CN110621788A - 用于膀胱癌监视的dna甲基化和突变分析方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及监测膀胱癌患者并且分析患者样品中甲基化DNA和任选的特定基因突变的存在的方法。在一些实施方案中，分析结果与临床结果指标(例如膀胱癌复发的风险)相关。

Description

用于膀胱癌监视的DNA甲基化和突变分析方法
技术领域
本公开文本涉及监测膀胱癌患者并且分析患者样品中甲基化DNA和任选的特定基因突变的存在的方法。在一些实施方案中，分析结果与临床结果指标(例如膀胱癌复发的风险)相关。
背景技术
膀胱癌是工业化国家中最常见的癌症之一，并且是诊断和监测最昂贵的癌症之一。(参见R.Siegel等人,CA Cancer J Clin 63:11-30(2013)；并且参见例如T.ReinertAdv.Urol.,文章ID 503271,doi:10.1155/2012/503271,第1-11页(2012)；还参见A.Feber等人,Clin.Epigenetics 9:8doi:10.1186/s13148-016-0303-5(2017))。例如，大多数新病例以非肌肉浸润性膀胱癌呈现，具有低转移概率，但是仍有发展为更具攻击性的疾病(例如，高级别、肌肉浸润性)的潜力，并且监测患者的疾病的更具攻击性形式的发展需要在相当长的一段时间(例如5年或更长时间)内进行频繁的监视，包括昂贵的和侵入性膀胱镜检查程序。(参见，例如，M.Babjuk等人Eur.Urol.59:997-1008(2011)；B.W.van Rhijn等人,Eur.Urol.56:430-42(2009)；M.F.Botteman等人,Pharmacoeconomics 21:1315-30(2003))。可以对一些患者进行例如膀胱镜检查以进行初步诊断，并且然后在手术治疗后三个月进行此检查，并且如果是阴性，然后在9个月至1年的间隔后进行此检查，持续接下来的5年。在某些高风险患者中，可以在手术后最高至2年中每3个月进行膀胱镜检查，在随后的3年中每6个月进行此检查，并且然后此后每年进行此检查。(参见Reinert，第1页。)因此，非侵入性诊断测试(例如，在此主动监视治疗时期期间作为膀胱镜检查的补充)可能会有所帮助，因为它们可以提供关于患者复发风险状态的其他信息。膀胱癌诊断测试的一个目标还在于在主动监视期间，允许消除或减少膀胱镜检查测试频率。
先前的研究表明，DNA甲基化(其中甲基基团添加到在CpG二核苷酸段中的胞嘧啶的第5个碳上)可能会在基因编码序列内部以及在人类基因组中的所谓CpG岛中出现。通常，CpG岛中的CpG二核苷酸在正常细胞中未甲基化，然而在基因编码区中的分离序列段中发现的CpG二核苷酸在正常细胞中可能被甲基化。与正常细胞相比，癌细胞中CpG岛区域外部的CpG二核苷酸的甲基化可能显著更低。(参见Reinert，第4页。)多项研究显示，膀胱癌细胞将DNA“泄漏”到尿液中，并且此DNA可以通过查看尿液样品中的基因的甲基化而被检测到。(同上第4-5页，表3。)本公开文本描述了通过检查尿沉渣样品中的DNA甲基化以及基因突变的存在来评估膀胱癌患者复发风险的基因集和算法。
发明内容
本申请公开了监测患有膀胱癌的患者的方法，所述方法包括，例如，从患者获得尿沉渣样品；对来自样品的DNA进行亚硫酸氢盐转化；对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行甲基化特异性定量PCR，以确定样品中来自基因集的甲基化DNA的量和/或浓度，所述基因集包含选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有非肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为Ta、Tis、T0或低级别。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为T1或高级别。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，所述方法在膀胱镜检查之前进行。在一些实施方案中，所述方法在阴性膀胱镜检查之后进行。在一些实施方案中，例如，作为主动监视访视的一部分，所述方法进行至少每年一次，例如每六个月一次，或每三个月一次。
在一些实施方案中，所述至少四种基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2。在一些实施方案中，所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。在一些实施方案中，所述基因集进一步包括选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的至少一种基因。在一些实施方案中，所述基因集包括以下基因集中的一个和至少一种参考基因：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB。在一些实施方案中，所述基因集由以下基因集中的一个组成：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定患者的复发风险或确定实际复发的存在，其包括将所述患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者参考组的甲基化的量和/或浓度进行比较。在一些实施方案中，所述患者先前已被诊断为具有低复发风险，并且进行了所述方法，例如，以确认此诊断和/或以确认不存在任何实际复发。在一些实施方案中，患者先前基于Ta或低级别肿瘤样品(包括来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查的组织)已被确定具有低复发风险。在一些实施方案中，低风险患者具有正常或异常的膀胱镜检查。在一些实施方案中，低风险患者具有正常或异常的细胞学检查。在一些实施方案中，所述患者先前已被诊断为具有高复发风险，并且进行了所述方法，例如，以确认此诊断和以确认不存在任何实际复发。例如，在一些实施方案中，患者先前基于高级别、T1-T2或Tis肿瘤样品(包括来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查的组织)已被确定具有高复发风险。在一些实施方案中，高风险患者具有正常或异常的膀胱镜检查。在一些实施方案中，高风险患者具有正常或异常的细胞学检查。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析经硫酸氢盐转化的DNA中FGFR3和TERT之一或两者中的突变。在一些实施方案中，所述FGFR3突变位于染色体位置ch4:1803568处，并且所述TERT突变位于染色体位置chr5:1295228处。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将FGFR3和/或TERT中突变的存在或不存在与膀胱癌患者参考组中FGFR3和TERT突变的发生进行比较。
本公开文本还涉及治疗具有低复发风险的膀胱癌患者的方法，其包括例如从所述患者获得尿沉渣样品；对来自样品的DNA进行亚硫酸氢盐转化；对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行甲基化特异性定量PCR，以确定样品中来自基因集的甲基化DNA的量和/或浓度，所述基因集包含选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因；通过将患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者的参考组的甲基化的量和/或浓度进行比较，来确定患者具有低复发风险；并且以主动监视来治疗患者。在一些实施方案中，例如，当通过所述方法确认患者的低风险状态时，以主动监视进行的治疗包括减少患者的膀胱镜检查的频率。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有非肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为Ta、Tis、T0或低级别。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为T1或高级别。在一些实施方案中，所述方法在膀胱镜检查之前进行。在一些实施方案中，所述方法在阴性膀胱镜检查之后进行。
在前述治疗方法的一些实施方案中，所述至少四种基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2。在一些实施方案中，所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。在一些实施方案中，所述基因集进一步包括选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的至少一种基因。在一些实施方案中，所述基因集包括以下基因集中的一个和至少一种参考基因：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB。在一些实施方案中，所述基因集由以下基因集中的一个组成：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析经硫酸氢盐转化的DNA中FGFR3和TERT之一或两者中的突变。在一些实施方案中，所述FGFR3突变位于染色体位置ch4:1803568处，并且所述TERT突变位于染色体位置chr5:1295228处。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将FGFR3和/或TERT中突变的存在或不存在与膀胱癌患者参考组的这些进行比较。
本公开文本还涉及对来自膀胱癌患者的尿沉渣样品中的DNA甲基化进行定量的系统。在一些实施方案中，所述系统可以包括(a)具有至少一个孔的至少一个盒，所述至少一个孔包含引物，所述引物用于扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA，其中所述盒被配置用于对所述基因进行甲基化特异性定量PCR，并且其中所述引物任选地附着于所述至少一个孔；(b)用于检测从每个基因扩增的DNA的检测设备；以及(c)用于定量来自所述基因的甲基化DNA的量和/或浓度的计算机软件，其中所述软件任选地比较患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者参考组的甲基化的量和/或浓度。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2和至少一种参考基因的基因集进行甲基化特异性定量PCR。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集包括以下基因集中的一个：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集由以下基因集中的一个组成：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。在一些实施方案中，引物附着于盒的至少一个孔。在一些实施方案中，所述盒进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。在一些实施方案中，所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。在一些实施方案中，所述系统能够在膀胱癌患者尿沉渣样品中进行前述甲基化定量方法。
本公开文本还涉及盒，其包含至少一个孔，所述至少一个孔包含引物，所述引物用于扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA，其中所述盒被配置用于对所述基因进行甲基化特异性定量PCR，并且其中所述引物任选地附着于所述至少一个孔。所述盒可以是前述系统的部件，或者它们可以独立于前述系统。例如，盒可以被配置为与各种检测装置和系统一起工作。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2和至少一种参考基因的基因集进行甲基化特异性定量PCR。在一些实施方案中，所述基因集包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述基因集包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集包括以下基因集中的一个：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集由以下基因集中的一个组成：(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在一些实施方案中，所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。在一些实施方案中，引物附着于盒的至少一个孔。在一些实施方案中，所述盒进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。在一些实施方案中，所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。前述盒可以用于前述方法和系统中。
