解蛋白交联方面的有限的有效性。
因此，仍然需要用于从组织和其它细胞及细胞成分中提取DNA的、克服了对核酸造成的交联和其它不想要的修饰的问题、但无需延长的高温处理(这会对样品造成不利影响或使过程更加费钱、耗时)的方法和组合物。
发明内容
用于与样品储存组合物组合的直接化学裂解组合物，其包括检验相容性缓冲剂成分和检验相容性表面活性剂。此类组合物防止了从生物样品中的细胞裂解而来的核酸的不想要的修饰，从此类组合物进行的样品检验无需昂贵且耗时的步骤、例如离心和延长的高温处理。
本发明的直接化学裂解组合物允许从生物样品中的细胞直接提取核酸，无需倒掉细胞培养基或更换细胞培养基为检验相容性缓冲剂。可以在样品仍然与直接化学裂解组合物组合时，直接发生细胞裂解。无需将样品与蛋白酶K或一些其它酶组合以从细胞中提取核酸。
在一个实施方式中，直接化学裂解组合物用作用于样品稀释、储存、运输等的基于液体的细胞学(LBC)组合物的添加物。直接化学裂解组合物允许在从样品进行核酸提取之前，在样品被预温或温育时进行样品裂解。LBC的实例包括但不限于SurePath LBC和ThinPrepPreservCyt LBC。
在一个实施方式中，用于与样品储存组合物组合的直接化学裂解组合物具有检验相容性缓冲剂成分和检验相容性表面活性剂。在优选的实施方式中，检验相容性缓冲剂成分具有缓冲剂组分和金属盐组分。在优选的实施方式中，直接化学裂解组合物的pH是大约6.6至大约10。
合适的金属盐的实例包括氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、乙酸钠(C2H3NaO2)和硫酸铵((NH4)2SO4)。在所描述的实施方式中，直接化学裂解组合物中的金属盐的浓度是至少大约0.01M。优选地，盐是NaCl并且盐浓度是大约0.01M至大约1M。
在优选实施方式中，缓冲剂组分的浓度是大约0.2M至大约2M。合适的缓冲剂组分的实例包括三(羟基甲基)氨基甲烷和三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐。
在一些实施方式中，直接化学裂解组合物还包含非离子表面活性剂。合适的表面活性剂的实例包括基于聚乙二醇的非离子表面活性剂，例如聚乙二醇辛基苯基醚(商售产品：x-100)。合适的非离子表面活性剂的另外的实例包括聚山梨酯表面活性剂，例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(商售产品为：聚山梨酯20或20)。20和x-100均为商业上可获得的。在优选实施方式中，非离子表面活性剂的浓度是大约0.01％至大约2％(v/v)。
在一些实施方式中，直接化学裂解组合物还包含甘氨酸。
在一个优选实施方式中，权利要求10的直接化学裂解组合物，其中缓冲剂组分是三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐，缓冲剂组分的浓度是大约0.75M，NaCl的浓度是大约0.19M，聚乙二醇辛基苯基醚的浓度是大约0.75％(v/v)。
本发明还涉及用于分析样品储存组合物中储存的样品的方法。在该方法中，将样品与如上所述的直接化学裂解组合物组合。从样品储存组合物中取出至少一部分样品与至少一些样品储存组合物。然后，将与样品储存组合物组合的样品在至少80℃的温度温育足以裂解取出的样品部分中的至少一部分细胞的时间段。从样品中提取核酸，然后扩增。可以使用自动化或人工过程进行提取。在一些实施方式中，靶核酸是RNA或DNA。
在一个实施方式中，将样品与包含下列的直接化学裂解组合物组合：a)检验相容性缓冲剂成分；和b)检验相容性表面活性剂。从样品储存组合物中取出至少一部分样品，其中，取出的部分还包含样品储存组合物。将取出的样品部分在至少80℃的温度温育足以裂解取出的样品部分中的至少一部分细胞的时间段。按照上文描述提取核酸并进行扩增。在该实施方式中，在裂解和提取步骤之前，取出的样品部分不与样品储存介质进行另外的分离。提取步骤可以是人工的或自动化的。
本发明的其它实施方式包括：通过直接化学裂解从取自样品储存组合物的样品提取核酸的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括如上文描述的直接化学裂解组合物。提供样品储存组合物以保存组织样品。
在一个实施方式中，用于提取核酸的诊断试剂盒包括样品储存组合物和具有下列的直接化学裂解组合物：a)检验相容性缓冲剂成分；和b)非离子表面活性剂，其中提供样品储存组合物以保存组织样品。检验相容性缓冲剂成分具有缓冲剂组分和金属盐。在一个实施方式中，金属盐是NaCl并且直接化学裂解组合物中的NaCl的浓度是至少大约0.01M并且缓冲剂组分的浓度是大约0.2M至大约2M。直接化学裂解组合物的pH是大约7至大约9，并且非离子表面活性剂的浓度是大约0.01％至大约2％(v/v)。
附图说明
图1A-D例示了pH对于直接化学裂解组合物的一个实施方式的有效性的效应。
图2例示了使用直接化学裂解组合物的一个实施方式和本文公开的方法裂解的样品中的蛋白生物标志物的检测。
详细描述
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明的应用不限于以下描述或通过实施例例示的详细内容。本发明能够以其它实施方式或以多种方式实施或实行。同样要理解，本文使用的词语和术语是为了描述的目的，不应被认为是限制性的。以下是本说明书中使用的一些术语的定义。
直接化学裂解组合物是允许样品中的细胞成分被裂解以从中提取核酸(NA)、无需用于将化学裂解组合物与样品分离的干涉步骤的组合物。直接化学裂解组合物还允许其它样品组分(例如蛋白生物标志物)的检验/检测，无需在检验/检测那些组分之前将化学裂解组合物与样品分离。
核酸的实例有：单链或双链DNA和RNA。可以通过该方法提取的核酸的另外的实例不仅包括来自动物、植物、细菌、病毒、真菌和寄生虫生物的基因组DNA或RNA，而且包括线粒体或叶绿体的DNA或RNA。可以通过该方法提取的其它类别的核酸的实例不仅包括mRNA、而且包括转运RNA、核糖体RNA和小核RNA以及质粒DNA。通过本发明的方法提取的DNA和RNA也可是完全或部分单链的，或具有其它三级或四级结构。含有核酸的样品的实例有：活体样品，例如白细胞，通常通过基因重组技术制备的包含载体等的宿主细胞的培养物，以病毒或噬菌体感染的细胞，血液中的病毒，以及样品微生物的培养物。培养物可以包含微生物，但是其上清液即足够。不仅人工培养物而且天然产生的培养物也可应用。在包含微生物的团块的样品的情况下，可以视需要进行匀浆化或超声处理以实现良好的提取效率。
备选的样品类型包括但不限于：用于诊断感染性或非感染性疾病的生物样品，环境样品，或食物或水样品。靶核酸可以是特定的序列，或者其可以是一类核酸。对于特定的检验方法，核酸的类别是这样的核酸分子：其化学、物理或生物学性质是使得它们可以被预期通过用于核酸提取的方法被有效提取。通常而言(但不一定如此)，核酸的类别是所有的DNA或DNA类似物，或所有的RNA或RNA类似物。其它靶物可以是蛋白序列，例如蛋白生物标志物。
