CN107326092B - 大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒 - Google Patents

大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒。hsa‑miR‑92a‑1‑5p、hsa‑miR‑125b‑5p和hsa‑miR‑218‑5p的表达量高低与大肠癌存在密切的关联性，因此，hsa‑miR‑92a‑1‑5p、hsa‑miR‑125b‑5p和hsa‑miR‑218‑5p能够作为大肠癌的生物标志物应用在制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中。基于上述生物标志物研发的大肠癌检测试剂，对大肠癌的检测具有较高的敏感度和较强的特异性，有利于大肠癌的筛查和早期诊断。

Description

大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌的检测试剂盒。
背景技术
大肠癌(Colorectal cancer，CRC)是由大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，为常见的消化道恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌(都是大肠的一部分)。大肠癌是世界上第三大肿瘤，其年新发病例大约为一百万，年死亡人数超过五十万。近年来，由于我国人民生活方式、饮食结构、环境因素等的改变，大肠癌的发病率及死亡率呈逐年上升趋势。
大肠癌诊断主要有三类：X线检查、乙状结肠镜和纤维结肠镜检查以及癌胚抗原(CEA)试验。X线检查是诊断大肠癌的有效手段，但对于直径小于2cm的早期癌显示常有困难。癌胚抗原试验由于特异性、敏感性有限，对早期病例的诊断价值也不大。乙状结肠镜和纤维结肠镜检查虽然准确性高，但乙状结肠镜和纤维结肠镜检均具有一定的痛苦，患者难以接受，且乙状结肠镜和纤维结肠镜检均对早期的大肠癌不敏感。随着人体基因组测序完成及高通量测序技术的高速发展，基因筛查成为大肠癌诊断的方向。其中，癌胚抗原(CEA)对大肠癌的检测缺乏特异性及敏感度，不利于对早期大肠癌的诊断。
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，miRNA能够与靶基因mRNA的3’端完全或部分匹配互补结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译从而调控靶基因的表达。
然而，传统的大肠癌的检测试剂或试剂盒特异性和敏感度较低，需要同时检测大量的miRNA，才能得到初步的判断，操作相对比较复杂，工作量较大。
发明内容
基于此，有必提供一种具有较高特异性和较高敏感度且操作简单的大肠癌检测试剂盒。
此外，还提供一种大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用。
hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p作为生物标志物在制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中的应用。
hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p均属于miRNA。发明人在大肠癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p在大肠癌病人和健康人的体内的表达差异较大，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的表达量与大肠癌具有较高相关性，且hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p在体外很稳定，因此，能够作为生物标志物应用于制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中。经实验验证，通过基于上述生物标志物研发的大肠癌检测试剂盒对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的联合检测，得到的结果对大肠癌的检测具有较高的敏感度和特异性，能够应用于大肠癌的筛查和早期诊断。此外，过基于上述生物标志物研发的大肠癌检测试剂盒仅需要对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p三个miRNA进行检测，即可得到对大肠癌的检测具有较高的敏感度和特异性的结果，操作简单且方便，工作量小。
一种大肠癌检测试剂盒，包括与生物标志物特异性结合的检测物，所述生物标志物包括hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p。
其中一个实施例中，所述与生物标志物特异性结合的检测物包括能够扩增所述生物标志物的引物或能够检测所述生物标志物的探针。
其中一个实施例中，所述与生物标志物特异性结合的检测物包括生物标志物PCR扩增正向引物和生物标志物PCR扩增反向引物；
所述生物标志物PCR扩增正向引物包括第一正向引物、第二正向引物和第三正向引物，所述第一正向引物针对所述hsa-miR-92a-1-5p逆转录后得到的cDNA设计，所述第二正向引物针对所述hsa-miR-125b-5p逆转录后得到的cDNA设计，所述第三正向引物针对所述hsa-miR-218-5p逆转录后得到的cDNA设计。