本公开文本还考虑了包含前述盒的试剂盒。试剂盒可以进一步包含以下中的至少一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；和(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。所述试剂盒可以例如是前述系统的部件，并且可以用于进行本节前面所述的方法。在一些实施方案中，所述试剂盒包含以下的每一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一种检测试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于对DNA进行亚硫酸氢盐转化的至少一种试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。在一些此类的实施方案中，所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。本文的试剂盒可以进一步包含使用说明书。
本文还考虑了组合物，所述组合物包含引物集，所述引物集用于PCR扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA。在一些组合物中，所述引物集用于由选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因组成的一组基因。在本文的一些组合物中，所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2以及至少一种参考基因。在本文的一些组合物中，所述基因由MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2以及至少一种参考基因组成。在本文的一些组合物中，所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在本文的一些组合物中，所述基因由以下组成：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在本文的一些组合物中，所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。在本文的一些组合物中，所述基因由以下组成：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。本文的一些组合物包括用于基因集的甲基化特异性定量PCR的引物集，所述基因集包括：(a)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；或(i)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。本文的一些组合物包括用于基因集的甲基化特异性定量PCR的引物集，所述基因集由以下组成：(a)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；(b)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；(c)MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；(d)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；(e)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；(f)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；(g)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；(h)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；或(i)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。在本文的一些组合物中，所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。本文的一些组合物进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。在一些实施方案中，所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。本文的一些组合物进一步包含以下中的至少一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，所述组合物包含以下的每一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；和(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种检测试剂。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含用于对DNA进行亚硫酸氢盐转化的至少一种试剂。本文的组合物可以进一步是前述的系统、盒和试剂盒的组分，并且可以用于本节前面所述的方法。
附图说明
图1提供了针对如下的性能总结：根据M1加突变算法分析最初已被诊断为低复发风险的患者(“初始低风险”患者)的甲基化DNA的量，如下文实施例3所述。具体而言，图1提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性结果，用于预测在初始低风险库中的患者实际具有高复发风险。
图2提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA量的M1加突变分析的性能总结的进一步数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图2提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些低风险患者实际具有复发体征。
图3提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA量的M1加突变分析的性能总结的其他数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图3提供了基于图1和图2的数据的预测性曲线和ROC曲线。
图4提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA量的M1加突变分析的性能总结，如下文实施例3中所述。具体而言，图4提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些高风险患者实际具有高复发风险。
图5提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA量的M1加突变分析的性能总结的进一步数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图5提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些高风险患者实际具有复发体征。
图6提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA量的M1加突变分析的性能总结的其他数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图6提供了基于图4和图5的数据的预测性曲线和ROC曲线。
图7提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结，如下文实施例3中所述。具体而言，图1提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些低风险患者实际具有高复发风险。
图8提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结的进一步数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图8提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些低风险患者实际具有复发体征。
图9提供了对于初始低复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结的其他数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图9提供了基于图7和图8的数据的预测性曲线和ROC曲线。
图10提供了对于初始高复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结，如下文实施例3中所述。具体而言，图10提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些高风险患者实际具有高复发风险。
图11提供了对于初始高复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结的进一步数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图11提供了阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、灵敏性和特异性数据，用于预测那些高风险患者实际具有复发体征。
图12提供了对于初始高复发风险患者的甲基化DNA浓度的M1加突变分析的性能总结的其他数据，如下文实施例3中所述。具体而言，图12提供了基于图10和图11的数据的预测性曲线和ROC曲线。
图13示出了如本文所公开的甲基化测定方法中的步骤流程图。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology第2版、J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)和March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版、John Wiley&Sons(NewYork,NY 1992)，为本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的通用指南。
本领域技术人员将认识到与本文所述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限于本文所述的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文所用，术语“肿瘤”和“病变”是指所有肿瘤细胞(无论是恶性还是良性)生长和增殖，以及所有癌前的和癌的细胞和组织。本领域技术人员将认识到肿瘤组织样品可包含多种生物元件，例如一个或多个的癌细胞、部分的或碎片化的细胞、各阶段的肿瘤、周围组织学正常外观组织、和/或经宏观或显微切割的组织。
术语“癌症”、“癌性的”和“癌”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用，术语“膀胱癌”是指源自膀胱的癌症。膀胱癌的例子包括，例如“非肌肉浸润性膀胱癌”或“NMIBC”以及“肌肉浸润性膀胱癌”或“MIBC”。
美国癌症联合委员会(AJCC)TNM分期系统(第7版，2010年)可以用于分期膀胱癌。TNM分期系统考虑(T)主要或原发性肿瘤已经通过膀胱壁生长了多远以及是否已经生长到附近组织中、(N)癌症是否已经扩散到膀胱附近的淋巴结、以及(M)癌症是否以及转移到了远处，例如不在膀胱附近的其他器官或淋巴结。膀胱癌的TNM分期系统如下：