靶向的生物可以包括但不限于：沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒1/2、丙肝病毒、乙肝病毒、严重急性呼吸综合征病毒、甲型/乙型流感病毒、单纯疱疹病毒1-6、肠道病毒、西尼罗河病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A/B、副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、鸟细胞内分枝杆菌复合群菌(Mycobacterium avium-intracellulare complex)、结核分枝杆菌复合群菌(Mycobacterium tuberculosis complex)、巨细胞病毒、B群链球菌属、百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)和副百日咳杆菌(Bordetellaparapertussis)。
在本发明的一个方面，靶核酸是来自下列来源中的一个或多个的特定的RNA或cDNA：细菌病原体、细菌非病原体、病毒病原体、病毒非病原体、真菌病原体、真菌非病原体、酵母病原体、酵母非病原体、寄生虫病原体、寄生虫非病原体、植物、动物制品、食物、样品基质内的总RNA或cDNA、原核细胞总RNA或cDNA、真核细胞总RNA或cDNA，或病毒总RNA或cDNA。
在本发明的另一个方面，寻找的靶核酸是来自一个或多个下列来源的DNA：细菌病原体、细菌非病原体、病毒病原体、病毒非病原体、真菌病原体、真菌非病原体、酵母病原体、酵母非病原体、寄生虫病原体、寄生虫非病原体、植物、动物制品、食物、样品基质内的总DNA、原核细胞的总基因组DNA、真核细胞的总基因组DNA，或病毒总DNA。
在本发明的另一个方面，靶物是蛋白生物标志物。
样品储存组合物是用于从样品中的细胞成分提取核酸之前储存和/或运输生物样品的任意组合物。如上所述，样品储存组合物包括LBC介质、石蜡介质等。
如本文使用的检验相容性成分是不会对样品(例如，提取的核酸/蛋白)所经历的检验造成显著不利影响的任何成分。例如，检验相容性成分将不会以对下游检验的检测核酸或其它样品组分例如蛋白生物标志物的能力造成不利影响的方式修饰样品中的提取的核酸。
在一个实施方式中，本文描述的直接化学裂解组合物具有两个成分的检验相容性缓冲剂成分。检验相容性缓冲剂成分将不会以对下游检验的检测核酸的能力造成不利影响的方式修饰样品中的提取的核酸(单独或与化学裂解组合物中的其它组分组合或与提取的核酸的组分(例如样品储存组合物的残余)组合)。检验相容性缓冲剂成分的第一个成分是检验相容性缓冲剂。此类缓冲剂是本领域技术人员熟知的，在本文中没有穷举。合适的缓冲剂的实例包括三(羟基甲基)氨基甲烷和三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐(本文中的Tris HCl)。直接化学裂解组合物中的缓冲剂的最终工作浓度是大约0.2M至大约2M。优选地，缓冲剂组分的浓度是大约0.5M至大约1M。本文中的所有浓度均表示为最终的工作浓度(即，在直接化学裂解组合物与样品组合时的浓度)。
检验相容性成分中的第二个成分是盐。合适的盐的实例包括NaCl、KCl、C2H3NaO2(乙酸钠)和(NH4)2SO4(硫酸铵)。在优选的实施方式中，盐是金属盐，最优选为NaCl。直接化学裂解组合物中的盐的浓度是大约0.01M至大约1M。在优选实施方式中，金属盐的浓度是大约0.1M至大约0.5M，最优选为大约0.1M至大约0.4M。特定的直接化学裂解组合物中的盐浓度取决于组合物的缓冲剂、pH和表面活性剂(如果有)。
直接化学裂解组合物还包含检验相容性表面活性剂。合适的表面活性剂的实例包括上述的X-100和20(聚山梨酯20)。检验相容性如上文所定义。在优选实施方式中，检验相容性表面活性剂是基于聚乙二醇的非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的浓度是大约0.01％至大约2％(v/v)。在优选的实施方式中，非离子表面活性剂是聚乙二醇辛基苯基醚。检验相容性表面活性剂是本领域技术人员熟知的，在本文中不详细讨论。
直接化学裂解组合物具有大约6.6至大约10的pH。在优选实施方式中，pH是大约7至大约9。
本文描述的直接化学裂解组合物通过减少通常发生于核酸与介质组分之间的交联而促进从介质固定的样品中提取核酸，以提供可提取和可扩增的核酸。在一个实施方式中，将样品与直接化学裂解组合物组合并在大约100℃至大约130℃的温度温育大约10分钟至大约30分钟的时间，以化学裂解至少一部分细胞，在已经发生核酸交联的情况下，使核酸去交联。然后，从样品中提取核酸。在优选实施方式中，核酸是DNA，通过使用氧化铁颗粒磁性分离DNA进行DNA提取。在优选实施方式中，提取程序与BD Viper XTRTM平台是相容的。此类程序提供了DNA与氧化铁颗粒的结合，从颗粒上洗掉残余样品，并从颗粒洗脱DNA。提取的DNA经历合适的扩增和检测检验(例如实时PCR)。
在另一个实施方式中，就靶抗原(例如蛋白生物标志物)分析样品。检测提取自样品的抗原的常规检验法是本领域技术人员熟知的，在本文中未详细描述。在一个实例中，抗体捕获分子用于结合并检验靶抗原。用于此类捕获的抗体方法常规地以多种不同形式被使用。最常使用的技术之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其常规地用于蛋白诊断应用。蛋白检测方法的理想特性是保存和从细胞回收抗原的能力，从而它们可以暴露于捕获抗体，在一些情况下保留它们的天然形状并允许构象依赖性抗体特异性结合靶抗原。另一个理想特性是允许正确的抗体分子选择性结合靶物并允许在洗涤步骤中除掉非特异性相互作用的能力。因此，蛋白生物标志物检测需要检验相容性缓冲剂与特定的蛋白结合相互作用相容并促进特定的蛋白结合相互作用。本文描述的直接化学裂解组合物的强度足以裂解细胞，从而释放那些细胞的蛋白物质。直接化学裂解组合物对释放的蛋白没有不利影响，并保护蛋白抵抗蛋白水解酶类。最后，检验相容性缓冲剂与特定的抗体结合是相容的，不会由于变性效应、离子相互作用等干扰该过程。
以下提供了一些实施例以具体例示上文描述的概念。以下实施例是本发明的特别具体的实施方式，不应被解释为以任何方式限制本发明，除非是与随附的权利要求一致的方式。
实施例1：从储存于SurePath LBC的患者样品提取HPV DNA
比较了两种溶液以确定它们作为直接化学裂解组合物的有效性。第一种是包含1M Tris-HCl，0.5M NaCl，1％Triton X-100并具有9.0的pH的稀释剂(在本文中称作稀释剂1)。第二种稀释剂包含330mMTris-HCl，16.67mM NaCl并具有7.8的pH(在本文中称作稀释剂2)。收获源自患者的细胞贮液并在SurePath LBC中储存21天。稀释剂1和稀释剂2都是本发明的直接化学裂解组合物的实施方式。
具体地，将源自患者的细胞贮液在SurePath LBC中稀释为大约12,500细胞/ml的浓度。准备48个样品管以在Becton Dickinson(BD)ViperTM工具上进行检验。24个管中具有0.85ml稀释剂1；24个管中具有相同数量的稀释剂2。将稀释的源自患者的细胞(0.25ml)加入48个样品管中的每一个管中。与样品组合之后，最终的工作缓冲剂浓度如下：i)在稀释剂1中是：0.77M Tris-HCl，0.386M NaCl，0.77％Triton X-100(pH为大约9.0)；ii)在稀释剂2中是：0.255M Tris-HCl，0.0129M NaCl(pH为大约7.8)。
