JP2009528825A - デュークスb大腸がんの再発を予測するための分子的解析 - Google Patents
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Abstract
【課題】大腸がんを評価することに関する。
【解決手段】大腸がんの状態を評価する方法は、遺伝子のグループの異なる発現を決定することにより実施される。特に、デュークスB大腸がんの再発患者と非再発者との間で区別するのに用いられる。
【選択図】図1
【解決手段】大腸がんの状態を評価する方法は、遺伝子のグループの異なる発現を決定することにより実施される。特に、デュークスB大腸がんの再発患者と非再発者との間で区別するのに用いられる。
【選択図】図1
Description
〔背景〕
本発明は、生物由来サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づく大腸がんの予後に関する。
本発明は、生物由来サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づく大腸がんの予後に関する。
大腸がんは、複数の起源を有する不均質な疾患である。一度患者が大腸がんについて治療されると、再発の可能性は、腸壁に対する腫瘍の貫通度、および、リンパ節転移(nodal involvement)の存在または不存在に関連する。これらの特徴は、デュークス分類(Duke's classification)によって定義される現在の病期分類システムの基準である。デュークスA疾患(Duke's A disease)は、結腸または直腸の粘膜下組織層に限局される。デュークスB腫瘍(Duke's B tumor)は、筋固有層に浸潤し、結腸壁または直腸壁を貫通しうる。デュークスC疾患(Duke's C disease)は、局所リンパ節転移を伴う任意の程度の腸壁浸潤を含む。
外科的切除は、早期の大腸がんに対して非常に効果的であり、デュークスA患者では95%、デュークスB患者では75%の治癒率を提供する。デュークスC疾患における陽性リンパ節の存在は、5年以内の再発可能性を60%と予測する。手術後の化学療法によるデュークスC患者の治療は、再発率を40%〜50%まで低減し、現在デュークスC患者のための標準的な治療法である。再発率が相対的に低いために、デュークスBでは、手術後の化学療法の有益性を認めることが難しく、議論があるままである。しかしながら、デュークスB分類の患者のおよそ20〜30%がデュークスCのようにふるまい、5年の期間内に再発するため、デュークスB分類は不完全なものである。
デュークスBを、再発しそうな者と生存するであろう者とに選別する指針となるような、リンパ節転移よりも、より良い予後因子を同定する必要があることが明らかである。Rosenwald et al. (2002);Compton et al. (2000);Ratto et al. (1998);Watanabe et al. (2001);Noura et al. (2002);Halling et al. (1999);Martinez-Lopez et al. (1998);Zhou et al. (2002);Ogunbiyi et al. (1998);Shibata et al. (1996);Sun et al. (1999);McLeod et al. (1999)参照。アジュバント療法(adjuvant therapy)を必要とし、アジュバント療法から利益を得る可能性があるであろう患者を同定することによって、このような情報は、より良い情報に基づく計画(better informed planning)を可能にするだろう。Johnston (2005);Saltz et al. (1997);Wolmark et al. (1999);International multicenter pooled analysis of B2 colon cancer trials (IMPACT B2) investigators: Efficacy of adjuvant fluorouracil and folinic acid in B2 colon cancer (1999);Mamounas et al. (1999)参照。
がんの診断と管理において、ゲノミクス(genomics)を臨床へ適用することは、発見と初期の検証研究とが完了するにつれて、活発になりつつある。Allen et al. (2005a);Allen et al. (2005b);Van't Veer et al. (2002);Van de Vijver et al. (2002);Wang et al (2005);Beer et al. (2002);Shipp et al. (2002)参照。更なる研究が発表されるにつれて、一般的な臨床実務では、これらの特性を遂行することに直面する課題への正当な評価が高まってきている。近年、Ransohoff (2005)とSimon et al. (2003)が、バイアスを消去する利点と、分子マーカー評価の重大な面と、について説明した。分子的特性をより広く採用することに関して、共通して明確に求められていることは、真に独立した患者集団における解析性能の検証である。DNAマイクロアレイに基づく解析が新鮮な凍結組織サンプルを必要とすることが、更なる制限である。結果的に、標準的な臨床材料[例えば、凍結パラフィン包埋(frozen paraffin embedded)(FPE)組織サンプル]に、これらの試験を容易には適用することができない。