原发性肿瘤(T)
区域淋巴结(N)
远处转移(M)
M0 无远处转移
M1 已发生远处转移
膀胱癌分期
如本文所用，对肿瘤“期”的提及是指一个或多个肿瘤已经扩散到多远，并且是指膀胱癌的前述I、II、III或IV期的任何期(基于上文给出的T、N、和M标准)。
如本文所用，对肿瘤“级别”的提及是指基于癌细胞在显微镜下的外观对膀胱癌的分级。“低级别”(也称为“高分化”)癌症在显微镜下看起来更像正常组织。“高级别”(也称为“低分化”或“未分化”)癌症在显微镜下看起来不太像正常组织。与高级别癌症相比，低级别癌症往往具有更好的预后。
术语“预后”在本文中用于指对癌症患者发生归因于癌症的死亡或肿瘤疾病(例如膀胱癌)进展(包括复发、转移扩散和耐药性)的可能性的预测。
术语“预测”(“prediction”或“predict”)在本文中用于指在外科手术切除原发性肿瘤后，癌症患者对治疗产生特定反应的可能性，无论是阳性反应(又称“有益反应”)还是阴性反应。例如，治疗可以包括靶向药、免疫疗法或化学疗法。
除非另有说明，否则本文使用的每个基因名称，对应于截至本申请提交日期时分配到所述基因的和由Entrez Gene(URL：www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)提供的基因名。
术语“相关”(“correlated”和“associated”)在本文可互换使用，是指两个不同测量值之间或一个测量值或一系列测量值(例如样品中甲基化的量或浓度或者突变的存在)与事件(例如复发)之间的关联。
在膀胱癌的潜在临床结果的背景下，本文中使用术语“复发”(“recurrence”和“relapse”)是指局部或远处转移瘤的复发。可以通过例如膀胱镜检查、细胞学检查、CT成像、超声、动脉造影或X射线、活检、尿液或血液检查、体格检查或研究中心肿瘤登记中的一项或多项来完成复发的鉴定。
如本文所用，“膀胱镜检查”是指如下程序：其中将膀胱镜仪器插入尿道以允许尿道和膀胱的可视化，并且任选地取出组织样品以进行进一步分析。
如本文所用，“经尿道切除术”或“经尿道膀胱肿瘤切除术”(TUR或TURBT)是指如下程序：其中医生取出可疑肿瘤组织和任选的周围肿瘤肌肉组织，例如以确定肿瘤是否确实为癌并且是否已经侵入周围的肌肉组织。TURBT和后续分析可以用于例如确定肿瘤的分期和级别。
如本文所用，“细胞学检查”是指检查来自细胞学检查或TURBT的膀胱组织或洗液的方法，或在显微镜下检查尿液样品以寻找潜在的膀胱癌细胞的存在和/或评估细胞形态以确定细胞级别的方法。
术语“手术”或“手术切除”在本文中用于指手术切除部分或全部肿瘤，以及通常一些周围组织。手术技术的例子包括TURBT、腹腔镜手术、活检或肿瘤消融(例如冷冻疗法)、射频消融和高强度超声。在癌症患者中，手术期间切除的组织的程度取决于外科医生观察到的肿瘤状态。
术语“主动监视”在应用于膀胱癌患者时是指如下方法：在对膀胱癌进行初步治疗后对此患者进行监测，例如以在所述患者中检查复发事件或确定将来复发的风险。例如，患者到肿瘤科医生或其他医生的“监视访视”，是指旨在作为患者监视程序一部分的访视，例如其中进行尿液检查、膀胱镜检查程序等的访视。根据患者的复发风险和癌症的分期或级别，主动监视下的患者每年可能进行例如1次、2次、3次或4次监视访视。膀胱镜检查可以在一次或多次这种年度访视时进行。
如本文所用，术语“Cp”是指“交叉点”。通过确定整个qPCR扩增曲线的二阶导数及其最大值来计算Cp值。Cp值代表荧光增加最高和PCR扩增过程的对数期开始处的循环。
术语“甲基化分数”或“MF”是指已经被甲基化的特定基因或基因集的百分比或分数的估计。可以根据本文描述的数学公式从甲基化特异性Cp估计甲基化。
样品中的“甲基化DNA的量”，此术语是指MF乘以样品DNA产量，并且可以按克为单位(例如纳克)进行测量。可以为每个基因确定甲基化DNA的量，并且然后取平均值以获得样品的“甲基化DNA的平均量”。样品中的“甲基化DNA的浓度”，此术语是指MF乘以样品DNA的产量除以样品体积。甲基化DNA的浓度可以按例如纳克/mL的单位来确定，并且可以针对每个基因来确定，然后取其平均值以获得样品的“甲基化DNA的平均浓度”。
“膀胱癌患者参考组”例如可以用于估计特定患者的甲基化和任选的突变数据与整体膀胱癌患者的数据比较起来如何。因此，参考组可以包括已知具有低和高复发风险的患者或已知曾复发或尚未复发的患者。因此，参考组的数据可以提供与甲基化DNA的量或浓度相关的可能复发风险范围，例如，可以将其与单独患者的新数据进行比较。
如本文使用，术语“风险比(HR)”是指解释变量对事件(即复发或死亡)的危险或风险的影响。在比例危险回归模型中，HR是对两组(例如患有两个不同期癌症的患者)或对连续变量中单元变化(例如一个标准差变化)的预测危害的比率。
术语“阴性预测值”或“NPV”是在诊断测定中具有阴性结果的受试者实际上不具有受试者被测试的病症或风险的概率。它可以表示为真阴性受试者的数量除以真阴性和假阴性的总和，以百分比表示。
术语“阳性预测值”或“PPV”是在诊断测定中具有阳性结果的受试者实际上确实具有受试者正被测试的病症或风险的概率。它可以表示为真阳性受试者的数量除以真阳性和假阳性的总和，以百分比表示。
术语“灵敏性”是指正确鉴定具有病症的那些人的诊断测试(所述测试旨在诊断)的能力(即，真阳性率)。因此，例如，如果测试是高度灵敏的，则具有阴性结果的患者可以更加确信阴性结果是准确的。
术语“特异性”是指正确排除没有正被测试的病症的受试者的诊断测试的能力(即真阴性率)。因此，高度特异性的测试可能具有低假阳性结果率。
当以单数或复数使用时，术语“多核苷酸”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。因此，例如，本文定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链RNA、和包含单链和双链区域的RNA、包含DNA和RNA(可以是单链的、或更典型地双链的、或者包含单链和双链区域)的杂交分子。此外，如本文所用，术语“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。在此类区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。所述区域可以包括一种或多种分子的全部，但是更典型地涉及一些分子的仅一个区域。具有三螺旋区域的分子之一通常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”特别地包括cDNA。所述术语包括含有一个或多个修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。因此，出于稳定性或其他原因而对主链进行了修饰的DNA或RNA是如术语在本文意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(例如肌苷)或修饰碱基(例如氚化碱基)的DNA或RNA包括在本文定义的术语“多核苷酸”内。通常，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多的核苷酸的所有化学修饰、酶修饰和/或代谢修饰形式、以及病毒和细胞(包括简单细胞及复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”是指相对短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA/DNA杂交体和双链DNA。寡核苷酸(例如单链DNA探针寡核苷酸)通常通过化学方法例如使用可商购获得的自动化寡核苷酸合成仪合成。然而，寡核苷酸可以通过多种其他方法制得，包括体外重组DNA介导的技术以及通过在细胞和有机体中表达DNA。
监测膀胱癌患者的方法
本公开文本包括监测膀胱癌患者的方法，所述方法涉及确定患者的DNA甲基化状态，以及任选地进一步确定在膀胱癌中普遍存在的特定基因突变的存在。例如，可以进行这些方法以确定患者与整体膀胱癌患者相比较的相对复发风险。例如，在对癌症进行手术治疗之后，患者可能正在经历主动监视。
在一些实施方案中，所述方法包括从患者获得尿沉渣样品，从样品中提取DNA，并且将提取的DNA暴露于亚硫酸氢盐中以检测具体基因中甲基化的存在。例如，在一些实施方案中，确定选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的甲基化状态。在一些实施方案中，还确定了在FGFR3和TERT基因之一或两者中是否存在特异性突变。在一些实施方案中，所述FGFR3突变是在染色体位置ch4:1803568(登录号NM_001163213.1)处C变为G的取代，导致蛋白质在249位的S变为C的氨基酸变化。在一些实施方案中，所述TERT突变是在染色体位置chr5:1295228(登录号NM_001193376.1)处G变为A的取代(或在相对链上C变为T的取代)，导致TERT基因的启动子区域发生突变。
在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2中的至少两个、至少三个或每个。在一些实施方案中，以下基因中的一个或多个也用于甲基化分析：EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB。在一些实施方案中，例如，在甲基化分析中评估一个、两个、三个或四个或更多个参考基因，以归一化并且因此校正来自测试基因的信号，以说明样品中DNA的量。在一些实施方案中，所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3。
在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M1模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M2模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M3模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M4模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M5模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M6模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M7模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M8模型的基因。在一些实施方案中，用于甲基化分析的基因包括本文实施例3中所述的M9模型的基因。
在一些实施方案中，本文的方法单独使用或与其他诊断测试或测定组合，以便与来自多种复发风险或实际复发水平的膀胱癌患者组的数据相比，确定患者的相对复发风险。例如，复发风险的分布可以通过记录样品的甲基化和任选的突变测定的结果来获得，所述样品来自先前从其他诊断测试中被确定具有复发风险的患者，或者来自已知复发或不复发的患者的存档样品。例如，此类数据可以用于创建对膀胱癌患者的复发风险的测试结果分布。然后，可以将新患者的数据与分布中的数据进行比较，以确定患者的复发风险是否例如与分布中的总体平均值相比低或高，或确定新患者在何处沿着分布曲线下落。这种分析可以提供新患者的相对复发风险。
在一些实施方案中，所述患者已经被诊断为患有非肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为Ta、Tis、T0或低级别。在一些其他实施方案中，所述患者的肿瘤先前已被诊断为T1或高级别。以及在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方案中，基于其他诊断和/或临床测试结果，已经确定所述患者具有低复发风险。在一些实施方案中，所述方法是在主动监视访视期间进行的，所述主动监视访视例如在进行膀胱镜检查之前的访视、或出于确定是否应进行膀胱镜检查的目的的访视、或出于确定应进行膀胱镜检查的频率的目的的访视。例如，如果本文的测定揭示或确认患者应具有低膀胱癌复发风险，则在测定运行后可以不用立即进行膀胱镜检查，或者膀胱镜检查的频率可减少。如果本文的测定揭示患者可能比先前认为的具有更高的复发风险，则可以将膀胱镜检查作为主动监视访视的一部分进行，或可以在后续访视中进行。在一些实施方案中，本文的方法可以在阴性膀胱镜检查之后进行，例如，以帮助确认低复发风险。在一些实施方案中，本文的方法进行至少每年一次，例如每六个月一次，或每三个月一次。