在i)室温、ii)80℃或iii)120℃温育来自每组24个管的8个样品，均温育20分钟。然后将样品在室温冷却25分钟。然后，使用氧化铁(FEO)颗粒将样品进行改良的ViperTM XTR DNA提取程序，使用0.8ml预温或温育的样品进行提取。用于ViperTM XTR的提取程序是商业上可获得的，在本文中未详细描述。在提取了DNA的情况下，在400μl洗脱/中和缓冲剂中洗脱样品的DNA。将洗脱液(20μl)与5μlPCR主混合物混合，然后向每个反应中后掺入20拷贝/反应的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。通过得到的循环阈值(Ct)测定DNA检测。小于约30的Ct值代表强烈的阳性反应，表示在样品中有丰富的靶核酸。30-35的Ct值代表中至低的阳性反应，表示样品中有中至低数量的靶核酸。35-45的Ct值代表弱的反应，指示样品中的最小量的靶核酸。大于约45的Ct值表示为“无Ct”，表示未检测到DNA。
表1：从储存于SurePath介质中的患者样品提取HPV DNA
与在稀释剂2中在120℃温育相比，在稀释剂1中在120℃温育分别使HPV 16和HBB的Ct值降低1.90和2.77。在两种稀释剂中在室温或80℃温育都未产生HPV16和HBB的扩增。掺入的HPV 45和HPV 18的检测确认了该检验本身是可行的，但是在较低的温育温度未检测到HPV16和HBB，这说明在这些样品中没有发生裂解、提取或检测。
实施例2：使用不同的稀释剂和单一稀释剂成分从SurePath中提取HPV DNA
在SurePath LBC中稀释源自患者的细胞贮液至12500细胞/ml。准备48个BD Viper样品管。在每个组中有8个管，共6组(a-f)。在每个组中，加入0.85ml下列缓冲剂之一：
a.仅1M Tris，pH 9.0；
b.0.5M NaCl；
c.1％Triton X-100；
d.a+b+c；
向48个样品管中的每个管加入稀释的患者细胞(0.25ml)。与样品组合之后，最终的工作缓冲剂浓度如下：在组a中是0.77MTris-HCl；对于组b是0.386M NaCl；在组c中是0.77％Triton X-100；在组d中是0.77M Tris-HCl，0.386M NaCl和0.77％Triton X-100(缓冲剂a、b和c的组合)。所有的样品管都在120℃温育20分钟。然后，将样品在室温冷却25分钟。然后将样品载入BD ViperTM XTR工具，按照如上所述使用0.8ml进行提取。在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将洗脱液(20μl)与5μl PCR主混合物混合。向每个反应中后掺入20个拷贝/反应的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，作为对照，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。
表2：使用HPV稀释剂和单一成分缓冲剂从SurePath LBC介质提取HPV DNA
  HPV16   1M Tris(a)   0.5M NaCl(b)   1％Triton(c)   a+b+c
  1   35.27   35.86   34.56   32.43
  2   37.07   36.62   36.55   31.03
  3   34.27   无Ct   36.68   31.30
  4   34.52   无Ct   35.65   30.95
  5   无Ct   无Ct   34.37   31.62
  6   35.90   无Ct   33.71   31.21
  7   34.26   无Ct   34.46   31.20
  8   34.09   35.66   35.12   30.80
  平均值   35.05   36.05   35.14   31.33
  HPV45   1M Tris(a)   0.5M NaCl(b)   1％Triton(c)   a+b+c
  1   33.47   34.61   34.19   35.22
  2   33.76   34.17   33.90   33.39
  3   34.01   33.56   34.01   33.69
  4   33.80   31.61   34.29   33.98
  5   33.01   32.86   33.23   33.57
  6   32.59   33.49   33.44   33.43
  7   33.37   32.56   33.44   33.05
  8   32.75   33.25   35.33   33.92
  平均值   33.35   33.26   33.98   33.78
  HBB   1M Tris(a)   0.5M NaCl(b)   1％Triton(c)   a+b+c
  1   无Ct   无Ct   无Ct   42.35
  2   无Ct   无Ct   44.25   41.29
  3   无Ct   无Ct   43.81   40.94
  4   无Ct   无Ct   无Ct   40.38
  5   无Ct   无Ct   无Ct   41.67
  6   43.34   无Ct   42.17   40.63
  7   44.52   无Ct   44.87   41.02
  8   无Ct   无Ct   无Ct   40.70
  平均值   43.93   43.78   41.12
  HPV18   1M Tris(a)   0.5M NaCl(b)   1％Triton(c)   a+b+c
  1   34.99   34.94   34.05   34.34
  2   33.94   34.56   33.84   34.18
  3   34.80   34.68   34.65   34.27
  4   33.97   34.52   33.80   33.74
  5   33.95   35.75   33.89   34.25
  6   35.17   33.90   34.27   34.35
  7   34.39   34.56   34.41   33.64
  8   33.87   34.94   34.03   34.32
  平均值   34.38   34.73   34.12   34.14
使用上文所述的d)在120℃温育时检测到了HPV型别16、18和45。其它的单一稀释剂成分(1M Tris，0.5M NaCl和1％Triton)未提供一致性的DNA检测(不论HPV是何种型别)。各个单一成分对于改善DNA提取作出了贡献。当成分a、b和c组合在一起时，取得了最佳结果。
实施例3：比较从SurePath LBC提取DNA：使用稀释剂1在120℃温育和使用稀释剂2在室温温育
收集36份SurePath样品并根据以下两个程序提取。
1)无加热实验
通过加入0.85ml如实施例1中描述的稀释剂2而制备36个BDViperTM样品管。向每个管中加入SurePath临床样品(0.25ml)。与样品组合之后，最终工作缓冲剂浓度如下：对于稀释剂2而言是0.255MTris-HCl，0.0129M NaCl(pH为约7.8)。将36个管载入BD ViperTM，使用0.8ml样品进行提取。在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将洗脱液(20μl)与5μl PCR主混合物混合。使用实时PCR检验检测HPV 16、18和45以及人DNA内源性对照基因HBB。