共有の米国特許出願公開第20050048526号、同第20050048494号、同第20040191782号、同第20030186303号、同第20030186302号、Wang et al. (2005)により、大腸がんについての予後遺伝子発現プロファイルが開示されている。本明細書は、遺伝子発現プロファイルを決定するための材料および方法を開示する。
〔発明の概要〕
本発明は、大腸がんと診断されたか、または大腸がんを治療された患者において、大腸がんの再発可能性を評価するための材料および方法を提供する。その方法は、遺伝子発現プロファイルの分析を伴う。
本発明は、大腸がんと診断されたか、または大腸がんを治療された患者において、大腸がんの再発可能性を評価するための材料および方法を提供する。その方法は、遺伝子発現プロファイルの分析を伴う。
本発明の一態様では、遺伝子発現プロファイルには、少なくとも7個の特定遺伝子の発現を検出するためのプライマーおよびプローブが含まれる。
方法を実践する際に用いられる物品もまた、本発明の態様である。このような物品には、機械で読み取り可能な媒体(例えば、コンピュータで読み取り可能な媒体)に固定される遺伝子発現プロファイルもしくはそれらの説明が含まれる。
遺伝子発現プロファイルを同定するために用いられる物品には、遺伝子発現の存在、不存在、もしくは、程度を捉えるための、かつ/または、指摘するための基板もしくは表面(例えば、マイクロアレイ)もまた、含まれうる。
本発明の更に他の態様では、キットには、大腸がん再発についての予後の遺伝子発現分析を実施するための試薬が含まれる。
〔詳細な説明〕
バイオマーカーは、指示されたマーカー遺伝子の発現のレベルに係る任意の兆候である。兆候は、直接的または間接的でありうるし、所与の生理学的パラメーター、および、内部対照、正常組織、もしくは、他のがんと比較して、遺伝子のより高い発現、もしくは、より低い発現を測定しうる。バイオマーカーには、限定されないが、核酸(より高い発現およびより低い発現、直接的および間接的ともに)が含まれる。バイオマーカーとして核酸を用いることには、限定されないが、DNA増幅、RNA、マイクロRNA、ヘテロ接合性欠失(loss of heterozygosity)(LOH)、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)[SNPs;Brookes (1999)参照]、マイクロサテライトDNA、DNAハイポメチル化、もしくは、DNAハイパーメチル化を測定することを含んだ、当技術分野において既知の任意の方法が含まれうる。バイオマーカーとしてタンパク質を用いることには、限定されないが、量、活性、修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、ADPリボシル化、ユビキチン化等)、もしくは、免疫組織化学(immunohistochemistry)(IHC)を測定することを含んだ、当技術分野において既知の任意の方法が含まれる。他のバイオマーカーには、造影、細胞計数、アポトーシスマーカーが含まれる。
バイオマーカーは、指示されたマーカー遺伝子の発現のレベルに係る任意の兆候である。兆候は、直接的または間接的でありうるし、所与の生理学的パラメーター、および、内部対照、正常組織、もしくは、他のがんと比較して、遺伝子のより高い発現、もしくは、より低い発現を測定しうる。バイオマーカーには、限定されないが、核酸(より高い発現およびより低い発現、直接的および間接的ともに)が含まれる。バイオマーカーとして核酸を用いることには、限定されないが、DNA増幅、RNA、マイクロRNA、ヘテロ接合性欠失(loss of heterozygosity)(LOH)、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)[SNPs;Brookes (1999)参照]、マイクロサテライトDNA、DNAハイポメチル化、もしくは、DNAハイパーメチル化を測定することを含んだ、当技術分野において既知の任意の方法が含まれうる。バイオマーカーとしてタンパク質を用いることには、限定されないが、量、活性、修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、ADPリボシル化、ユビキチン化等)、もしくは、免疫組織化学(immunohistochemistry)(IHC)を測定することを含んだ、当技術分野において既知の任意の方法が含まれる。他のバイオマーカーには、造影、細胞計数、アポトーシスマーカーが含まれる。