在一些实施方案中，患者先前基于Ta或低级别肿瘤样品(包括来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查的组织)已被确定具有低复发风险。在一些实施方案中，低风险患者具有正常或异常的膀胱镜检查。在一些实施方案中，低风险患者具有正常或异常的细胞学检查。在一些实施方案中，所述患者患有NMIBC并且具有来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查中的一种或多种的阴性组织分析结果，并且本文的方法用于确认膀胱癌的非复发。在一些实施方案中，所述患者患有NMIBC并且先前曾具有给出Ta或低级别癌症的组织分析结果，所述组织分析结果来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查中的一种或多种，并且本文的方法用于确认患者具有膀胱癌复发的低风险。在此类方法中，如果本文的方法表明患者实际上具有高复发风险或指示任何实际存在的复发，则在以后的监视访视中可以增加对患者的膀胱镜检查的频率或可以进行进一步的组织分析。例如，在一些实施方案中，患者先前基于高级别、T1-T2或Tis肿瘤样品(包括来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查的组织)已被确定具有高复发风险。在一些实施方案中，高风险患者具有正常或异常的膀胱镜检查。在一些实施方案中，高风险患者具有正常或异常的细胞学检查。在一些实施方案中，所述患者患有NMIBC，并且先前曾具有显示高级别、T1、T2或Tis的组织分析结果，所述结果来自TURBT、膀胱镜检查或上GU检查中的一种或多种，并且本文的方法用于确认患者具有高复发风险以及用于检查任何复发的存在。如果所述方法表明患者实际上具有低复发风险，则可以减少膀胱镜检查的频率。如果所述方法表明患者正在经历实际的复发，则可以进行进一步的组织分析。
在一些实施方案中，异常的膀胱镜检查结果包括任何需要后续TURBT、上GU道检查或后续膀胱镜检查的异常。在一些实施方案中，异常的细胞学检查结果包括任何导致TURBT或上GU道检查或膀胱镜检查的异常。
在一些实施方案中，例如，对于另外确认具有低复发风险的患者，本文的诊断方法可以被包括作为治疗方法的一部分。例如，如果根据本文的方法确认患者具有低复发风险，则可以继续通过主动监视来治疗患者。在一些实施方案中，可以减少膀胱镜检查的频率。在其他实施方案中，如果根据本文的方法确定患者具有更高的复发风险，则可以增加膀胱镜检查的频率。
测定基因甲基化和突变的方法
可以从膀胱癌患者的样品例如尿液样品中测定所述患者中的基因甲基化。在收集尿液样品后，可以例如通过离心处理样品以从尿液样品中分离出细胞沉渣。然后可以例如使用DNA分离试剂盒(例如Qiagen AllPrep DNA/RNA)或其他类型的可商购的DNA提取试剂盒从沉渣中提取DNA。
提取DNA后，可以例如以纳克对样品的DNA总量进行定量，并且然后经受亚硫酸氢盐转化以进行甲基化分析。例如，CpG二核苷酸重复序列中的胞嘧啶核苷酸是甲基化的关键靶位点，其中胞嘧啶转化为5-甲基-胞嘧啶。向DNA中添加亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而留下甲基化的胞嘧啶未修饰。因此，例如用具有修饰序列(以适应预期的尿嘧啶转化)的适当引物扩增硫酸氢盐处理的DNA链，可以检测到甲基化胞嘧啶的存在。甲基化的胞嘧啶在测序时仍读作胞嘧啶，然而未甲基化的胞嘧啶则读作尿嘧啶。参见，例如，K.Patterson等人,J.Vis.Exp.56:e3170 doi:10.3791/3170(2011)；R.Shapiro等人,J.Am.Chem.Soc.92(3):422-424(1970)；H.Hayatsu等人,J.Am.Chem.Soc.92(3):724-6(1970)；和M.Frommer,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89(5)；1827-31(1992)，这些文献描述了甲基化DNA的亚硫酸氢盐转化。商业试剂盒，例如Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen；EpiBeat)可以用于进行亚硫酸氢盐转化。
在亚硫酸氢盐转化之后和甲基化DNA检测之前，可以使用能够扩增富含GC的DNA区域的聚合酶对DNA的靶基因进行预扩增。例子是KAPA Taq Hotstart polymeraseTM(KAPABiosystems)。可以例如使用KAPA Probe FastTMqPCR试剂盒(KAPA Biosystems)进行预扩增。在预扩增之后，然后例如用KAPAProbe FastTM试剂盒，再次使用能够扩增富含GC的区域的聚合酶，可以例如通过甲基化特异性定量PCR(MS-qPCR)进行进一步的PCR扩增。
在PCR分析中，5'-核酸酶测定数据通常最初表示为阈值循环(“CT”)。在每个循环期间记录荧光值，所述值表示在扩增反应中扩增至此点的产物量。阈值循环(CT)通常被描述为荧光信号首次被记录为统计学上显著时的点。数据也可以表示为交叉点(“Cp”)。通过确定整个qPCR扩增曲线的二阶导数及其最大值来计算Cp值。Cp值代表荧光增加最高和PCR扩增的对数期开始处的循环。
在一些实施方案中，qPCR也可用于检测具体的基因或基因调控区域的突变。在一些实施方案中，可以用与检测基因甲基化相同的PCR反应(例如，通过包括修饰的针对目的基因的引物，以说明亚硫酸氢盐的处理)进行突变的PCR检测。例如，在一些实施方案中，也可以检测到基因(例如FGFR3和TERT)中的突变。例如，在一些实施方案中，检测到在基因组位置(HG19)chr4:1803568处发现的FGFR3突变。这种突变涉及DNA序列中C变为G的改变，导致蛋白质中S249C氨基酸的改变。在一些实施方案中，检测到在基因组位置(HG19)chr5:1295228处发现的TERT突变。这种突变涉及基因的启动子区域的DNA序列中的G变为A的改变。
为了最大限度地减少错误和样品间变异的影响，使用内标进行PCR。理想的内标基因(也称为参考基因)不包含任何CpG二核苷酸并且因此在膀胱癌患者中的甲基化程度不会比在非膀胱癌患者中的甲基化程度高或低，或者由于其他原因在癌症患者的甲基化方面没有变化。因此，参考基因的qPCR数据应反映样品中DNA的数量，而不是DNA甲基化的程度。
PCR引物和探针的设计
更一般地，目的基因的PCR引物和探针可以例如基于目的基因的mRNA转录物中存在的外显子或内含子序列或基于目的基因任一侧的启动子区域和基于由于亚硫酸氢盐转化造成的预期序列修饰来设计。引物/探针设计可以使用公众可用的软件进行，例如Kent,W.J.,Genome Res.12(4):656-64(2002)开发的DNA BLAT软件，或通过BLAST软件及其变体。
在必要或期望的情况下，可以掩蔽靶序列的重复序列以减轻非特异性信号。实现此目的的示例性工具包括通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线可用的重复掩模(Repeat Masker)程序，其针对重复元件库筛选DNA序列并返回其中重复元件被掩蔽的查询序列。然后被掩蔽的内含子序列可以用来设计引物和探针序列，其使用任何商业或其他公众可用的引物/探针设计包进行，例如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(用于一般用户和用于生物学程序员的WWW上的Steve Rozen和Helen J.Skaletsky(2000)Primer3。(参见S.Rrawetz,S.Misener,Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology,第365-386页(Humana Press))。
影响PCR引物设计的其他因素包括引物长度、解链温度(Tm)和G/C含量、特异性、互补引物序列和3'末端序列。通常，最佳PCR引物通常是17-30个碱基的长度，并且含有约20％-80％(例如约50％-60％)的G+C碱基，并且表现出在50℃与80℃之间(例如约50℃至70℃)的Tm。在一些实施方案中，PCR引物或阻断核酸可以包含DNA或可以包含DNA类似物(例如锁核酸(LNA)或蛋白质核酸(PNA))。
对于PCR引物和探针设计的进一步指导原则，参见例如Dieffenbach,CW.等人，“General Concepts for PCR Primer Design”:PCR Primer,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York,1995,第133-155页；Innis and Gelfand,“Optimization of PCRs”:PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,CRCPress,London,1994,第5-11页；和Plasterer,T.N.Primerselect:Primer and probedesign.Methods MoI.Biol.70:520-527(1997)，其整体披露通过引用明确地特此并入。
算法和统计分析方法
在一些实施方案中，使用实时或定量PCR技术确定待分析的基因的甲基化分数。例如，交叉点或Cp值可以表示PCR循环，例如在该循环中在患者的样品中首先检测到特定基因的甲基化。可以将此信息与先前获得的表示甲基化基因Cp值与log10浓度关系的标准曲线进行比较，并且然后将其针对参考基因的类似值归一化，从而获得此基因的甲基化分数。这在以下公式中说明，其中m代表测试基因的数据，并且α代表甲基化非依赖性(MIP)参考基因的数据：
甲基化分数＝2m-α
首先，每个基因的标准曲线图(例如Cp与log10基因浓度的关系)可以通过以下方式确定：采用已知浓度的DNA样品(代表所述基因的甲基化或未甲基化形式的PCR扩增产物)，并且进行一组连续稀释，并且在每种浓度下测量荧光信号，并且将此荧光信号与对应于此信号的PCR循环值相关联。这样的表示Cp与log10浓度关系的曲线在若干数量级上可能是线性的，从而允许确定斜率和截距(参见前述公式)。(参见，例如，D.Rodriguez-Lazaro&M.Hernandez,Introduction to the Real-Time PCR,in Real-Time PCR in FoodScience:Current Technology and Applications,D.Rodriguez-Lazaro编,CaisterAcademic Press,Norfolk,UK(2013)for description of how to obtain and utilizesuch a standard curve.)
例如，用以获得这种斜率和截距的15点线性分析可以通过以下方式进行：采用已知浓度的核酸，并且进行14次两倍连续稀释，并且还获得不包含核酸的第15个样品。然后通过对每个样品进行PCR并且确定Cp值来确定15个样品中每个样品中的相关基因的表达，其中无核酸样品的Cp值预期等于PCR循环数(例如40)。如果PCR反应是完美的，则对于每稀释2倍，Cp值应增加1。将观察到的Cp值相对于核酸的已知起始浓度作图，并且计算所得线的斜率及其截距。
一旦获得了此标准曲线的斜率和截距(以及一种或多种参考基因的相似标准曲线)，他们可以用于计算m和α值，并且随后用于计算测试基因的甲基化分数(MF)(参见前述公式)。为了确保MF值介于零和一之间，一些实施方案中的MF可能等于以下的最大值：(a)零或(b)与1或2m-α的最小值对应的值。此可以表示为：MF＝max(0,min(1,2m-α))。
然后每个目的基因的MF可以用于计算其他值。在一些实施方案中，也确定了每个基因的甲基化DNA的量，等于MF乘以样品的DNA产量(例如以纳克为单位)。在一些实施方案中，甲基化DNA的量可以反映实际上有多少肿瘤相关的DNA“泄漏”到患者的尿液中。并且在其他实施方案中，确定甲基化DNA的浓度，所述浓度等于甲基化DNA的量除以样品体积(例如，以毫升为单位)。例如，甲基化DNA的浓度可以校正检测实验室接收到的样品中肿瘤相关DNA的浓度，并且因此在实验室仅接收一部分尿液样品的情况下不会受到影响。但是，此值可能受患者在收集尿液之前消耗的液体量影响。在一些实施方案中，可以确定基因的甲基化DNA的量和浓度二者。
在一些实施方案中，然后确定被测定基因集的甲基化DNA的平均量或浓度。例如，在一些实施方案中，测定了至少四种、至少五种或至少六种测试基因。在此类情况下，可以在本文的算法中报告甲基化DNA的平均量或平均浓度。在一些实施方案中，可以计算基因集中每个基因的甲基化DNA的量和/或浓度，然后取平均值。