其中一个实施例中，所述第一正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示；及/或，所述第二正向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；及/或，所述第三正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
其中一个实施例中，所述生物标志物PCR扩增反向引物为通用反向扩增引物，所述生物标志物PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
其中一个实施例中，还包括RNA提取试剂、加A尾试剂和RNA逆转录试剂；
所述RNA提取试剂用于提取待测样品中的RNA；
所述加A尾试剂用于在提取的所述RNA的一端加A碱基；
所述RNA逆转录试剂用于将加A尾后的所述RNA逆转录成cDNA。
其中一个实施例中，所述RNA逆转录试剂包括RNA逆转录引物，所述RNA逆转录引物为通用RNA逆转录引物，所述通用RNA逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
其中一个实施例中，还包括能够检测内参基因的试剂，所述内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
其中一个实施例中，所述能够检测内参基因的试剂包括内参基因RNA逆转录引物、内参基因PCR扩增正向引物和内参基因PCR扩增反向引物，其中，所述内参基因PCR扩增正向引物针对所述内参基因逆转录后得到的cDNA设计。
附图说明
图1为测试一中生物标志物hsa-miR-92a-1-5p在大肠癌病人和健康人的血浆中表达水平的分布图；
图2为测试一中生物标志物hsa-miR-125b-5p在大肠癌病人和健康人的血浆中表达水平的分布图；
图3为测试一中生物标志物hsa-miR-218-5p在大肠癌病人和健康人的血浆中表达水平的分布图；
图4为采用实施例1的大肠癌的检测试剂盒检测区分大肠癌病人和健康人的敏感性和特异性的ROC曲线图；
图5为采用实施例2的大肠癌的检测试剂盒检测区分大肠癌病人和健康人的敏感性和特异性的ROC曲线图；
图6为采用实施例3的大肠癌的检测试剂盒检测区分大肠癌病人和健康人的敏感性和特异性的ROC曲线图；
图7为采用实施例4的大肠癌的检测试剂盒检测区分大肠癌病人和健康人的敏感性和特异性的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。未特别说明，序列表中的碱基序列均为从5’端到3’端的顺序。
一实施方式的应用，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p作为生物标志物在制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中的应用。
具体地，生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。
具体地，hsa-miR-92a-1-5p是人源的miR-92a家族成员之一，其前体hsa-miR-92a-1来自染色体13q31～32，而hsa-miR-92a-1-5p由hsa-miR-92a-1的5’末端加工而来，与3’末端加工而来的miRNA具有不同的表达量。目前关于hsa-miR-92a-1-5p的报道较少。本研究意外发现在大肠癌病人与健康人中hsa-miR-92a-1-5p的表达量具有明显的差异。实验结果表明，与健康人相比，hsa-miR-92a-1-5p的表达量下降了5.27倍。
具体地，hsa-miR-125b-5p是人源的miR-125b家族成员之一。目前关于hsa-miR-125b-5p的报道较少。本研究意外发现在大肠癌病人者与健康人中hsa-miR-125b-5p的表达量具有明显的差异。实验结果表明，与健康人相比，hsa-miR-125b-5p的表达量下降了4.21倍。
具体地，hsa-miR-218-5p是人源的miR-218家族成员之一。目前关于miR-218的报道较少。本研究意外发现在大肠癌病人与健康人中miR-218的表达量具有显著性的差异。实验结果表明，与健康人相比，hsa-miR-198的表达量下降了2.43倍。
hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p三种miRNA在早期大肠癌的病人中能够被检测且表达量与健康人有一定的差异。因此hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p能够作为检测早期大肠癌的生物标记物，用于大肠癌早期诊断、预测治疗或监测复发等。
进一步地，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p均能够稳定的存在血清和血浆等多种体液中，属于循环miRNA。血清、血浆这些血循环中miRNA经过长期保存、反复冻融后仍可稳定存在而不发生降解，因此，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p作为大肠癌的生物标记物能够准确反应被检测对象中生物标志物的含量或水平。