本明細書に提供される指示された遺伝子は、特定の腫瘍または組織型と関連するものである。マーカー遺伝子は、本明細書で説明される方法や、デュークスB大腸がんの再発を予測するための当技術分野で既知の方法を用いて同定されるように、遺伝子の発現が、ある腫瘍または組織型と十分関連するならば、多くの種類のがんと関連していてもよい。本発明は、好ましいマーカー遺伝子を提供し、より好ましいマーカー遺伝子の組み合わせをも提供する。これらについて本明細書で詳細に説明する。
マーカー遺伝子は、配列番号によって指定された配列を含む場合、その配列に対応する。遺伝子断片またはフラグメントは、参照配列またはその相補配列の一部を、その遺伝子の配列であると識別できるほど十分に含む場合、このような遺伝子の配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのRNA、mRNA、もしくは、cDNAが、このような配列を有する組成物(例えば、プローブ)とハイブリダイゼーションする場合、または、ペプチドもしくはタンパク質ならば、このようなmRNAによりコードされる場合、このような配列に対応する。遺伝子発現産物の断片またはフラグメントは、参照遺伝子発現産物またはその相補物を、その遺伝子の配列または遺伝子発現産物であると識別できるほど十分に含む場合、このような遺伝子の配列または遺伝子発現産物に対応する。
本明細書で説明し、特許請求の範囲に記載した発明の方法、組成物、物品、キットには、1個以上のマーカー遺伝子が含まれる。「マーカー(Marker)」または「マーカー遺伝子(Marker gene)」は、本明細書を通じて、腫瘍または組織型と関連して、より高い発現またはより低い発現を示す任意の遺伝子と対応するような遺伝子および遺伝子発現産物を示すために、用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、配列番号7〜28に関連するものである。本発明のポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを、配列番号29〜79、94〜97に示す。本発明のアンプリコン(amplicons)を、配列番号5〜6、80〜93に示す。
1つの実施態様では、マーカー遺伝子は、配列番号7〜28のいずれか1つと関連するものである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つである。他の実施態様では、配列番号5〜6、80〜93のアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって、マーカーを同定する。本発明は、本明細書で提供される方法にしたがって解析を実施するためのキットを更に提供し、更にバイオマーカー検出試薬が含まれる。
本発明は、本明細書で説明される方法を実行するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを更に提供する。
本発明は、がんのための最適なバイオマーカーセットを得ることを含んだ、更なる臨床情報を入手し、治療の指示を示して、そのための適切な治療を同定し、予後を提供する方法を提供する。
本発明は、特定の転移におけるマーカー遺伝子の発現レベルを決定し、その発現を決定するためのマーカー遺伝子についてのバイオマーカーを測定し、本明細書で提供される方法または当技術分野で既知の方法のいずれかにしたがって、マーカー遺伝子の発現を分析し、マーカー遺伝子が予後について効果的に特異的であるかどうか決定することによって、バイオマーカーを見出す方法を更に提供する。
本発明は、本明細書で説明されるような遺伝子の組み合わせについての単離された核酸配列、その相補配列、もしくは、それらの部分配列を含んだ診断/予後のポートフォリオを更に提供する。その組み合わせは、異なるがんもしくは正常組織由来の細胞に対して、転移細胞を有する生物由来サンプルにおける遺伝子発現を測定し、または、特徴付けるのに十分であるものである。
本発明で説明される任意の方法には、サンプルにおいて構成的に発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定することが、更に含まれうる。
組織サンプルに特定の核酸配列が単に存在しているかまたは不存在であることのみでは、診断価値または予後価値を有するとはあまり見なされてこなかった。一方で、様々なタンパク質、ペプチド、もしくは、mRNAの発現に関する情報は、ますます重要であると見なされている。ゲノム内にタンパク質、ペプチド、もしくは、mRNAを発現する可能性を有する核酸配列(このような配列を「遺伝子」と呼ぶ)が単に存在していること自体は、所与の細胞で、タンパク質、ペプチド、もしくは、mRNAが発現するかどうかの決定要因ではない。タンパク質、ペプチド、もしくは、mRNAを発現することのできる所与の遺伝子かまたはそうでないかということ、そして、もしそうならば、このような発現がどの程度起こるかということは、様々な複合要因によって決定される。これらの要因を理解し、評価する困難性にも関わらず、遺伝子発現を解析することは、腫瘍形成、転移、アポトーシス、他の臨床上関連のある現象といった重要な事象が生じることに関して、有用な情報を提供することができる。遺伝子が活性であるか不活性であるかの程度についての相対的な指摘が、遺伝子発現プロファイルの中に見出される。本発明の遺伝子発現プロファイルは、診断を提供し、患者を治療するために用いられる。