2)加热实验
通过加入0.85ml如实施例1中描述的稀释剂1而制备36个BDViperTM样品管。向每个管中加入SurePath临床样品(0.25ml)。稀释剂与样品组合之后，最终工作缓冲剂浓度如下：在稀释剂1中是0.77MTris-HCl，0.386M NaCl和0.77％Triton X-100(pH为约9.0)。所有的样品管均在120℃温育20分钟，然后冷却25分钟至室温。将36个管载入BD ViperTM，使用0.8ml样品进行提取。在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将洗脱液(20μl)与5μl PCR主混合物混合。使用实时PCR HPV检验法检测HPV 16、18和45以及人DNA内源性对照基因HBB。未检测到HPV 45和HPV 18。
表3：DNA提取之比较：i)使用稀释剂1并在120℃温育；和ii)使用稀释剂2在室温温育
平均而言，相对于使用稀释剂2在室温温育的程序，使用加热的温育/稀释剂1的程序的HBB检测降低了4.29Ct。具有16型HPV DNA的样品(假设所有的样品都具有HBB对照DNA，但不是所有样品都具有一种或多种型别的HPV)显示出具有下降的Ct值的检测，因此相对于使用室温温育和稀释剂2，当使用具有加热的温育和稀释剂1时，这些样品更容易检测。
实施例4：比较在加热或不加热的情况下从SurePath和ThinPrepPreservCyt LBC的DNA提取
在SurePath或ThinPrep阴性临床样品之一中稀释源自患者的细胞贮液至12500细胞/ml。准备32个BD ViperTM样品管，向其中加入0.85ml稀释剂1。向16个样品管中加入掺入了患者细胞的SurePath(0.25ml)，向另16个样品管中加入掺入了患者细胞的ThinPrep(0.25ml)。稀释剂与样品组合之后，最终工作缓冲剂浓度如实施例1中所述。来自每个组的8个样品管在室温温育，8个在120℃温育20分钟。加热的管冷却25分钟至室温。然后将样品载入BD ViperTM平台，使用0.8ml样品进行DNA提取。然后在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将洗脱液(20μl)与5μl PCR主混合物组合。向每个样品中后掺入20拷贝/反应的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。
表4：在加热或不加热的情况下从SurePath和ThinPrepPreservCyt LBC的DNA提取
对于ThinPrep和SurePath样品，在稀释剂1中在120℃温育样品均使HBB Ct值显著下降。对于ThinPrep样品，降低(相对于室温温育)0.93Ct，对于SurePath样品，降低5.08Ct。加热对于来自ThinPrep的HPV16的检测没有统计上显著的效应，但是显著改善了从SurePath的HPV16的检测。
实施例5：使用稀释剂1在不同的pH、温度和时间从SurePath提取DNA
使用114℃、10分钟的温育程序以及如实施例1描述的稀释剂1(即1M Tris，0.5M NaCl和1％Triton x100)。使用具有不同pH(9.0和7.8)的样品，并在不同的温育温度和时间测定。另外就实施例1的稀释剂2(16.67mM NaCl和330mM Tris)测评不同的pH。
在SurePath中稀释源自患者的细胞贮液至12500细胞/ml的浓度。准备56个样品管用于BD Viper XTRTM平台。7个组中各有8个管。向7个组中的每个组中加入以下缓冲剂中之一(0.85ml)：
a.稀释剂1，pH9.0(在120℃温育20分钟)
b.稀释剂1，pH9.0(在120℃温育10分钟)
c.稀释剂1，pH9.0(在114℃温育20分钟)
d.稀释剂1，pH9.0(在114℃温育10分钟)
e.稀释剂1，pH7.8(在120℃温育20分钟)
f.稀释剂2，pH7.8(在120℃温育20分钟)
g.稀释剂2，pH9.0(在120℃温育20分钟)
向每组的每个管中加入稀释的患者样品的等份(0.25ml)。稀释剂与样品组合之后，最终工作缓冲剂浓度如实施例1所述。每个组在如上文指定的温度和时间温育。然后将所有的管冷却25分钟至室温。然后将管载入BD Viper XTRTM，使用0.8ml进行从样品的DNA提取。在400μl洗脱/中和缓冲剂中洗脱DNA。将每个洗脱液(20μl)与5μlPCR主混合物混合。向每个反应中后掺入20拷贝/反应的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。
表5：使用不同pH的稀释剂1在不同的温度和时间从SurePath提取DNA
温育程序(114℃，10分钟)没有产生如使用较高的加热程序时所获得的对于HPV 16的检测程度。然而，对于掺入的HPV 45和HPV18获得了相同的检测程度，与所使用的温育程序无关。由此得出结论：114℃的程序提供了低于120℃温育程序的DNA提取程度。类似地，对于HPV 16DNA的提取，在120℃温育10分钟不如在120℃温育20分钟有效。相对于使用pH 9.0的稀释剂1而言，使用稀释剂1在pH 7.8提取和检测HPV 16DNA显示出接近1Ct的改善(在120℃温育20分钟)。在稀释剂1中在120℃温育之后提取，产生了检验差异性上的显著下降，如通过PCR重复物中的标准偏差所测定。
实施例6：pH对于稀释剂功效的影响
在SurePath LBC介质中稀释源自患者的细胞贮液至12500细胞/ml。准备40个样品管用于BD Viper XTRTM平台。将它们分成5个组。向每个组中的管加入如实施例1描述的具有不同pH的稀释剂1(0.85ml)。所用的稀释剂如下：
a.稀释剂1，pH6.6；
b.稀释剂1，pH6.7；
c.稀释剂1，pH7.3；
d.稀释剂1，pH8.0；
e.稀释剂1，pH9.0；和
f.稀释剂1，pH10.0。
将稀释的患者细胞贮液(0.25ml)加入到每个组的每个管中。每个组在120℃温育20分钟，然后冷却25分钟至室温。然后将样品载入BDViper XTRTM，使用0.8ml样品进行提取。在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将20μl洗脱液与5μl PCR主混合物混合。向每个样品中后掺入20拷贝的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。
表6：pH对于稀释剂1的功效的影响
见图1A-D中的结果，就从样品检测HPV程度而言，具有大约7.3-9的pH的稀释剂1提供了最佳结果。这表明当使用具有该范围的pH的稀释剂时，从样品提取DNA是最佳的。由于在所有的pH时所检测的掺入的HPV 18和45基本上是相同的，所以HPV16和HBB的检测之改善归因于在7.3至9.0的pH范围内获得的较佳的DNA提取。
实施例7：DNA提取程序的比较
收获源自患者的细胞并分成两个相等的组。一半储存于ThinPrep，另一半储存于SurePath LBC。两个组中浓度均为1.14x107细胞/ml。从SurePath介质中储存的1.14x107细胞/ml制备细胞浓度为2.5x104细胞/ml的贮液。该贮液用于以下提取程序。使用BD ViperXTRTM平台的DNA提取进行所有提取程序。