在一实施方式中，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p作为生物标志物应用在制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中。
发明人在大肠癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p在大肠癌病人和健康人的体内的表达差异较大，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的表达量与大肠癌具有较高相关性，且hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p在体外很稳定，因此，能够作为生物标志物应用于制备大肠癌检测试剂、大肠癌检测试剂盒或大肠癌检测装置中。经实验验证，通过基于上述生物标志物研发的大肠癌的检测试剂盒对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的联合检测，得到的结果对大肠癌的检测具有较高的敏感度和特异性，能够应用于大肠癌的筛查和早期诊断。此外，过基于上述生物标志物研发的大肠癌的检测试剂盒仅需要对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p三个miRNA进行检测，即可得到对大肠癌的检测具有较高的敏感度和特异性的结果，操作简单且方便，工作量小。
一实施方式的大肠癌的检测试剂盒，包括与生物标志物特异性结合的检测物，该生物标志物包括hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p。
具体地，hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p具体的信息请参见前文描述。
当然，需要说明的是，生物标志物不限于上述生物标志物，还可以包括其他与大肠癌表达相关的miRNA。
在一个实施方式中，与生物标志物特异性结合的检测物为能够扩增该生物标志物的引物或能够检测该生物标志物的探针。通过扩增该生物标志物的引物或检测该生物标志物的探针定量或定性的测定生物标志物hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的含量。
在一实施方式中，该大肠癌检测试剂盒包括与生物标志物特异性结合的检测物、RNA提取试剂、加A尾试剂、RNA逆转录试剂和检测内参基因的试剂。
具体地，与生物标志物特异性结合的检测物包括生物标志物PCR扩增正向引物和生物标志物PCR扩增反向引物。生物标志物PCR扩增正向引物包括第一正向引物、第二正向引物和第三正向引物。其中，第一正向引物针对hsa-miR-92a-1-5p逆转录后得到的cDNA设计，第二正向引物针对hsa-miR-125b-5p逆转录后得到的cDNA设计，第三正向引物针对hsa-miR-218-5p逆转录后得到的cDNA设计。通过生物标志物PCR扩增正向引物和生物标志物PCR扩增反向引物扩增待测样品中hsa-miR-92a-1-5p的cDNA、hsa-miR-125b-5p的cDNA和hsa-miR-218-5p的cDNA，计算获得待测样品中hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的含量。
具体地，第一正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
具体地，第二正向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
具体地，第三正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
具体地，生物标志物PCR扩增反向引物为通用反向扩增引物。生物标志物PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。当然，需要说明的是，生物标志物PCR扩增反向引物也可以为针对不同的生物标志物逆转录后得到的cDNA而设计的具有特异性的生物标志物PCR扩增反向引物。
分别针对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p设计特异性的正向引物，以特异性地扩增对应的目标片段，计算获得待测样品中hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的含量。
进一步地，该大肠癌检测试剂盒还包括生物标志物PCR反应常用的DNA聚合酶和试剂，能够和与生物标志物特异性结合的检测物相互配合，以实现对生物标志物的检测。
DNA聚合酶是细胞复制DNA中的重要作用酶，在特定的条件下能够诱导DNA链的复制延长，DNA聚合酶一般以DNA为复制模板，将DNA由5'端向3'端延伸。其中，DNA聚合酶选自T4DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。
试剂包括缓冲液、dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP)、荧光染料和稳定剂。
具体地，RNA提取试剂用于提取待测样品中的RNA。RNA提取试剂包括提取待测样品RNA常用的试剂，如Trizol试剂、氯仿及异丙醇等。