在一些实施方案中，也评估了基因突变。在一些实施方案中，此类突变也可以使用实时或定量PCR方法评估。因此，例如，如果通过PCR扩增中特定交叉点检测到与此突变的扩增产物相关的荧光信号，则可以认为所述突变存在。在一些实施方案中，例如，FGFR3和/或TERT中的突变也包括在本文的测定中。在一些实施方案中，FGFR3突变位于染色体位置chr4:1803568处(C变为G)，导致蛋白质中的S249C突变。在一些实施方案中，TERT突变位于染色体位置chr5:1295228处(G变为A)，导致启动子区域的突变。
在一些实施方案中，可以根据来自测试基因的甲基化DNA的平均量或浓度，以及任选地还根据是否存在FGFR3和/或TERT突变来开发算法。在一些实施方案中，所述算法可涉及以下一组步骤：
1)对于每个甲基化标记基因和参考基因，使用从相关标准曲线估计的截距和斜率校正差异PCR扩增效率，如上所讨论。
2)计算标记基因和参考基因的m值和α值，其中当分析中包含多于一个的参考基因时，在甲基化分数公式中使用平均α值。
3)估计每个基因的甲基化分数为MF＝max(0,(min 1,2m-α)
4)应用所选的方法(a)或(b)定量单独基因的甲基化：
a.甲基化DNA的量量＝MF*样品产量(ng)，或
b.甲基化DNA的浓度浓度＝MF*样品产量(ng)/样品体积(mL)
5)计算Log10(基因的平均量或浓度)
6)任选地，还定义了FGFR3和TERT中突变的存在
在一些实施方案中，将每个突变的存在的阈值Cp值定义为与所述突变相关的荧光信号必须出现时的循环数，这样才能将突变称为存在。为评估最终算法的性能，在一些实施方案中，具有HR复发、LR复发和无复发类别的多项式logistic回归模型拟合以下预测变量：
·对选择方法的2自由度自然三次样条曲线：
ο Log10(平均量)，或
ο Log10(平均浓度)
·FGFR3和TERT突变的指标(如果包括在测定中)
·患者亚组的指标(即初始低复发风险(“初始LR”)或初始高复发风险(“初始HR”))
根据这些步骤，在一些实施方案中，可以使用回归分析从而为膀胱癌患者提供一定范围的“得分”，从而对来自算法的“得分”创建复发或实际复发风险的参考曲线，可以将新患者的数据与参考曲线进行比较。然后此类曲线可以用于确定例如对于该新患者的相对复发风险。
在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少4种基因，以及任选另外的选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM、和ITPKB的基因以及一种或多种参考基因。在一些实施方案中，测定的基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2中的每个。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M1基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M2基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M3基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M4基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M5基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M6基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M7基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M8基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，前述算法中测定的基因包括以下或由以下组成：下文实施例3中列出的M9基因集的那些连同一种或多种参考基因。在一些实施方案中，所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A、和SLC24A3中的一种或多种。
在一些实施方案中，可以在例如具有已知临床结果的测试群体中，通过评估阴性预测值(NPV)、灵敏性、阳性预测值(PPV)和特异性监测算法的性能。例如，对于最初被诊断为具有低复发风险(LR)的患者，本文的方法可以用于确认LR诊断。在这种情况下，NPV可以测量本文的方法正确预测阴性结果(即患者没有高复发风险)的准确程度。例如，灵敏性可以反映由测试正确预测的真阳性结果(即真阳性而非假阳性)的百分比。例如，这些测量可以表明测试在确认复发诊断中的准确性。相似地，在对最初诊断为高复发风险(HR)的患者使用的测试中，所述方法可以用于确认没有可能发生复发。在一些实施方案中，也可以确定PPV和特异性，以分别评估测试预测阳性结果的准确程度和评估由测试正确预测的真阴性结果的百分比。在一些实施方案中，所述方法的目标是示出高灵敏性和高NPV(例如，大于85％、例如大于88％、例如大于90％灵敏性，以及大于90％，例如大于95％、例如大于97％、例如大于98％NPV)，因为这可以允许对经受监视的患者减少膀胱镜检查的频率。
在一些实施方案中，可以进行进一步的性能评价，例如确定预测性曲线(即针对概率的群体分位数估计的高复发风险或任何实际复发的概率的图)、或确定ROC曲线(即灵敏性与1减去测试的特异性的关系图，所述图可以包括在每个复发概率处的割点)、或确定ROC曲线下面积。
本领域技术人员将认识到，另外可以使用许多统计方法来确定目的结果(例如，存活的可能性，复发的可能性)与特定标记或参数(例如，基因的甲基化状态，或基因突变的存在或不存在)之间是否有显著关系。这种关系可以表示为连续的复发得分(RS)，或可以将患者分为风险组(例如，低和高或低、中、高)。
本发明的试剂盒和系统
用于本发明方法的材料适用于试剂盒的制备。因此，例如，本公开文本提供了包含试剂的试剂盒，所述试剂可以包括基因特异性或基因选择性探针和/或引物，用于定量所公开基因的甲基化和任选的突变。试剂盒还可以包括阻断核酸，例如，以在PCR扩增期间阻断DNA重复区域。此类试剂盒可以任选地包含用于从样品中提取DNA和用于DNA的亚硫酸氢盐转化的试剂。另外，试剂盒可以任选地包含一种或多种试剂，以及与其在本发明方法中的使用相关的鉴定性描述或标签或说明书。试剂盒可以包含容器(包括适用于在所述方法的自动化实施中使用的基质、微量滴定板等)，每个容器具有在所述方法中使用的各种试剂(通常以浓缩形式)中的一种或多种，包括例如，预制微阵列、缓冲液、合适的三磷酸核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、DNA聚合酶和本发明的一个或多个探针和引物(例如，针对每种测试基因和参考基因的用于甲基化分析以及FGFR3和TERT突变分析的适当引物)。用于估计或定量预后或预测信息的数学算法也是试剂盒的潜在组分。试剂盒还可以形成系统的一部分，所述系统包括例如检测设备和/或计算机软件，以用于确定患者的甲基化和突变状态，并且用于将患者结果与参考膀胱癌患者群体的结果进行比较。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于亚硫酸氢盐修饰基因的PCR扩增的正向引物和反向引物，以进行本文所述的(例如选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少4种基因，和任选地选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的其他基因)和一种或多种参考基因的甲基化测定，以及还任选地用于评价FGFR3和/或TERT突变状态。试剂盒也可以包含PCR试剂，例如能够扩增富含GC的序列的聚合酶，以及用于进行测定的说明书。试剂盒也可以形成系统的一部分，所述系统包含计算机软件，以用于进行甲基化和任选的突变分析以及用于确定患者的复发风险。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含盒，所述盒包括至少一个孔(其可以构成通道、腔室、区域或表面)。如本文所用，“盒”是通用术语，意指可以容纳试剂并且含有至少一个“孔”的物理结构。反过来，“孔”是一个通用术语，意指通道、腔室、区域或表面，其可以用于容纳一个或多个反应步骤(例如PCR过程的步骤、从样品提取DNA、洗涤步骤或检测步骤等)。在一些实施方案中，至少一个孔可以包含用于检测基因甲基化的一种或多种引物。所述基因可以包括选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少4种基因，以及任选地选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的其他基因，以及任选地还包括基因突变(例如在TERT或FGFR3中)。在一些实施方案中，对基因MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2中的每个检测甲基化。在一些实施方案中，对下文实施例3中列出的M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8或M9基因集中的基因检测甲基化。在一些实施方案中，引物附着于盒中的一个或多个孔。在一些实施方案中，每个孔可以包含用于多于一种基因例如两种、三种、四种、五种或六种不同基因的引物，例如，通过使用以不同颜色标记物标记的引物。在一些实施方案中，至少一个孔包含用于检测至少一种参考基因甲基化的至少一种引物。在一些实施方案中，将所述盒配置为使每个孔包含用于检测前述基因MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25、TMEM106A、EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种的甲基化的引物，和用于检测至少一种参考基因的甲基化的其他引物。在一些实施方案中，所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。因此，在一些实施方案中，将所述盒配置为对基因进行甲基化特异性定量PCR，意指其结构和排列方式使其可以用于进行基因的甲基化特异性定量PCR分析。
在一些实施方案中，所述盒进一步包含扩增试剂，例如PCR酶、缓冲液、三磷酸核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和rUTP)和用于亚硫酸氢盐转化的试剂。在一些实施方案中，所述盒是试剂盒或系统的包含一个或多个组分的部分，所述一个或多个组分将这些试剂引入盒的孔中。在一些实施方案中，从患者样品中提取DNA并且将其直接施加到盒中或在亚硫酸氢盐转化后施加到盒中。在一些实施方案中，将提取的DNA施加到盒中，并且在盒的一个或多个孔中发生亚硫酸氢盐转化。在一些实施方案中，将样品直接施加到盒中，并且如果在亚硫酸氢盐转化和扩增之前需要进行DNA提取，则提取也在盒的一个或多个孔中发生。在一些实施方案中，所述样品是尿液样品，例如尿沉渣样品(例如，包含尿细胞沉淀物)。在其他实施方案中，所述样品是组织样品。因此，在一些实施方案中，所述盒旨在接受尿液或组织样品。在一些实施方案中，所述盒被设计用于尿液(例如尿沉渣)样品或组织样品。在一些实施方案中，盒和相关系统可以基于描述于国际公开号WO 2006/136990和其相关的美国专利号9,568,424中的那些。
在一些实施方案中，所述盒包含含有引物的发生热循环的至少一个孔，以及用于引入、裂解和/或洗涤样品的一个或多个孔。在一些实施方案中，整个盒结构还包含泵、阀、处理孔、以及流体和废液收集池，这允许在盒中进行样品处理和PCR反应以及甲基化的相关检测和任选地还有特定基因的突变。
在一些实施方案中，所述盒是系统的一部分，其能够使用被所述盒包含的引物和试剂定量来自样品的某些基因的甲基化，并且所述系统还包括能够定量基因的甲基化并且还计算基于甲基化的值(例如样品产量、样品体积、甲基化分数(MF)、甲基化DNA量、甲基化DNA浓度、Cp值和总体复发得分(RS)结果)的软件。在一些实施方案中，所述系统还能创建报告总结信息，例如受试者的MF、甲基化DNA量和/或甲基化DNA浓度、以及任选的TERT和/或FGFR3突变状态。在一些实施方案中，所述系统还可以将定量值(例如甲基化DNA量和/或甲基化DNA浓度)与来自膀胱癌患者参考组的那些值进行比较，以预测患者的复发风险或检测患者是否具有实际复发。
报告