在第一个程序中，将8个SurePath贮液的226μl样品在13,000g离心5分钟。倒掉上清液并重悬于1ml稀释剂2(如实施例1所描述)，其中还包含浓度为2mg/ml的蛋白酶K。将8个样品转移至样品管以用于BD Viper XTRTM平台并在70℃温育1小时。然后按照下文描述在BD Viper XTRTM平台进行提取。
在第二个程序中，通过向样品中加入774μl稀释剂2(还包含浓度为2mg/ml的蛋白酶K)而稀释8个SurePath贮液的样品(226μl)(1∶4)。将8个样品转移至样品管以用于BD Viper XTRTM平台并在70℃温育1小时。然后按照下文描述在BD Viper XTRTM平台进行提取。
在第三个程序中，将8个SurePath贮液的样品(250μl)与850μl稀释剂2(如实施例1所描述)组合。将8个样品转移至样品管以用于BD Viper XTRTM平台并在120℃温育20分钟。然后按照下文描述在BD Viper XTRTM平台进行提取。
在第四个程序中，将8个SurePath贮液的样品(250μl)与850μl稀释剂1(如实施例1所描述)组合。将8个样品转移至样品管以用于BD Viper XTRTM平台并在120℃温育20分钟。然后按照下文描述在BD Viper XTRTM平台进行提取。
对于阴性对照，将8个850μl的稀释剂2的等份与250μl清洁SurePath培养基混合。然后按照下文描述在BD Viper XTRTM平台进行提取。
将所有的样品载入BD Viper XTRTM，使用0.8ml样品进行提取。然后在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将20μl洗脱液与5μl PCR主混合物混合。使用实时PCR检验法检测HPV 16和人DNA内源性对照基因HBB。
表7：热处理和蛋白酶K(PK)处理程序的比较
对于HPV 16而言，在120℃在稀释剂1中温育产生了最低的平均CT值。这表明，在所测试的程序之中，在稀释剂1中温育提供了最佳的样品DNA提取。使用稀释剂2、在120℃温育的程序产生了优于使用蛋白酶K、在70℃温育、不离心的结果。特别地，当与i)在70℃以蛋白酶K处理(离心之后)；ii)蛋白酶K处理(无离心)；和iii)在稀释剂2中在120℃温育相比时，稀释剂1使HPV 16的平均Ct值分别下降0.90、2.72和1.5，并且使HBB的平均Ct值分别下降0.97、2.45和1.72。
实施例8：从掺入了血液的样品的提取
将汇集的SurePath和ThinPrep 临床阴性样品与全血组合。每体积样品中的血液体积为1％、2％、5％和10％。所有的样品在120℃与实施例1中描述的稀释剂1温育20分钟。然后使用之前实施例描述的程序在BD Viper XTRTM平台上进行提取。将所有的样品载入BDViper XTRTM，使用0.8ml样品进行提取。然后在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA。将20μl洗脱液与5μl PCR主混合物混合。使用实时PCR HPV检验法检测人DNA内源性对照基因HBB。
表8A：血液对于检验的影响(SurePath)
表8B：血液对于检验的影响(ThinPrep PreservCyt)
检验没有受到高浓度的全血的影响，全血是LBC样品中经常发现的物质，已知其为PCR反应的抑制剂。即使是当临床样品中存在高浓度的全血时，该DNA提取方法也提供了合适的用于PCR扩增的DNA。
实施例9：从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片中提取DNA
在120℃，将福尔马林固定的、石蜡包埋的子宫颈活组织检查组织切片在2ml如实施例1中描述的稀释剂1中温育25分钟。然后将样品冷却至室温。冷却之后，将样品在BD Viper XTRTM平台上进行如上文所述的提取程序。将所有的样品载入BD Viper XTRTM，使用0.8ml样品进行提取。然后在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA，将50μl洗脱液加入到干燥的PCR主混合物中。使用实时PCR检验法检测HPV亚型16、18、45、31、51、52、59(33、58、56、66)、(39、68、35)和人DNA内源性对照基因HBB。
表9：从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片进行的Viper DNA提取
在22个单一样品中的20个之中，成功检测到了一些亚型的HPVDNA。在22个样品中的21个之中，检测到了人内源性β-珠蛋白基因。使用了实时PCR和HPV亚型特异性引物以及针对HBB的β-珠蛋白特异性引物。β-珠蛋白的结果表明不存在与目前的DNA提取方法相关的明显的PCR抑制。在一例样品中未能检出β-珠蛋白信号，在另一例样品中未能检出β-珠蛋白和HPV信号，这可能是因为在为了DNA提取而处理的部分中缺乏足够的靶细胞。
实施例10：通过用于直接化学裂解的稀释剂1从储存于SurePath和ThinPrep LBC介质中的源自患者的细胞提取HPV DNA
在SurePath和Thinprep LBC中稀释源自患者的贮液细胞至5000细胞/ml。每个样品类型的16个管具有0.50ml以下稀释剂：1.5M Tris，0.386M NaCl和1.5％Triton X-100(v/v)。稀释剂具有7.9的pH。向每个含有稀释剂的样品管中加入SurePath和ThinPrep中的稀释的源自患者的细胞(0.5ml)。与样品组合之后，最终的工作缓冲剂浓度如下：0.75M Tris-HCl，0.193M NaCl和0.75％Triton X-100(v/v)(pH为大约7.9)。将组合的溶液在120℃温育20分钟，作为直接化学裂解。温育之后，准备样品以在BD ViperTM XTR平台上提取。使用如前文所述的提取程序。即，将所有的样品载入BD Viper XTRTM，使用0.8ml样品进行提取。一半样品在提取过程中伴有裂解步骤，一半样品没有。在400μl洗脱/中和缓冲剂中从样品洗脱DNA，将20μl洗脱液与5μlPCR主混合物混合。向每个样品中后掺入20拷贝的HPV 18和HPV 45质粒DNA靶物，以测试PCR抑制。使用实时PCR检验法检测HPV 16、18和45，和人DNA内源性对照基因HBB。以下提供了检验结果。
表10：通过在稀释剂中预温，作为直接化学裂解，然后进行DNA提取(伴有或不伴有裂解)
对于在DNA提取过程中伴有裂解和没有裂解(即使用本文描述的组合物和方法的一个实例进行直接化学裂解)而言，提取的DNA(即HPV 16和HBB)和掺入的DNA(即HPV 45和HPV 18)的DNA产率大约是相同的。对于ThinPrep(TP)和SurePath(SP)介质均是如此。这说明本文描述的组合物和方法可作为样品中的细胞的直接化学裂解，无需其它酶或化学裂解步骤。
实施例11：通过用于直接化学裂解的稀释剂从储存于SurePathLBC介质中的源自患者的细胞进行Viper DNA提取的能力