具体地，加A尾试剂用于在提取的RNA的一端加A碱基，从而防止提取的RNA在细胞中受到核酶降解，增强RNA的稳定性，同时，还有利于RNA从细胞核转运到细胞质中。当然，需要说明的是，可以根据需要选择加入的A碱基的数量。优选地，通过加A尾试剂在提取的RNA的一端加12个以上A碱基，例如12个～20个。
具体地地，RNA逆转录试剂用于将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。将加A尾后的RNA逆转录成cDNA再检测，有利于提高检测的灵敏性。
具体地，RNA逆转录试剂包括RNA逆转录引物。该RNA逆转录引物为通用RNA逆转录引物，能够特异性地将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。
在一个实施方式中，RNA逆转录引物包括针对保守区域设计的片段以及针对A尾设计的片段和简并碱基。尾端设计简并碱基有利于引物与扩增片段结合。
进一步地，通用RNA逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示。简并碱基V表示碱基A或碱基C或碱基G，简并碱基N表示碱基A或碱基C或碱基G或碱基T。当然，需要说明的是，生物标志物的RNA逆转录引物也可以为针对不同的生物标志物而设计的具有特异性的RNA逆转录引物。
在一个实施方式中，检测内参基因的试剂包括内参基因RNA逆转录引物、内参基因PCR扩增正向引物和内参基因PCR扩增反向引物。其中，内参基因PCR扩增正向引物针对内参基因逆转录后得到的cDNA设计。通过检测内参基因的试剂检测内参基因的含量，以此为基准计算hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的含量，从而校正生物标志物的检测过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
具体地，内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
在一个实施方式中，内参基因为U6。因为U6是由RNA聚合酶III转录而成的snRNA，在细胞和生物体内的表达稳定，能够提高该大肠癌的检测试剂盒的对大肠癌检测的准确性。U6逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。内参基因PCR扩增正向引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示。内参基因PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。
可以理解，内参基因的检测试剂还可以包括检测内参基因常用的酶和试剂。
上述大肠癌的检测试剂盒，通过RNA提取试剂提取待测样品中的RNA，通过加A尾试剂在提取的RNA的一端加A碱基，通过RNA逆转录试剂将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。然后通过设计的与生物标志物特异性结合的检测物检测生物标志物hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p或hsa-miR-218-5p的含量。上述大肠癌的检测试剂盒通过对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的联合检测，得到的结果具有较高的敏感度和较高的特异性，有利于大肠癌的筛查和早期诊断，对推动我国大肠癌的早期诊断具有重要的临床应用价值。此外，上述大肠癌的检测试剂盒仅需要对hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p三个miRNA进行检测，就可得到具有较高的敏感度和较强的特异性的结果，操作简单且方便，工作量小。
当然，可以理解，在其他实施方式的检测试剂盒中，当已经将检测样品中的RNA提取，并加A尾逆转录成cDNA时，RNA提取试剂、加A尾试剂和RNA逆转录试剂可省略。当同一样本已经确定并测定内参含量时，检测内参基因的试剂也可省略。
一实施方式的上述大肠癌检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤S110～S140。
步骤S110：通过RNA提取试剂提取待测样品中的RNA。
具体地，待测样品例如为血浆，通过RNA提取试剂提取血浆中的总RNA。
步骤S120：通过加A尾试剂在S110中提取的RNA的一端加A碱基。
具体地，在提取的RNA的一端加12个以上A碱基，例如12个～20个。
步骤S130：通过RNA逆转录试剂将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。
具体地，将RNA逆转录引物为通用逆转录引物，RNA逆转录引物的碱基序列如SEQID No.5所示。
具体地，以加A尾后RNA为模板，通过逆转录PCR反应将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。逆转录PCR反应体系为2μM的通用RNA逆转录引物1pmoL，5×逆转录缓冲液4μL，逆转录酶1μL，RNA模板5μL，增加DEPC水至总体积20μL。
具体地，还包括在相同的条件下通过内参基因逆转录引物将加A尾后的RNA逆转录成内参基因cDNA。
在一实施方式中，内参基因逆转录引物为U6逆转录引物，U6逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。