サンプルの準備は、患者サンプルの収集を必要とする。本発明の方法で用いられる患者サンプルは、組織の細針吸引(fine needle aspirate)(FNA)で結節から採取された細胞のような異常な細胞を含んでいることが疑われるものである。生検または外科検体、およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture microdissection)から入手されるバルク組織標本(Bulk tissue preparation)も、使用に適している。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(Laser Capture Microdissection)(LCM)技術は、細胞型の不均質により引き起こされるばらつきを最小にするように、研究細胞を選択するための1つの方法である。したがって、正常細胞または良性細胞と、がん性細胞との間のマーカー遺伝子発現において、中程度の、または、小さな変化を容易に検出しうる。サンプルは、末梢血から抽出された循環上皮細胞をも含む。多くの方法にしたがってこれらを入手することができるが、最も好ましい方法は、米国特許第6136182号に記載されている磁気分離法である。一度、目的細胞を含んだサンプルが得られれば、適切なポートフォリオにおける遺伝子についてのバイオマーカーを用いて、遺伝子発現プロファイルが入手される。
遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法には、タンパク質またはペプチドをコードしうる遺伝子によって産生されるRNA量を決定することが含まれる。これは、逆転写PCR(reverse transcriptase PCR)(RT-PCR)、競合RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR、ノザンブロット分析(Northern Blot analysis)、および、他の関連する試験によって達成される。個別のPCR反応を用いて、これらの技術を実施することが可能であるが、mRNAから生成される相補的DNA(complementary DNA)(cDNA)または相補的RNA(complementary RNA)(cRNA)を増幅し、マイクロアレイによってそれを分析することが最も良い。多くの異なるアレイ配置、および、それらを製造する方法が、当業者に既知であり、例えば、米国特許第5445934号、同第5532128号、同第5556752号、同第5242974号、同第5384261号、同第5405783号、同第5412087号、同第5424186号、同第5429807号、同第5436327号、同第5472672号、同第5527681号、同第5529756号、同第5545531号、同第5554501号、同第5561071号、同第5571639号、同第5593839号、同第5599695号、同第5624711号、同第5658734号、および、同第5700637号で説明されている。
マイクロアレイ技術は、何千もの遺伝子の定常状態のmRNAレベルを測定することを可能にし、同時に、制御されていない細胞増殖の開始、停止、もしくは、調節といった効果を同定するための強力なツールを提供する。2つのマイクロアレイ技術、cDNAアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイが、現在広く用いられている。これらのチップの構成には違いが存在するが、すべての下流データ分析および出力は、本質的に同じものである。これらの解析の産物は、一般的に、サンプル由来のcDNA配列を検出するために用いられる標識プローブから受容されるシグナルの強度を測定することであり、そのプローブは、マイクロアレイ上の既知の位置で核酸配列にハイブリダイゼーションする。一般的に、シグナルの強度はcDNA、すなわち、サンプル細胞で発現するmRNAの量と比例する。このような技術の多くが利用可能であり有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第6271002号、同第6218122号、同第6218114号、および、同第6004755号に見られる。