将储存于SurePath LBC中一个月的C33A细胞稀释至108，107，106，105，104，103，500，250，125，62.5，31.25细胞/ml。在每种浓度中包括4个重复。将0.25ml每种浓度的SurePath细胞贮液(每种浓度0.25ml)与0.75ml HPV稀释剂(1.0M Tris，0.257M NaCl和1.0％TritonX-100(v/v)；pH为7.9)混合。稀释剂与样品混合之后，直接化学裂解组合物的最终的工作浓度是0.75M Tris-HCl，0.193M NaCl和0.75％Triton X-100(v/v)(pH为大约7.9)。稀释剂中的样品在120℃预温20分钟，然后冷却至室温。使用Viper XTR仪器提取这些样品(0.8ml)，并在400μL的最终体积中洗脱。将DNA洗脱液(20μL)与PCR主混合物(5μL)混合，进行实时PCR以定量提取的HBB DNA的拷贝数。以100,000，10,000，1000，100，10，1个拷贝/反应向PCR中加入纯化的人基因组DNA，并用于样品DNA定量。根据由实时PCR定量的提取的HBB的拷贝数和基于输入细胞数的HBB总拷贝数之比计算提取效率。
表11：Viper DNA提取能力：使用直接化学裂解然后进行DNA提取
  输入细胞数   提取效率
  2x107   0.440
  2x106   0.322
  2x105   0.526
  2x104   0.809
  2x103   0.731
  200   0.967
  100   0.499
  50   0.656
  25   0.614
  12.5   0.511
  6.25   0.345
  平均值   0.584
使用如上所述的稀释剂从SurePath介质的提取能力例示于表11。表11表明：使用SurePath介质中的人子宫颈癌细胞系作为模型系统，通过直接化学裂解，然后进行DNA提取，产生了大于6log的线性动态范围，其平均效率为58％。
实施例12：直接化学裂解HPV稀释剂与酶联免疫吸附检验(ELISA)蛋白生物标志物检测的相容性
将SiHa细胞在室温重悬于HPV稀释剂中，工作浓度为6.7x106细胞/ml，不进行稀释而使用，以及在磷酸盐缓冲盐水0.1％Tween中的1％牛血清白蛋白(BSA)中连续2倍稀释而使用。通过标准的夹心式酶联免疫吸附检验(ELISA)检测靶抗原。使用一抗使靶抗原结合至微孔板的表面，然后使用链霉亲和素和辣根过氧化物酶缀合的二抗和化学发光底物检测。图2显示了4种靶分析物中的每一种的结果(p16INK4a、HPV16E1E4、MCM2和MCM6)，其中靶抗原被容易地检出。通过两种靶抗原(MCM2和MCM6)的Western免疫印迹确认了抗原完整性，其中发现这两种靶蛋白都具有完整长度(大约100kD)，没有明显的降解产物(数据未显示)。这些结果证明：HPV稀释剂缓冲剂与蛋白生物标志物的回收和检测是相容的，可用于初步核酸检测，在此之前或之后进行蛋白生物标志物检测，以进一步改善或改进疾病检测。
本文引用的所有参考文献都通过引用方式全文并入本文，达到如同每个单独的公开物或专利或专利申请都具体和单独被指明通过引用方式为了所有目的全文并入本文中同样的程度。
可以不脱离本发明的精神和范围对其作出多种修改和变化，对于本领域技术人员是明显的。仅通过举例方式提供了如本文描述的具体实施方式，本发明仅受随附的权利要求以及这些权利要求所赋予的所有等同范围的限制。

Claims (30)

1.用于使用直接化学裂解测定的组合物，所述组合物包括：与基于液体的细胞学组合物或福尔马林固定的石蜡包埋的组合物组合的直接化学裂解组合物，所述直接化学裂解组合物包括：
a)缓冲剂成分，其包括缓冲剂组分和金属盐组分，其中所述金属盐组分选自氯化钠，氯化钾，乙酸钠和硫酸铵；其中所述缓冲剂组分的浓度是0.2M至2M，所述金属盐组分的浓度是0.01M至1M；和
b)非离子表面活性剂，其中所述非离子表面活性剂的浓度是0.01％至2％(v/v)；所述直接化学裂解组合物还包括
与样品储存组合物组合的生物样品；其中所述直接裂解组合物能够不经过离心而从样品储存组合物直接提取细胞；其中所述样品储存组合物包括基于液体的细胞学组合物或福尔马林固定的石蜡包埋的组合物。
2.权利要求1的用于使用直接化学裂解测定的组合物，其中pH是6.6至10。
3.权利要求1的用于使用直接化学裂解测定的组合物，其中缓冲剂组分选自三(羟基甲基)氨基甲烷和三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐。
4.权利要求3的用于使用直接化学裂解测定的组合物，其中所述非离子表面活性剂是基于聚乙二醇的非离子表面活性剂。
5.权利要求4的用于使用直接化学裂解测定的组合物，其中非离子表面活性剂选自聚氧乙烯(20)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和聚乙二醇辛基苯基醚。
6.权利要求5的用于使用直接化学裂解测定的组合物，其中缓冲剂组分是三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐，并且缓冲剂组分的浓度是0.75M，金属盐组分是NaCl，NaCl的浓度是0.19M，非离子表面活性剂是聚乙二醇辛基苯基醚，聚乙二醇辛基苯基醚的浓度是0.75％(v/v)。
7.权利要求6的用于使用直接化学裂解测定的组合物，还包括甘氨酸。
8.用于分析样品储存组合物中储存的生物样品的方法，包括：
将生物样品与基于液体的细胞学组合物或福尔马林固定的石蜡包埋的组合物并与直接化学裂解组合物组合，所述直接化学裂解组合物包括a)缓冲剂成分，其包括缓冲剂组分和金属盐组分，其中所述金属盐组分选自氯化钠，氯化钾，乙酸钠和硫酸铵；其中所述缓冲剂组分的浓度是0.2M至2M，所述金属盐组分的浓度是0.01M至1M；和b)非离子表面活性剂，其中所述非离子表面活性剂的浓度是0.01％至2％(v/v)；
从样品储存组合物中取出至少一部分样品，其中取出的部分也包括样品储存组合物；其中所述样品储存组合物包括基于液体的细胞学组合物或福尔马林固定的石蜡包埋的组合物；
不进行离心，将取出的样品部分在至少80℃的温度温育足以裂解取出的样品部分中的至少一部分细胞的时间段；
从取出的样品部分中提取靶物；和
检验取出的样品部分中的靶物。
9.权利要求8的方法，其中靶物是靶核酸并且检验是靶核酸的扩增检验。
10.权利要求9的方法，其中靶核酸是DNA。
11.权利要求9的方法，其中靶核酸是RNA。
12.权利要求8的方法，其中生物样品是血液样品。
13.权利要求8的方法，其中生物样品是选自下列的细胞：阴道细胞、子宫颈细胞、子宫颈内细胞、肛门细胞、脱落的细胞、口的细胞、喉细胞和腹膜细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞是通过拭子、刷子、扫帚或生物活组织检查收集的。
15.权利要求8的方法，其中样品储存组合物具有选自下列的至少一种组分：甲醛、甲酸、甲醇、乙醇、缓冲的福尔马林、EDTA、多肽、多聚氨基酸和多糖。
16.权利要求15的方法，其中样品储存组合物包括缓冲的福尔马林。
17.权利要求8的方法，其中在裂解和提取步骤之前，取出的样品部分与样品储存介质不进行另外的分离。
18.权利要求8的方法，其中直接化学裂解组合物的pH是6.6至10。
19.权利要求8的方法，其中所述金属盐是NaCl。
20.权利要求19的方法，其中缓冲剂组分是三(羟基甲基)氨基甲烷的酸式盐，并且缓冲剂的浓度是0.75M，NaCl的浓度是0.19M，非离子表面活性剂是聚乙二醇辛基苯基醚，聚乙二醇辛基苯基醚的浓度是0.75％(v/v)。
21.权利要求8的方法，其中提取步骤通过人工过程进行。
22.权利要求9的方法，其中扩增步骤通过人工过程进行。