当实施于商业诊断目的时，本发明的方法通常产生一个从本文描述的方法获得的信息的报告或总结。例如，报告可包含涉及以下项的信息：甲基化DNA的量或浓度、基因突变状态、报告复发风险的总体复发得分结果(与膀胱癌患者参考组的数据相比)、对于特定患者的临床结果预测、或患者是高于还是低于某些复发风险阈值。本发明的方法和报告可以进一步包括将报告存储在数据库中。所述方法可以在数据库中为受试者创建记录，并且使用数据填充记录。所述报告可以是纸质报告、听觉报告或电子报告。所述报告可以显示和/或存储于计算设备(例如，手持设备、台式计算机、智能设备、网站等)上。预期将报告提供给医生和/或患者。接收报告可以进一步包括建立网络连接至包含数据和报告的服务器计算机，并从服务器计算机请求数据和报告。
电脑程序
可以手动计算和存储来自上述测定的值，例如表达数据、复发得分、治疗得分和/或有益得分。可替代地，前述步骤可以由计算机程序产品完全或部分地执行。本发明因此提供了计算机程序产品，其包括在上面存储有计算机程序的计算机可读存储介质。在由电脑执行时，所述程序可以基于从来自个体的一个或多个生物样品的分析获得的值执行相关计算。计算机程序产品具有存储在其中执行计算的计算机程序。
本公开文本提供了用于执行前述程序的系统，所述系统通常包括：a)中央计算环境；b)输入设备，其可操作地连接到计算环境，以接收患者数据，其中所述患者数据可以包括例如使用来自患者的生物样品从测定获得的表达水平或其他值、或微阵列数据，如上文详细描述；c)输出设备，其连接到计算环境，以向用户(例如，医务人员)提供信息；以及d)由中央计算环境(例如，处理器)执行的算法，其中所述算法是基于由输入设备接收的数据来执行的。本发明提供的方法也可以全部或部分自动化。
现在已经描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以说明的方式提供，并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：评估甲基化的方法和概念验证研究
使用来自66名膀胱癌患者(25名无复发患者、14名低风险(LR)(Ta低级别)患者和27名高风险(HR)(T1或高级别)患者)的尿细胞沉淀物进行概念验证(POC)研究。使用基于文献选择的11个甲基化基因标记和1个甲基化非依赖性(MIP)参考基因评估复发。使用在硫酸氢盐转化之后的甲基化特异性定量PCR(MS-qPCR)分析来确定这12个基因的甲基化水平。这项研究用于评价单独甲基化标记的性能和关于预测复发存在的合并得分。基于此研究，开发了几种评价甲基化信号的方法，并且将其用于对更大组的候选标记的细化研究中。
如下从甲基化特异性Cp估计每个基因的甲基化分数(MF)：
第一，通过对已知浓度的来自基因扩增的PCR产物进行连续稀释，对每个基因进行线性研究。将产物连续2倍稀释15次，并且制作每种浓度下的Cp值曲线，并且获得其斜率和y-截距。第二，使用衍生自线性研究的斜率和截距，如下对差异PCR扩增效率进行校正：
第三，使用甲基化非依赖性参考基因数据对Cp进行归一化，并且根据以下公式估计MF：
甲基化分数＝m-α
然后基于MF以及样品的DNA产量和体积获得另外的参数，如下表所示：
基于来自POC研究的11种基因的合并得分与复发的存在相关联，如下表所示。
实施例2：甲基化组(methylome)发现研究
进行了一项基因发现研究，以鉴定在患有膀胱癌的患者和未患有癌症的患者的样品中差异甲基化的其他基因候选物。分析中使用了来自癌症患者(14名先前被诊断为低复发风险(LR)的患者和19名先前被诊断为高复发风险(HR)的患者)的总共26个肿瘤组织样品和7个尿细胞沉淀物，以及来自无癌症患者(7名健康个体和5名先前没有诊断为膀胱癌或先前已诊断但是在手术时没有恶性肿瘤的患者)的7个尿细胞沉淀物和5个组织样品。基于癌症基因组图谱(TCGA)的分析，甲基化组评估靶向11种癌症中差异甲基化的区域中的约600万个核苷酸，并为每个样品测序约724,000个位点。在此发现研究中进行了以下评估。
第一，在癌症样品中与无癌症样品中差异甲基化的位点被鉴定为1％的错误发现率。第二，基于以下来选择用于PCR测定以进行细化研究的最强候选物：(a)具有强甲基化信号的区域、(b)高覆盖率，即CpG位点的高数量、(c)来自非癌症样品的低信号、(d)CpG位点在引物/探针之间的分布和位置、以及(e)一致甲基化信号的区域。第三，基于甲基化组发现研究的结果，在细化研究中采用了86个候选甲基化标记。此组86个候选对象包括在实施例1的概念验证研究中使用的11种基因。
实施例3：细化研究
此细化研究评估了203名先前被诊断为膀胱癌目前在监视的患者上的96个标记，包括86个来自基因发现研究的甲基化标记基因、4个甲基化非依赖性参考基因和6个FGFR3突变。6个FGFR3突变测定中有两个未能产生任何信号，并且排除对这两个的进一步评估。此外，本研究的170名患者具有足够的RNA用于其他评估，包括测定2个TERT突变。此处展示的结果基于这170名患者，其中评估了86个甲基化标记、4个参考基因、4个FGFR3突变和2个TERT突变。所述患者包括85名尚未复发的患者、32名先前被诊断具有LR复发的患者和53名先前被诊断具有HR复发的患者。
进行硫酸氢盐转化之后使用RT-PCR分析确定甲基化水平。使用灵敏性、特异性、阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)的非参数估计来评估单独甲基化标记的性能。在此分析中，出于灵敏性、特异性、NPV和PPV的目的，LR复发受试者的阳性事件被认为是HR复发的预测。HR复发受试者的阳性事件被认为是任何实际复发的证据。
最终模型的基因选择基于多种考虑，包括(1)生物途径的表征，(2)关于NPV，用于预测HR复发的强单独基因性能，(3)对于具有和不具有强制突变的HR和任何复发终点，使用弹性网络惩罚回归模型进行的一致选择(Zhou H,Hastie T.Regularization andvariable selection via the elastic net.Journal of the Royal StatisticalSociety,Series B 67:301-320)，(4)LASSO惩罚回归模型中的强性能(TibshiraniR.Regression shrinkage and selection via the LASSO.Journal of the RoyalStatistical Society,Series B 58:267-288)和(5)纳入POC研究。鉴定了两个主要的生物途径：被大量代表的同源盒功能组(例如IRX5、MEIS1、ONECUT2、OTP、POU4F2、SIM2、SOX1)和免疫组(KLF2、IRAK3、ITPKB)。
弹性网络分析鉴定了经一致选择以便包含在模型(在包括和不包括FGFR3和TERT突变测定的情况下)中的几种基因：KLF2、MEIS1、DDX25、NKPD1、ONECUT2和TMEM106A。下表显示了使用弹性网络分析所选择的基因。
基于以上概述的标准选择的十三个甲基化标记被认为包含在最终模型中。这些甲基化标记的九种组合在下表中描述，并且被包含在最终模型M1-M9中。
上表中将POC研究中包含的基因记为“POC”。符号*表明对于HR和任何复发，无论是否有突变，都始终进入弹性网络选择模型。符号表明对于NPV作为单独基因的强性能。符号表明在LASSO模型中的强性能。符号￥表明进入任何复发弹性网络模型。符号b代表免疫途径基因。
除甲基化标记外，还选择包含两个突变标记。第一个是在FGFR3中，包含在基因组位置ch4:1803568处C变为G的突变，其导致了蛋白质中S249C的突变。此突变在超过65％的低风险低级别膀胱癌患者中发现。此突变的检出限是在Cp＝33时。第二个是在TERT的基因组位置chr5:1295228处，其是最普遍的TERT突变，并且在所述基因的启动子区域发现。所述突变是一条DNA链上的G变为A的改变或相对链上的C变为T的改变。所述突变在约65％的所有膀胱癌患者中发现。此突变的检出限是在Cp＝30时。下表示出了低风险和高风险患者中与复发风险相关的这些突变中的每种的存在的信号。
添加FGFR3突变基本改善了LR复发的预测，然而包含TERT突变则稍微改善了HR复发的性能。
在线性研究中，使用了多达四个甲基化非依赖性(MIP)参考基因，并且表现良好。在四种不同的归一化方案下，基于包括M1甲基化标记、FGFR3和TERT突变测定的模型的性能选择了最终的2个MIP参考基因COL2A和SLC24A3。当MIP参考基因的数量从4个减少到2个时，没有观察到性能下降。因此，相对于两个基因(COL2A和SLC24A3)的平均值，将甲基化信号归一化。
使用多项逻辑回归模型采用以下项评价每种算法的性能：HR复发、LR复发和无复发的结果类别，以及作为预测因子的甲基化标记、突变存在指标和初始肿瘤状态的指标变量(低风险与高风险)。基于此模型，估计了研究群体中每名患者的{HR复发}概率和{LR复发}概率。使用基于模型的复发概率估计、亚组(初始高风险或低风险肿瘤)中预测因子的加权经验分布、和靶标群体亚组中假设的真实复发发生率来评估NPV、PPV、灵敏性和特异性，具体为：初始LR肿瘤患者：85％无复发、10％LR复发、5％HR复发，和初始HR肿瘤患者：85％无复发、2％LR复发、13％HR复发。
在初始LR患者中，以Pr{HR复发}分布的特定百分位数(例如第50个百分位数)确定定义HR复发存在的割点。在初始HR患者中，以Pr{任何复发}分布的预定的百分位数(例如第85个百分位数)确定定义任何复发存在的割点。
最终算法M1-M9包括以下步骤：
7)对于每个甲基化标记和参考基因，使用从线性研究估计的截距和斜率校正差异PCR扩增效率。
8)计算参考基因的平均值mip＝参考基因的平均α值
9)估计每个基因的甲基化分数为MF＝0或(1或2m-mip的最小值)的最大值，即max 0(min 1,2m-mip)
10)应用所选的方法(a)或(b)定量单独基因的甲基化：
a.甲基化DNA的量量＝MF*样品产量(ng)，或
b.甲基化DNA的浓度浓度＝MF*样品产量(ng)/样品体积(mL)
11)计算Log10(基因的平均量或浓度)
12)定义在FGFR3中在<33Cp或在TERT中在<30Cp时突变的存在
为评估最终算法的性能，具有HR复发、LR复发和无复发类别的多项式logistic回归模型拟合以下预测变量：
·对选择方法的2自由度自然三次样条曲线：
ο Log10(平均量)，或
ο Log10(平均浓度)
·FGFR3和TERT突变的指标
·患者亚组的指标(初始LR与初始HR复发)。
使用以下项估计性能参数灵敏性、特异性、阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)：拟合的Logistic回归模型，以及高复发风险和任何复发的假定真实群体率(针对范围为从最低到最高估计复发概率的截止值)。(参见图1-2、4-5、7-8和10-11以及下表。)基于文献和内部研究，在此分析中，使用了复发的真实群体率的以下估计值：
1)对于初始低风险患者：85％患者无复发、10％患者具有低复发风险和5％患者具有高复发风险
2)对于初始高风险患者：85％患者无复发、2％患者具有低复发风险和13％患者具有高复发风险
针对这些概率的估计群体分位数绘制了性能参数。包括其他性能评估(参见图3、图6、图9和图12)：
1.预测性曲线，即针对概率的群体分位数估计的HR复发或任何复发的概率的图
2.ROC曲线，即，灵敏性与1减去测试的特异性的关系图，其中在每个复发概率处具有割点，以及
3.ROC曲线下面积。
最终模型的性能在下表和图1-图12中进行了描述。在下表中，总结了在细化研究中在百分位数割点处的M2-M9基因组合的模型性能。具体而言，将受试者分为初始诊断为LR复发或HR复发的受试者。对于初始LR复发受试者，阳性事件被认为受试者实际上属于HR复发类别(终点：HR复发)。对于初始HR复发受试者，阳性事件被认为是任何实际复发(终点：任何复发)。下表提供了与在测试群体的第50和第85个百分位数处提供的初始LR受试者中的HR复发或初始HR受试者中的任何复发相关的灵敏性、特异性、NPV和PPV。
对于采用了FGFR3和TERT突变测定的针对甲基化DNA量和甲基化DNA浓度的M1模型的性能详细总结也示于图1-图12中。例如，图1示出了初始LR受试者的NPV、PPV、灵敏性和特异性曲线，和第50和第75百分位数的受试者的NPV、PPV、灵敏性和特异性值，其中阳性事件被认为是实际的HR复发。图2示出了初始LR受试者的NPV、PPV、灵敏性和特异性曲线，和第50和第75百分位数的受试者的NPV、PPV、灵敏性和特异性值，其中阳性事件被认为是任何实际复发。图3中示出了相关的预测性和ROC曲线。图4-图6中示出了初始HR患者的相似数据。图7-图12示出了基于甲基化DNA浓度分析的数据。
