CN103421891B - 一种用于PCR检测的血浆miRNA制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种制备血浆中小RNA分子的方法。该方法基于提取液与血浆混合、加热，在表面活性剂、中性盐和加热作用下，经高速离心，获取含有miRNA分子的上清液，用于miRNA的PCR检测。该技术方法适用于临床样品中miRNA制备，可用于疾病诊断分析。
Description
技术领域本发明涉及一种用于聚合酶链式反应(PCR)检测血浆中miRNA的血浆miRNA制备方法。
背景技术微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长度在22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子，主要通过与靶mRNA的3′端非翻译区(UTR)结合，降解或者抑制mRNA翻译生成蛋白质，广泛参与基因表达调控。研究发现miRNA分子的表达异常与多种疾病的发生和发展密切相关，是包括肿瘤在内的多种疾病的诊断和治疗的靶分子。特别是miRNA分子在人血浆中能够稳定存在，现在已经成为疾病诊断的重要可选标志物分子。目前血浆miRNA分子的检测主要是采用实时定量PCR方法，因此需要制备血浆中的miRNA。现在通用的方法是利用胍类和酚试剂提取血浆中的miRNA，代表性的试剂包括Invitrogen公司的Trizol和Sigma公司的TRIReagent试剂。虽然这些试剂在制备血浆miRNA中得到了成功的应用，但是，存在操作步骤多、耗时长，血浆用量大、使用成本高的不足。为了满足临床检测要求操作简单、快速、准确、低成本的要求，本发明提供了一种操作简单快捷、成本低廉、耗时少、血浆用量少的适用于PCR法检测血浆中miRNA的血浆miRNA制备方法。
发明内容本发明的目的是建立一种用于PCR检测的血浆miRNA制备方法。该方法的特征是在制备血浆中的miRNA的提取液中加入表面活性剂和中性盐，该方法的主要原理是：提取液与血浆混合加热，在表面活性剂、中性盐和加热作用下，使血浆中的结合状态miRNA游离出来，经高速离心，获取含有miRNA分子的上清液，用于miRNA的PCR检测。该提取液的主要成分是壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、氯化钠和水。在提取液中的浓度范围是0.5％～1.5％，中性盐在血浆miRNA提取液中的浓度范围是0.1mol/L～0.4mol/L。通常可以选用1％的NP-40浓度和0.3mol/L的NaCl浓度。在制备血浆中miRNA时，在制备血浆miRNA过程中提取液与血浆用量的比例为体积比1∶1，血浆的用量范围为20微升～200微升。通常使用20微升血浆即可得到预期的结果。血浆与提取液混合后，可在65℃～100℃范围内加热，加热时间为5分钟～10分钟，通常加热5分钟即可。加热后经12,000r/min离心15分钟，回收上清液。获得上清液即可以用于PCR方法检测miRNA分子。如用于基于poly(A)加尾的反转录PCR检测miRNA等方法。本方法的特点是简单、快速、成本低，临床采指血的血浆量就可以完成检测。本方法非常适用于临床血浆样本中miRNA的检测分析。
为了检测使用方便，可依据本方法组装试剂盒。试剂盒的组成包括NP-40、氯化钠和水。
附图说明
图1.同一样本不同血浆用量制备miRNA的检测结果。A和B代表不同的血浆样本。纵坐标是实时定量聚合酶链式反应的循环数(Ct值)，横坐标是制备时不同血浆用量。
图2.不同样本血浆重复制备miRNA的检测结果。A和B代表检测相同样本中的不同miRNA。纵坐标是实时定量聚合酶链式反应的循环数(Ct值)，横坐标是不同样本。
具体实施方式
本发明用以下实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
检测不同血浆用量对血浆miRNA回收量的影响。
1.血浆miRNA制备：分别取2例样本血浆，血浆用量分别为20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，相应加入miRNA提取液(提取液组成：NP-40含量为1％，氯化钠含量为0.3mol/L)20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，混匀，100℃加热5分钟。加热后经12,000r/min离心15分钟，个样品管分别回收上清液20μl、40μl、60μl、80μl、100μl。获得上清液即可以用于PCR方法检测miRNA分子。
2.poly(A)加尾RT-PCR法检测制备miRNA：
A.miRNA加尾：miRNA加尾使用NEWENGLANDBioLabs公司E.colipoly(A)聚合酶试剂盒，将提取到的RNA取17.6μl按照试剂说明书配制20μl加尾体系，置于37℃水浴1h。
B.反转录：miRNA反转录使用PROMEGA公司ImProm-IITM反转录酶试剂盒试剂盒，在加尾后20μl体系中加入2μg反转录引物(5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)18VN-3′)(1μg/μl)，70℃水浴5分钟，冰浴5分钟。加入8μl5×反转录缓冲液，4.8μlMgCl2(25mmol/L)，2μldNTP(10mmol/L)，0.2μlDEPC水，1μlRNase抑制剂(40u/μl)，2μl反转录酶，配制40μl反应体系。反应条件为42℃1h，70℃15分钟，25℃5分钟，反转录所得cDNA可置于-20℃保存。
C.实时定量PCR：实时定量PCR使用QIAGEN公司QuantiTectTMSYBRGreenPCRMasterMix试剂，按照10μlMix、8μl水、1μlcDNA、1μl引物(反向公用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；正向引物分别为：miR-21引物5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，miR-25引物5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，miR-92引物5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT-3′)配制20μl实时定量反应体系。反应条件为95℃变性15分钟，(95℃10s，60℃30s，72℃30s)40个循环，进行熔解曲线分析，一个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，95℃1分钟)。每个样品检测两个重复。
图1中A和B分别为检测两个血浆样本中三种不同miR-21、miR-25和miR-92的poly(A)加尾RT-PCR检测结果。在miRNA制备过程中分别取20μl、40μl、60μl、80μl、100μl的血浆样本，但在poly(A)加尾时加入的相对于血浆的量是相同的，结果表明本发明中的血浆RNA提取液在不同的血浆样本的miRNA制备中有很好的制备回收率。
实施例2
检测不同样本血浆制备miRNA的重复性。
血浆miRNA的制备、miRNA加尾、反转录和实时定量PCR方法同实施例1。取4例不同血浆样本，制备miRNA的血浆用量均为20μl，每个样本重复制备检测3次。图2中A和B为检测4例不同样本中miR-21和miR-25的结果。每个样本的三次重复制备检测结果表明本发明中的血浆RNA提取液提取血浆RNA具有很好的可重复性。
Claims (4)
1.一种血浆miRNA制备方法，其特征在于制备血浆中的miRNA提取液由1％的壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、0.3mol/L氯化钠和水配制，将提取液与血浆混合、加热、离心，回收含有miRNA分子的上清液，用于miRNA的PCR检测。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在制备血浆miRNA过程中加热温度为65℃～100℃，加热时间为5分钟～10分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在制备血浆miRNA过程中提取液与血浆用量的比例为体积比1∶1，血浆的用量范围为20微升～200微升。
4.一种用于制备血浆miRNA的试剂盒，其特征在于：试剂盒由1％的壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、0.3mol/L氯化钠和水组成。
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