23.权利要求9的方法，其中提取和扩增步骤通过自动化过程进行。
24.权利要求8的方法，其中靶物是蛋白质并且检验是针对蛋白质的检测检验。
25.权利要求24的方法，其中蛋白质是生物标志物。
26.权利要求25的方法，其中生物标志物选自抗体和抗原。
27.权利要求24的方法，其中检验是酶联免疫吸附检验(ELISA)。
28.用于从细胞成分提取靶分子的诊断试剂盒，其包括基于液体的细胞学组合物或福尔马林固定的石蜡包埋的组合物和直接化学裂解组合物，所述直接化学裂解组合物包括：a)缓冲剂成分，其包括缓冲剂组分和金属盐组分，其中所述金属盐组分选自氯化钠，氯化钾，乙酸钠和硫酸铵；其中所述缓冲剂组分的浓度是0.2M至2M，所述金属盐组分的浓度是0.01M至1M；和b)非离子表面活性剂，其中所述非离子表面活性剂的浓度是0.01％至2％(v/v)；所述直接化学裂解 组合物还包括生物样品，其中提供样品储存组合物以保存组织样品。
29.权利要求28的诊断试剂盒，其中金属盐是NaCl。
30.权利要求28的诊断试剂盒，其中直接化学裂解组合物的pH是7至9。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2473596T3 (en) * 2009-09-03 2018-01-22 Becton Dickinson Co METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIRECT CHEMICAL LYSIS
CN103421891B (zh) * 2013-03-26 2016-03-02 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种用于PCR检测的血浆miRNA制备方法
US9810610B2 (en) 2014-09-17 2017-11-07 Hologic, Inc. Method of partial lysis and assay
CN104862305A (zh) * 2015-06-17 2015-08-26 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于动物组织基因组dna和rna快速提取试剂盒及提取方法和应用
EP3222719B8 (en) * 2016-03-24 2021-03-17 Allflex Europe SAS Use of an aqueous composition for dissolving biomolecules from a tissue sample
CN107723240A (zh) * 2016-08-12 2018-02-23 微基生物科技（上海）有限公司 一种皮肤、口腔、生殖道样品中的微生物保存试剂及其制备方法和应用
CN112805389A (zh) 2018-10-01 2021-05-14 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
CN110272898B (zh) * 2019-07-11 2023-06-09 上海市浦东新区疾病预防控制中心 一种通用型微生物病原体裂解液及其应用
CN111057704B (zh) * 2019-12-31 2022-07-05 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种石蜡切片样本dna提取的脱蜡裂解结合液、试剂盒及方法
CN113957122B (zh) * 2020-07-21 2024-01-26 厦门赛尔吉亚医学检验所有限公司 一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3689633A (en) 1969-01-13 1972-09-05 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd Preparation of test sample for immunological assay of pregnancy of mares
DE2532183C3 (de) 1975-07-18 1982-03-04 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Polyionische isotonische Salzlösung zur Konservierung von Erythrozyten oder zur Perfusion und zur Konservierung von zur Transplantion bestimmter Organen
US4333847A (en) 1979-04-30 1982-06-08 P. B. Macedo Fixation by anion exchange of toxic materials in a glass matrix
US5248506A (en) 1986-03-19 1993-09-28 American National Red Cross Synthetic, plasma-free, transfusible storage medium for red blood cells and platelets
GB8915759D0 (en) 1989-07-10 1989-08-31 Shandon Scient Ltd Cell block preparation
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
US4997932A (en) 1989-11-13 1991-03-05 Boehringer Mannheim Corporation Method and kit for purifying nucleic acids
US5136025A (en) 1990-04-04 1992-08-04 California Biotechnology Inc. Method to purify basic fibroblast growth factor
US5700636A (en) 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
US5256571A (en) 1991-05-01 1993-10-26 Cytyc Corporation Cell preservative solution
CA2218875C (en) 1991-07-23 2000-11-07 The Research Foundation Of State University Of New York Improvements in the in situ pcr
AU664050B2 (en) 1991-12-18 1995-11-02 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
ES2151494T3 (es) * 1992-03-05 2001-01-01 Becton Dickinson Co Metodo para la preparacion y analisis de leucocitos en sangre completa mediante la utilizacion de citometria de flujo.