具体地，以加A尾后U6的RNA为模板，通过逆转录PCR反应将加A尾后的RNA逆转录成cDNA。逆转录PCR反应体系为2μM的通用RNA逆转录引物1pmoL，5×逆转录缓冲液4μL，逆转录酶1μL，U6的RNA模板5μL，增加DEPC水至总体积20μL。
步骤S140：用与生物标志物特异性结合的检测物检测hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p或hsa-miR-218-5p的含量。
具体地，与生物标志物特异性结合的检测物包括生物标志物PCR扩增正向引物和生物标志物PCR扩增反向引物。PCR扩增正向引物包括第一正向引物、第二正向引物和第三正向引物。第一正向引物针对hsa-miR-92a-1-5p逆转录后得到的cDNA设计。第二正向引物针对hsa-miR-125b-5p逆转录后得到的cDNA设计。第三正向引物针对hsa-miR-218-5p逆转录后得到的cDNA设计。第一正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示。第二正向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。第三正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。生物标志物PCR扩增反向引物通用反向扩增引物，生物标志物PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
具体地，通过荧光定量PCR反应检测生物标志物hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p或hsa-miR-218-5p的含量。PCR扩增体系为PCR缓冲液5μL，0.5μM的正向引物1μL，0.5μM的PCR扩增通用反向引物1μL，模板cDNA 1μL，增加RNase-freewater至总体积10μL。当正向引物为第一正向引物时，PCR检测获得扩增hsa-miR-92a-1-5p的Ct值(循环数)。当正向引物为第二正向引物时，PCR检测获得扩增hsa-miR-125b-5p的Ct值。当正向引物为第三正向引物时，PCR检测获得扩增hsa-miR-218-5p的Ct值。
具体地，还包括在在相同的条件下用内参基因PCR扩增正向引物和内参基因PCR扩增反向引物检测内参基因的含量。
在一个实施方式中，内参基因为U6。U6的PCR扩增正向引物的碱基序列如SEQ IDNo.7所示。U6的PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。
具体地，内参基因PCR扩增体系为PCR缓冲液5μL，0.5μM的内参基因PCR扩增正向引物1μL，0.5μM的内参基因PCR扩增反向引物1μL，内参基因的cDNA 1μL，增加RNase-freewater至总体积10μL。PCR检测获得扩增内参基因的Ct值。
将获得扩增hsa-miR-92a-1-5p的Ct值、扩增hsa-miR-125b-5p的Ct值、扩增hsa-miR-218-5p的Ct值减去扩增内参基因的Ct值，得到Ct值的差值(ΔCt值)。初步诊断该待测样品来源的样本是否为大肠癌患者、或患大肠癌的风险。
上述基于hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p作为大肠癌的生物标志物制备的大肠癌检测试剂，检测的灵敏度较高、特异性较高，检测结果快速客观，操作简单，能够应用于大肠癌早期检测中，在大肠癌临床诊断、大肠癌预防检测领域具有极大的应用前景。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
未特别说明，实施例中所使用的RNA提取试剂为miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒(#217184,购自Qiagen,Hilden,Germany)。加A尾试剂为Poly(A)Tailing Kit(#AM1350，购自Ambion，Austin,TX)。第一正向引物、第二正向引物、第三正向引物、生物标志物PCR扩增反向引物、RNA逆转录引物、U6逆转录引物、U6的PCR扩增正向引物、U6的PCR扩增反向引物通过基因合成的方式获得。第一正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示。第二正向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。第三正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。生物标志物PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。RNA逆转录引物的碱基序列如SEQ IDNo.5所示。U6逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。U6的PCR扩增正向引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示。U6的PCR扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。
实施例1