発現レベルの分析は、このようなシグナル強度を比較することによって実施される。このことは、対照サンプルでの遺伝子の発現強度に対する試験サンプルでの遺伝子の発現強度についての比率行列(ratio matrix)を生成することにより、なされるのが最も良い。例えば、異常組織由来の遺伝子発現強度を、同じ種類の良性組織または正常組織から生成される発現強度と比較することができる。これらの発現強度の比率は、試験サンプルと対照サンプルとの間の遺伝子発現が、倍数的に異なることを示している。
選択は統計的検定に基づきうる。この統計的検定は、ランク付けされたリストを作り出し、そのランク付けされたリストは、腫瘍の予後に関係する因子間で、各遺伝子が異なる発現をすることについての有意性の証拠に関係する。このような検定の例には、ANOVAおよびクラスカル・ウォリス(Kruskal-Wallis)が含まれる。カットオフまでのこのような重みの総計を、他のクラス以上に1つのクラスに有利になるような証拠の優越として解釈するように設計されたモデルにおいて、そのランキングを重み付けとして用いることができる。また、文献に記載されたような従来の証拠を、その重み付けを調整するために用いてもよい。
好ましい実施態様は、安定した対照セットを同定し、このセットをすべてのサンプルのゼロ分散に設定することによって、各測定を正規化することである。この対照セットは、解析における系統誤差により影響されるが、この誤差と独立に変化することが知られていない、任意の単一の内因性転写産物、もしくは、内因性転写産物のセットとして定義される。すべてのマーカーは、対照セットの任意の記述的統計値(例えば、平均値または中央値)に対するゼロ分散、もしくは、直接測定に対するゼロ分散を生むサンプル特異的な因子によって調整される。あるいは、統計誤差にのみ関係する対照の分散に係る前提が真ではないが、正規化が実行されると、結果的な分類誤差がより小さくなる場合、対照セットはなお、述べられたように用いられるだろう。非内因性スパイクコントロールも役立ちうるが、好ましくない。
遺伝子発現プロファイルは、多くの方法で表示されうる。最も一般的な方法は、生の蛍光強度もしくは比率行列を、縦軸が試験サンプルを示し、かつ横軸が遺伝子を示す図形的な系統樹に配置することである。よく似た発現を有する遺伝子が互いに近位にあるように、データを配置する。各遺伝子の発現率は、色により視覚化される。例えば、1より低い発現率[ダウンレギュレーション(down-regulation)]は、スペクトルの青の部分に現れ、1より高い発現率[アップレギュレーション(up-regulation)]は、スペクトルの赤の部分に現れる。市販のコンピュータソフトウェアプログラムが、このようなデータを表示するために利用でき、それらには「GeneSpring」(Silicon Genetics, Inc.)、「Discovery」および「Infer」(Partek, Inc.)が含まれる。
原発腫瘍または転移腫瘍から、豊富な独自のRNA種についての測定値を収集する。限定されないが、患者の年齢、性別、原発腫瘍の起源部位、(もし適用できるならば)転移部位を含む臨床記録に加えて、これらの解釈が関連型データベースを作成するために用いられる。腫瘍再発の危険度を予測するためのマーカー変数として用いうるRNA転写産物および臨床上の因子を選択するために、そのデータベースが用いられる。
遺伝子発現を決定するためにタンパク質レベルを測定する場合、結果的に適当な特異度と感度をもたらすならば、当技術分野で既知の任意の方法が適している。例えば、タンパク質レベルは、タンパク質に特異的な抗体または抗体断片に結合し、抗体結合タンパク質の量を測定することによって、測定されうる。検出を容易にするために、放射性物質、蛍光物質、もしくは、他の検出可能な試薬で、抗体を標識することができる。検出方法には、限定されないが、酵素免疫測定法(enzyme linked immunosorbent assay)(ELISA)、免疫ブロット法(immunoblot techniques)が含まれる。
本発明の方法で用いられる調節された遺伝子については、実施例で説明する。差異のあるように発現する遺伝子は、再発患者では、デュークスB大腸がんを再発しない者に対して、アップレギュレーションされるか、またはダウンレギュレーションされるかのいずれかである。アップレギュレーション、およびダウンレギュレーションは、遺伝子の発現量について、いくつかの基準に比較して(測定に用いられた系におけるノイズの寄与よりも)検出可能な差異が見られることを意味する相対的な用語である。本願の場合、基準を分類ツリーに基づいて決定する。したがって、異常細胞(diseased cell)における目的遺伝子は、同じ測定方法を用いた基準レベルと比較して、アップレギュレーションされるか、またはダウンレギュレーションされるか、のいずれかである。異常な(diseased)とは、本明細書の内容においては、制御されない細胞増殖とともに起こるような、身体機能の適切な作動を中断するか(すなわち、阻害するか)、阻害する可能性がある体の状態変化を示す。個人の遺伝型または表現型といったいくつかの観点が疾患の存在と一致する場合、人はその疾患に罹っていると診断される。しかしながら、診断または予後を実施するという行為には、再発可能性、治療の種類、治療観察を決定するといった疾患/状態に関する課題の決定も含まれてもよい。治療観察では、遺伝子発現プロファイルが、正常組織とより矛盾のないパターンに変化したかどうか、または変化しているかどうか、を決定するために、時間をかけて遺伝子発現を比較することで、所与の一連の治療の効果について臨床判断がなされる。