基于细化研究在百分位数割点处甲基化DNA量的最终算法M1-M9的性能
基于细化研究在百分位数割点处甲基化DNA浓度的最终算法M1-M9的性能
实施例4：甲基化和突变检测的方法
根据图13中所示的流程图，以下方法已经用于甲基化和突变检测。Qiagen DNA/RNA用于从经离心的尿液样品中提取DNA。使用Qiagen 快速DNA亚硫酸氢盐试剂盒进行DNA的亚硫酸氢盐转化。使用KAPA Probe 试剂盒(KAPABiosystems)进行靶基因的预扩增和甲基化特异性定量PCR(MS-qPCR)。
在所述测定中，在单个工作流程测定中检测甲基化和FGFR3/TERT突变状态。这通过以下方式实现：对细胞沉淀物DNA进行亚硫酸氢盐转化，从而使甲基化的胞嘧啶保持为胞嘧啶，而未甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶；通过使用甲基化特异性引物以及具有野生型阻断核酸的突变特异性引物进行有限次的PCR循环。设计所有引物以扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA，退火至经亚硫酸氢盐转化的模板。随后对扩增产物进行甲基化和突变的单丛定量PCR分析，以确定预期位点的甲基化和突变状态。此方法的某些方面描述于J.Morlan等人,PLoSOne Vol.4,第2期,e4584,第1-11页(2009)。
实施例5：验证研究
在非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)受试者中采用用于预测复发的基因组标记和表观基因组标记进行基于尿液的测定的临床验证研究。所述研究将涉及约30个临床中心，并且将设法招募所有在那些中心进行异常膀胱镜检查和细胞学检查的患者，达到约380名患者。招募的380名患者预期产生约300个用于分析的可用患者样品。具体而言，纳入标准是先前诊断为患有非肌肉浸润性、T1或更低级别的膀胱尿路上皮细胞癌的患者，所述患者计划进行监视膀胱镜检查，其中NMIBC的最初诊断或最近复发是在最近5年内。如果患者患有肌肉浸润性疾病、或是T2或更高级别的疾病或患者从初始诊断或最近的复发开始没有可获得的肿瘤阻断，或者患者禁忌某些临床程序(包括TURBT)，则可以将所述患者排除。
所述研究的主要目的是验证复发可能性与来自甲基化测定的得分结果之间的关联。所述研究还将表征此组患者中测定的灵敏性、特异性、NPV和PPV。在第一个清晨排泄之后且在对膀胱进行任何操作(例如膀胱镜检查、手术、导管插入术)之前以及在先前操作之后至少1天收集尿液样品。还从TURBT、上GU道检查或膀胱镜检查获得的肿瘤组织样本中收集存档的、固定的、包埋的(FPE)组织样品。提供患者的初始膀胱镜检查、细胞学检查(如果有)、TURBT或膀胱镜检查组织分析和上GU检查。膀胱镜检查和细胞学检查记录为正常或异常，并且来自TURBT和上GU道检查的组织记录为阴性，或为Ta低级别或为高级别、T1-T2、Tis。出于此研究的目的，异常的膀胱镜检查结果是需要后续TURBT、上GU道检查或后续膀胱镜检查的所观察到的任何异常。异常的细胞学检查结果也是导致TURBT或上GU道检查或后续膀胱镜检查的任何异常。阳性的上GU道检查定义为组织学上证实的上GU道尿路上皮癌，然而阴性的上GU道检查定义为没有上GU道尿路上皮癌的临床证据。
所述测试用于验证的主要临床终点是基于患者的初始膀胱镜检查、细胞学检查(如果有)、TURBT或膀胱镜检查组织分析以及上GU检查得出的复发存在。通常，对具有来自TURBT或膀胱镜检查的阴性组织分析结果和/或具有来自上GU道检查结果的阴性组织分析的患者进行测试，以检查无癌症复发。根据来自TURBT/膀胱镜检查和/或上GU道检查的组织分析得出具有Ta低级别组织结果的患者进行测试，以检查复发风险低。根据来自TURBT/膀胱镜检查或上GU道检查的组织分析得出具有高级别、T1-T2、Tis组织结果的患者进行测试，以检查复发风险仍然高。
通过在FPE样品和尿液样品中进行定量PCR测量基因标记的甲基化水平。对于每个甲基化标记，均获得Cp测量值，并将所述测量值相对于来自参考标记的甲基化非依赖性测定进行归一化。如本文其他地方所述；计算每个样品的针对每个基因的甲基化分数(MF)。
统计分析将涉及约300名NMIBC患者，所述患者的膀胱癌甲基化结果获得自尿液和FPE组织样品。为了获得此数量的样品，所述研究将招募约380名患者。为了确定复发可能性与甲基化分析结果之间是否存在显著关系，如上文实施例3中所述，所述分析将拟合多项logistic回归模型。对于排除膀胱癌得分结果的无效模型与包括膀胱癌得分结果的完整模型之间的似然比检验，<0.05的p值被认为显著。
在特定割点的甲基化分析的性能将根据灵敏性、特异性、阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)来表征，用于预测任何复发并且单独预测高复发风险。这些参数将基于以上提到的logistic回归模型，用高复发风险和低复发风险的群体发生率的估计值(从为研究开始筛选的群体中得出)来计算。
还将考虑包括膀胱癌甲基化分析和现有风险评分系统在内的多变量模型，所述多变量模型包括具有甲基化分析结果和EORTC、CUETO和EAU复发风险或风险得分组的模型。(分别参见，R.J.Sylvester等人,Eur.Urol.49:466-75(2006)；J.Fernandez-Gomez等人,J.Urol.182:2195-203(2009)；和NCCN Clinical Practice Guidelines in OncologyBladder Cancer version 2.2015,在www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf.可查)
另外的分析将包括以下各项。第一，将使用来自监视访视的信息进行灵敏性分析。具体而言，在首次研究监视访视中无癌症复发但是在后续监视访视中具有复发的患者将在分析中被认为是复发，以评估甲基化测定在早期检测癌症复发的能力。在特定割点值下的甲基化结果的性能将根据灵敏性、特异性、NPV和PPV表征。第二，使用以上提到的多项logistic回归模型，低风险、高风险和任何复发的概率作为甲基化分析结果的函数，将通过使用高复发风险和低复发风险的群体发生率(从为研究开始筛选的群体中得出)的估计值来估计。如果基于logistic模型的假设不成立，则可以使用可替代的技术估计甲基化测定结果与复发可能性之间的关系，并且评价对于所选方法而言概率估计值的灵敏性。低风险、高风险和任何复发的概率将根据在高度预后协变量各个水平上的甲基化分析结果的函数进行估计。使用例如将非线性项或平滑样条纳入logistic模型中的方法还可以进行甲基化得分结果与复发可能性之间的关联的可替代函数形式。第三，通过拟合多项logistic回归模型(包括甲基化测试结果、给定的协变量和两者的相互作用)来评价由预后协变量定义的亚组中甲基化测试结果与复发概率之间的关系。可以调整所述模型用于其他的高度预后协变量。然后可以报告复发的亚组特定的优势比。

Claims (73)

1.一种监测患有膀胱癌的患者的方法，其包括：
从所述患者获得尿沉渣样品；
对来自所述样品的DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行甲基化特异性定量PCR，以确定所述样品中来自基因集的甲基化DNA的量和/或浓度，所述基因集包含选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者已被诊断为患有非肌肉浸润性膀胱癌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述患者的肿瘤先前已被诊断为Ta、Tis、T0或低级别；或为Ta、T0或低级别；或为Ta或低级别。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述患者的肿瘤先前已被诊断为T1或高级别；或为T1、Tis或高级别；或为T1-T2或高级别；或为Tis、T1-T2或高级别。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者已被诊断为患有肌肉浸润性膀胱癌。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法在膀胱镜检查之前进行。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法在阴性膀胱镜检查之后进行。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法进行至少每年一次，例如每六个月一次，或每三个月一次。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述至少四种基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述基因集进一步包含选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的至少一种基因。
12.根据权利要求1-8或10-11中任一项所述的方法，其中所述基因集包括以下基因集中的一个：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB。
13.根据权利要求1-8或10-11中任一项所述的方法，其中所述基因集由以下基因集中的一个组成：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；
(j)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB；和
至少一种参考基因。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述患者的复发风险，其包括将所述患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者参考组的甲基化的量和/或浓度进行比较。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析经硫酸氢盐转化的DNA中FGFR3和TERT之一或两者中的突变。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述方法进一步包括将FGFR3和/或TERT中突变的存在或不存在与膀胱癌患者参考组的这些进行比较。
18.一种治疗具有低复发风险的膀胱癌患者的方法，其包括：
从所述患者获得尿沉渣样品；
对来自所述样品的DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行甲基化特异性定量PCR，以确定所述样品中来自基因集的甲基化DNA的量和/或浓度，所述基因集包含选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因；
通过将所述患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者参考组的甲基化的量和/或浓度进行比较，来确定所述患者具有低复发风险；以及
以主动监视来治疗所述患者。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述以主动监视进行的治疗包括减少所述患者的膀胱镜检查的频率。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述患者已被诊断为患有非肌肉浸润性膀胱癌。
21.根据权利要求120所述的方法，其中所述患者的肿瘤先前已被诊断为Ta、Tis、T0或低级别；或为Ta、T0或低级别；或为Ta或低级别。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述患者的肿瘤先前已被诊断为T1或高级别；或为T1、Tis或高级别；或为T1-T2或高级别；或为Tis、T1-T2或高级别。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述方法在膀胱镜检查之前进行。
24.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述方法在阴性膀胱镜检查之后进行。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述至少四种基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述基因集进一步包含选自EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB的至少一种基因。