一种大肠癌检测试剂盒，内含有RNA提取试剂、加A尾试剂、第一正向引物、生物标志物PCR扩增反向引物、RNA逆转录引物、U6逆转录引物、U6的PCR扩增正向引物和U6的PCR扩增反向引物。该大肠癌检测试剂盒能够检测大肠癌生物标记物hsa-miR-92a-1-5p的表达量。
实施例2
一种大肠癌检测试剂盒，内含有RNA提取试剂、加A尾试剂、第二正向引物、生物标志物PCR扩增反向引物、RNA逆转录引物、U6逆转录引物、U6的PCR扩增正向引物和U6的PCR扩增反向引物。该大肠癌检测试剂盒能够检测大肠癌生物标记物hsa-miR-125b-5p的表达量。
实施例3
一种大肠癌检测试剂盒，内含有RNA提取试剂、加A尾试剂、第三正向引物、生物标志物PCR扩增反向引物、RNA逆转录引物、U6逆转录引物、U6的PCR扩增正向引物和U6的PCR扩增反向引物。该大肠癌检测试剂盒能够检测大肠癌生物标记物hsa-miR-218-5p的表达量。
实施例4
一种大肠癌检测试剂盒，内含有RNA提取试剂、加A尾试剂、第一正向引物、第二正向引物、第三正向引物、生物标志物PCR扩增反向引物、RNA逆转录引物、U6逆转录引物、U6的PCR扩增正向引物和U6的PCR扩增反向引物。该大肠癌检测试剂盒能够检测大肠癌生物标记物hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的表达量。
测试例一
1、实验样品
从南京肿瘤医院采集19个大肠癌病人的血浆样品及8个健康人的血浆样品，标本储存于-80℃环境中。
2、实验过程
(1)按照操作手册步骤用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒(#217184,Qiagen,Hilden,Germany)提取大肠癌病人和健康人的血浆中游离RNA。用Poly(A)Tailing Kit(#AM1350，Ambion，Austin，TX)按操作手册对miRNA进行加poly(A)尾，本测试例对miRNA加入12个A碱基。
(2)使用M-MuLV Reverse Transcriptase(#E6300S，NEB,Hitchin,UK)对加poly(A)的miRNA进行逆转录得到cDNA。
使用M-MuLV Reverse Transcriptase(#E6300S，NEB,Hitchin,UK)和U6逆转录引物按操作手册对加poly(A)的miRNA进行逆转录得到内参基因U6的cDNA，逆转录反应体系如下表1所示。
表1：内参基因U6的miRNA逆转录反应体系
成分 体积
模板RNA(加A尾后的miRNA) 5μL
5×Reverse Transcription Buffer 4μL
U6逆转录引物(2μM) 1pmoL
M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL
DEPC水 加至总体积为20μL
其中，内参基因U6的逆转录引物的碱基序列为：GGAACGCTTCACGAATTTG(SEQ IDNo.6所示)。
反应条件：37℃15分钟；85℃5秒。反应结束后，保存于-4℃。
继续使用M-MuLV Reverse Transcriptase(#E6300S，NEB,Hitchin,UK)和通用RNA逆转录引物按操作手册对加poly(A)的miRNA进行逆转录得到cDNA，逆转录反应体系如下表2所示。
表2：miRNA逆转录反应体系
成分 体积
模板RNA(加A尾后的miRNA) 5μL
5×Reverse Transcription Buffer 4μL
通用RNA逆转录引物(2μM) 1pmoL
M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL
DEPC水 加至总体积为20μL
其中，通用逆转录引物的碱基序列为：GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN(SEQ ID No.5所示)。
反应条件：37℃15分钟；85℃5秒。反应结束后，保存于-4℃。
(3)使用实时荧光定量PCR SsoFastTM
Figure BDA0001389714960000131
Supermix(BIO-RAD,Hercules,CA)对miRNA进行定量分析。
先采用实时荧光定量PCR检测扩增内参基因U6的Ct值，定量的反应体系如下表3所示。
表3：检测内参基因U6的PCR反应体系
Figure BDA0001389714960000141
其中，U6的PCR扩增正向引物的碱基序列为：ATTGGAACGATACAGAGAAGATT(SEQ IDNo.7所示)。
U6的PCR扩增反向引物的碱基序列的碱基序列为：GGAACGCTTCACGAATTTG(SEQ IDNo.8所示)。
反应条件：95℃2min；变性95℃20s，退火/延伸58℃40s，共40个循环。经检测，健康人提取的样本和大肠癌病人提取的样本中内参基因U6的Ct均在12～13之间，平均为12.45，两者差异不显著。
继续采用实时荧光定量PCR检测扩增生物标记物hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的Ct值，定量的反应体系如下表4所示。
表4：检测生物标记物的PCR反应体系
Figure BDA0001389714960000142
Figure BDA0001389714960000151
其中，第一正向引物(hsa-miR-92a-1-5p的定量正向引物)的碱基序列为：AGGTTGGGATCGGTTGCAATGCT(SEQ ID No.1所示)。