WO1994026867A1 (en) 1993-05-06 1994-11-24 Abbott Laboratories Direct lysis buffer and the detection of hiv-1 plasma viremia
CA2129773C (en) 1993-09-02 2007-05-01 Michael Klaus Aromatic carboxylic acid derivatives
AU682538B2 (en) * 1993-11-16 1997-10-09 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
JP3866762B2 (ja) 1993-11-29 2007-01-10 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
US5545555A (en) 1994-07-25 1996-08-13 Microtest, Inc. Microbial transport media
BR9606653A (pt) 1995-09-21 1997-11-04 Becton Dickinson Co Detecção de ácidos nucléicos em células por amplificação de deslocamento de fita termofilica
US5620869A (en) 1995-09-28 1997-04-15 Becton, Dickinson And Company Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions
WO1998016261A1 (en) 1996-10-16 1998-04-23 Enviro-Mate Pty. Ltd. Method and apparatus for deodorisation and detoxification
CA2313483C (en) 1997-12-12 2017-12-05 Digene Corporation Assessment of human papilloma virus-related disease
US5958300A (en) 1998-02-06 1999-09-28 Genzyme Corporation Composition for patient sample preparation
US6265164B1 (en) 1998-03-26 2001-07-24 Biochain Institute, Inc. Compositions and methods for directly and rapidly analyzing the biochemical components of microorganisms
EP0953635B1 (en) * 1998-04-28 2012-08-29 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Improved methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues
US6245568B1 (en) * 1999-03-26 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles
AU3475299A (en) 1999-04-06 2000-10-23 Genzyme Corporation Composition for patient sample preparation
US6916608B2 (en) 1999-09-10 2005-07-12 Becton, Dickinson And Company Composition for providing long term stability to cells for diagnostic testing
JP3580801B2 (ja) * 2001-08-01 2004-10-27 富士写真フイルム株式会社 核酸の分離精製方法
WO2003023062A2 (en) 2001-09-13 2003-03-20 Sonic Clinical Institute Pty Limited Method of diagnosis for c.trachomatis infection using dna amplification assay on liquid cytology samples
US20050032105A1 (en) 2001-10-12 2005-02-10 Bair Robert Jackson Compositions and methods for using a solid support to purify DNA
RU2253430C2 (ru) 2002-03-19 2005-06-10 Комкин Андрей Викторович Устройство для пассивно-активной гимнастики пальцев "пальчиковый бассейн"
US20050181363A1 (en) 2002-05-21 2005-08-18 Arkray, Inc. Method of effecting lysis of acid-fast bacteria and method of performing gene amplification or detection therewith
US20040022764A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
US20040038213A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-26 Kwon Jai W. Genotyping by in situ PCR amplification of a polynucleotide in a tissue biopsy
JP2006507818A (ja) * 2002-11-01 2006-03-09 プロメガ　コーポレイション 細胞溶解のための組成物、使用方法、装置およびキット
JP2007516729A (ja) * 2003-12-30 2007-06-28 シグマ−アルドリッチ・カンパニー 酵素消化による核酸の迅速な調製
EP1766072B1 (en) 2004-06-03 2010-08-04 AdvanDx, Inc. Hybridization of pna probes in alcohol solutions
AU2005277527A1 (en) 2004-08-18 2006-03-02 Preanalytix Gmbh Additive, method, and article for DNA collection, stabilization, and purification
EP1812601A2 (en) * 2004-10-22 2007-08-01 Redpath Integrated Pathology, Inc. Dynamic genomic deletion expansion and formulation of molecular marker panels for integrated molecular pathology diagnosis and characterization of tissue, cellular fluid, and pure fluid specimens
AU2005305012C1 (en) 2004-11-05 2012-07-19 Qiagen North American Holdings, Inc. Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents
DE102004055615A1 (de) 2004-11-16 2006-05-18 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf In vitro aus Knochenmarkstammzellen differenzierte Retina-spezifische Zellen, ihre Herstellung und Verwendung
EP1869081A4 (en) 2005-04-07 2009-03-18 Univ South Florida POP2 NFKB-INHIBIVING POLYPEPTIDES, NUCLEIC ACIDS AND METHOD OF USE
US20060286557A1 (en) * 2005-06-15 2006-12-21 Basehore Lee S Combined lysis and PCR buffer
JP2007117084A (ja) * 2005-09-28 2007-05-17 Fujifilm Corp 核酸抽出法
JP2008043332A (ja) 2006-08-17 2008-02-28 Panomics Inc 組織スライドからの核酸定量
NZ584308A (en) * 2007-10-01 2012-04-27 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection and transport system for nucleic acids and methods of use
US9207240B2 (en) * 2007-11-14 2015-12-08 Arbor Vita Corporation Method of efficient extraction of protein from cells
DE102008026058A1 (de) * 2008-05-30 2009-12-03 Qiagen Gmbh Lyse, Binde- und/oder Waschreagenz verwendbar zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren
DK2473596T3 (en) * 2009-09-03 2018-01-22 Becton Dickinson Co METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIRECT CHEMICAL LYSIS
AU2010291990B2 (en) 2009-09-14 2016-05-05 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
内蒙古绒山羊m tDNA 的分离纯化及RFLP的分析;张文广 等人;《内蒙古大学学报》;20000330;第21卷(第1期);全文 *

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