28.根据权利要求18-24或26-27中任一项所述的方法，其中所述基因集包括以下基因集中的一个：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB。
29.根据权利要求18-24或26-27中任一项所述的方法，其中所述基因集由以下基因集中的一个组成：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB；和
至少一种参考基因。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析经硫酸氢盐转化的DNA中FGFR3和TERT之一或两者中的突变。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述方法进一步包括将FGFR3和/或TERT中突变的存在或不存在与膀胱癌患者参考组的这些进行比较。
33.一种用于对来自膀胱癌患者的尿沉渣样品中的DNA甲基化进行定量的系统，其包括(a)具有至少一个孔的至少一个盒，所述至少一个孔包含引物，所述引物用于扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA，其中所述盒被配置用于对所述基因进行甲基化特异性定量PCR，并且其中所述引物任选地附着于所述至少一个孔；(b)用于检测从每个基因扩增的DNA的检测设备；以及(c)用于定量来自所述基因的甲基化DNA的量和/或浓度的计算机软件，其中所述软件任选地比较患者的甲基化的量和/或浓度与膀胱癌患者参考组的甲基化的量和/或浓度。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述盒被配置用于对包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2和至少一种参考基因的基因集进行甲基化特异性定量PCR。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
36.根据权利要求33、34或35所述的系统，其中所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
37.根据权利要求33所述的系统，其中所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集包括以下基因集中的一个：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。
38.根据权利要求33所述的系统，其中所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集由以下基因集中的一个组成：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和
至少一种参考基因。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的系统，其中所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的系统，其中所述引物附着于所述至少一个孔。
41.根据权利要求33-40中任一项所述的系统，其中所述盒进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
43.根据权利要求33-42中任一项所述的系统，其中所述系统能够进行根据权利要求1-17中任一项所述的方法。
44.一种盒，其包含至少一个孔，所述至少一个孔包含引物，所述引物用于扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA，其中所述盒被配置用于对所述基因进行甲基化特异性定量PCR，并且其中所述引物任选地附着于所述至少一个孔。
45.根据权利要求44所述的盒，其中所述盒被配置用于对包含MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2和至少一种参考基因的基因集进行甲基化特异性定量PCR。
46.根据权利要求44所述的盒，其中所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
47.根据权利要求44、45或46所述的盒，其中所述盒被配置用于对包含以下的基因集进行甲基化特异性定量PCR：MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
48.根据权利要求44所述的盒，其中所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集包括以下基因集中的一个：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。
49.根据权利要求44所述的盒，其中所述盒被配置用于对基因集进行甲基化特异性定量PCR，所述基因集由以下基因集中的一个组成：
(a)M1：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)M2：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)M3：MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)M4：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)M5：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)M6：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)M7：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)M8：ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；和
(i)M9：MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和
至少一种参考基因。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的盒，其中所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。
51.根据权利要求44-50中任一项所述的盒，其中所述引物附着于所述至少一个孔。
52.根据权利要求44-51中任一项所述的盒，其中所述盒进一步包含用于确定TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。
53.根据权利要求52所述的盒，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
54.一种试剂盒，其包含权利要求44-53中任一项所述的盒，并且进一步包含以下中的至少一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；和(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。
55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下的每一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；和(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。
56.根据权利要求54或55所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含至少一种检测试剂。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于对DNA进行亚硫酸氢盐转化的至少一种试剂。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含使用说明书。
61.一种组合物，其包含引物集，所述引物集用于PCR扩增选自MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A的至少四种基因和至少一种参考基因的经亚硫酸氢盐修饰的DNA。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2以及至少一种参考基因。
63.根据权利要求61所述的组合物，其中所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及OSR1、SOX1、EOMES、DDX25和TMEM106A中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的组合物，其中所述基因包括MEIS1、NKPD1、ONECUT2和KLF2，以及EPHX3、IRX5、NID2、VIM和ITPKB中的一种或多种，以及至少一种参考基因。
65.根据权利要求61所述的组合物，其包含用于基因集的甲基化特异性定量PCR的引物集，所述基因集包含：
(a)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；或
(i)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。
66.根据权利要求61所述的组合物，其包含用于基因集的甲基化特异性定量PCR的引物集，所述基因集由以下组成：
(a)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2和至少一种参考基因；
(b)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1和至少一种参考基因；
(c)MEIS1、NKPD1、KLF2、SOX1和至少一种参考基因；
(d)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES和至少一种参考基因；
(e)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、OSR1、TMEM106A；EPHX3和至少一种参考基因；
(f)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、IRX5和至少一种参考基因；
(g)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、SOX1、TMEM106A和至少一种参考基因；
(h)ONECUT2、OSR1、SOX1、EOMES、NID2、VIM和至少一种参考基因；或
(i)MEIS1、NKPD1、ONECUT2、KLF2、TMEM106A、ITPKB和至少一种参考基因。
67.根据权利要求61-66中任一项所述的组合物，其中所述至少一种参考基因包括CTNS、TOP3A、COL2A和SLC24A3中的一种或多种。
68.根据权利要求61-67中任一项所述的组合物，其进一步包含用于检测TERT和FGFR3之一或两者中的突变的试剂。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述FGFR3突变是FGFR3是在chr4:1803568处C变为G的取代，并且其中所述TERT突变是在chr5:1295228处G变为A的取代。
70.根据权利要求61-69中任一项所述的组合物，其进一步包含以下中的至少一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述组合物包含以下的每一种：(a)脱氧核糖核苷三磷酸dTTP、dATP、dCTP和dGTP；(b)至少一种DNA聚合酶；和(c)至少一种反应和/或洗涤缓冲液。
72.根据权利要求70或71所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种检测试剂。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含用于对DNA进行亚硫酸氢盐转化的至少一种试剂。
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