第二正向引物(hsa-miR-125b-5p的定量正向引物)的碱基序列为：TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA(SEQ ID No.2所示)。
第三正向引物(hsa-miR-218-5p的定量正向引物)的碱基序列为：TTGTGCTTGATCTAACCATGT(SEQ ID No.3所示)。
生物标志物PCR扩增反向引物(定量通用反向引物)的碱基序列为：GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID No.4所示)。
反应条件：95℃2min；变性95℃20s，退火/延伸58℃40s，共40个循环。分别获得扩增hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p的Ct值。
3、数据处理与分析
用每一个样本的Ct值减去内参基因的平均Ct值。分布的散点图如图1～图3所示。结果表明，与健康人相比，大肠癌病人的血浆中的hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p均存在较大表达差异。同时，大肠癌病人的血浆中的hsa-miR-92a-1-5p的总体表达水平比健康人的降低了5.27倍(P<0.05)，大肠癌病人的血浆中的hsa-miR-125b-5p的总体表达水平比健康人的降低了4.21倍(P<0.05)，大肠癌病人的血浆中的hsa-miR-218-5p的总体表达水平比健康人的降低了2.43倍(P<0.05)。hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p三种生物标记物的在健康人和大肠癌病人中均具有显著的差异性。
测试例二
(1)同样以南京肿瘤医院采集19个大肠癌患者的血浆样品及其8个健康人的血浆样品作为检测样本，每个检测样本至少3次重复。用实施例1(hsa-miR-92a-1-5p作为标记物)、实施例2(hsa-miR-125b-5p作为标记物)、实施例3(hsa-miR-218-5p作为标记物)和实施例4(hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p同时作为标志物)的试剂盒按上述测试例一的方法测试。结果如下表5所示。
表5：大肠癌病人与健康人的测试结果
Figure BDA0001389714960000161
如表5所示，实施例1～实施例4的检测试剂盒能够高特异性的检测区分大肠癌病人和健康人检测样本。
(2)分别以实施例1(hsa-miR-92a-1-5p作为大肠癌的标记物)的试剂盒、实施例2(hsa-miR-125b-5p作为大肠癌的标记物)的试剂盒、实施例3(hsa-miR-218-5p作为大肠癌的标记物)的试剂盒和实施例4(hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p同时作为大肠癌的标志物)的试剂盒检测区分健康人和大肠癌患者的检测数据，使用MedCalc软件进行分析，得到对于检测大肠癌病人和健康人对照的ROC曲线(受试者工作特征曲线)，从而确定实施例1～实施例4的试剂盒检测的准确度。其中，实施例1的ROC曲线见图4，实施例2的ROC曲线见图5，实施例3的ROC曲线见图6，实施例4的ROC曲线见图7，同时，实施例1～实施例4的ROC曲线下面积(AUC)见表6。
表6：实施例1～实施例4的ROC曲线下面积(AUC)
检测方式 敏感度(％) 特异性(％) AUC 95％置信区间
实施例1 47.37 100 0.737 0.533～0.886
实施例2 84.21 87.50 0.921 0.750～0.989
实施例3 84.21 100 0.901 0.724～0.982
实施例4 84.21 100 0.947 0.787～0.997
如图4～图7和表6所示，与实施例1～实施例3相比，实施例4的AUC最高，且实施例4的AUC为0.947，即实施例4的试剂盒对大肠癌的预测准确率为94.7％，95％置信区间为0.787～0.997，说明以hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p同时作为大肠癌的标志物检测区分健康人和大肠癌患者具有很高的准确性，灵敏度和特异性非常好，实施例4的试剂盒能够应用于大肠癌早期检测中，在大肠癌临床诊断、大肠癌预防检测领域具有极大的应用前景。此外，实施例2的AUC为0.921，95％置信区间为0.750～0.989，实施例3的AUC为0.901，95％置信区间为0.724～0.982，实施例2和实施例3的AUC均高于0.9，说明以hsa-miR-125b-5p或hsa-miR-218-5p作为大肠癌的标记物检测区分健康人和大肠癌患者也具有较高的准确性，灵敏度和特异性也较好，实施例2和实施例3的试剂盒也能够应用于大肠癌早期检测中，在大肠癌临床诊断、大肠癌预防检测领域具有较大的应用前景。实施例1的AUC为0.737，95％置信区间为0.533～0.886，说明以hsa-miR-92a-1-5p作为大肠癌的标记物检测区分健康人和大肠癌患者具有一定的准确性、敏感度和特异性，对大肠癌的筛查和诊断具有一定的指导意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市恩普电子技术有限公司
<120> 大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggttgggat cggttgcaat gct 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccctgagac cctaacttgt ga 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtgcttga tctaaccatg t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgagcacag aattaatacg ac 22
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgagcacag aattaatacg actcactata ggtttttttt ttttvn 46
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaacgcttc acgaatttg 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attggaacga tacagagaag att 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaacgcttc acgaatttg 19

Claims (10)

1.与生物标志物特异性结合的检测物在制备大肠癌检测试剂或大肠癌检测试剂盒中的应用；
所述生物标志物包括hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-218-5p；
所述生物标志物来源自人血浆；
所述与生物标志物特异性结合的检测物包括：
碱基序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物、碱基序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物、碱基序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物，以及碱基序列如SEQ ID No.4所示的通用反向扩增引物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、加A尾试剂和RNA逆转录试剂；
所述RNA提取试剂用于提取待测样品中的RNA；
所述加A尾试剂用于在提取的所述RNA的一端加A碱基；
所述RNA逆转录试剂用于将加A尾后的所述RNA逆转录成cDNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RNA逆转录试剂包括RNA逆转录引物，所述RNA逆转录引物为通用RNA逆转录引物，所述通用RNA逆转录引物的碱基序列如SEQ IDNo.5所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括能够检测内参基因的试剂，所述内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述能够检测内参基因的试剂包括内参基因RNA逆转录引物、内参基因PCR扩增正向引物和内参基因PCR扩增反向引物，其中，所述内参基因PCR扩增正向引物针对所述内参基因逆转录后得到的cDNA设计。
6.一种大肠癌检测试剂盒，其特征在于，包括碱基序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物、碱基序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物、碱基序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物，以及碱基序列如SEQ ID No.4所示的通用反向扩增引物。
7.根据权利要求6所述的大肠癌检测试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂、加A尾试剂和RNA逆转录试剂；
所述RNA提取试剂用于提取待测样品中的RNA；
所述加A尾试剂用于在提取的所述RNA的一端加A碱基；
所述RNA逆转录试剂用于将加A尾后的所述RNA逆转录成cDNA。
8.根据权利要求7所述的大肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述RNA逆转录试剂包括RNA逆转录引物，所述RNA逆转录引物为通用RNA逆转录引物，所述通用RNA逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
9.根据权利要求2所述的大肠癌检测试剂盒，其特征在于，还包括能够检测内参基因的试剂，所述内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的大肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述能够检测内参基因的试剂包括内参基因RNA逆转录引物、内参基因PCR扩增正向引物和内参基因PCR扩增反向引物，其中，所述内参基因PCR扩增正向引物针对所述内参基因逆转录后得到的cDNA设计。
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