遺伝子はグループ分けされることができ、それにより、グループにおける遺伝子セットについて得られた情報が、臨床上関連のある判断(例えば、診断、予後、もしくは、治療選択)をなすための重要な基礎を提供する。これらの遺伝子セットは、発明のポートフォリオを作り出す。最も診断的なマーカーを用いるとともに、正しい医療判断をなすために十分な最少の数のマーカーを用いることがしばしば望ましい。このことは、時間と資源の非生産的な使用を予防するのと同様に、未だ行われていない更なる治療における遅延を予防する。
遺伝子発現ポートフォリオを確立する1つの方法は、株式ポートフォリオを確立する際に広く用いられる平均分散アルゴリズムのような、最適化アルゴリズムを使用することを通じた方法である。この方法は、米国特許出願公開第20030194734号に詳細に説明されている。本質的に、その方法は、入力セット(金融上の適用においては株式、本願においては強度により測定されるような発現)の確立を要求する。その入力は、リターンの変動を最小化する一方で、それを用いることで受けるリターン(例えば、生成されるシグナル)を最適化するであろうものである。多くの商用ソフトウェアプログラムが、このような作業を実施するために利用できる。「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application」は、本明細書を通して「Wagner Software」と呼ばれており、好まれる。有効フロンティアを決定するために、このソフトウェアは、「Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library」の関数を用い、そして、マーコウィッツの意味における最適ポートフォリオが好まれる。Markowitz (1952)参照。このタイプのソフトウェアを用いるには、ソフトウェアを意図された金融分析の目的で用いる場合に株式収益と危険度評価が用いられる点で、入力として処理することが可能になるように、マイクロアレイデータを変換することが必要となる。
また、ポートフォリオを選択するプロセスには、ヒューリスティックなルール(heuristic rules)の適用が含まれうる。好ましくは、このようなルールを、生物学に基づいて、そして、臨床上の結果を生むために用いられる技術への理解に基づいて、処方する。より好ましくは、それらを最適化法からの出力に適用する。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散法は、がん患者において差異のある発現をする多くの遺伝子についてのマイクロアレイデータに適用されうる。その方法の出力は、異常組織と同様に末梢血でも発現するいくつかの遺伝子を含みうる最適化された遺伝子セットであるだろう。もし試験方法で用いられるサンプルが末梢血から入手され、がんの症例で差異があるように発現する特定の遺伝子が、末梢血でも差異があるように発現しうるならば、ヒューリスティックなルールを適用しうる。そのヒューリスティックなルールにおいて、ポートフォリオは、末梢血で差異のあるように発現するものを除いた有効フロンティアから選択される。もちろん、そのルールは、有効フロンティア形成に先立って、例えば、データの前もっての選択中にそのルールを適用することによって、適用されうる。
問題になっている生物学とは必ずしも関連している必要はない他のヒューリスティックなルールを、適用することができる。。例えば、所定の割合のポートフォリオのみが、特定の遺伝子もしくは遺伝子群によって表されることができるというルールを適用しうる。市販のソフトウェア(例えば、Wagner Software)は、容易にこれらのタイプのヒューリスティクスと適合する。このことは、例えば、確度と精度とは別の因子(例えば、期待されるライセンス料)が、1つ以上の遺伝子を含むことの望ましさに影響力がある場合に、有用でありうる。
また、本発明の遺伝子発現プロファイルを、がんの診断、予後、もしくは、治療観察において有用な、他の非遺伝的診断法と合わせて用いることもできる。例えば、いくつかの状況では、上記の方法に基づいた遺伝子発現の診断力を、例えば、血清タンパク質マーカー[例えば、がん抗原(Cancer Antigen)27.29(「CA 27.29」)]のような従来マーカーと組み合わせることが有用である。このようなマーカーの範囲は、CA27.29のような分析対象を含んで存在する。このような方法の1つでは、血液を治療患者から定期的に採取し、その後、上記の血清マーカーの1つについて酵素免疫測定を行う。マーカーの濃度が、腫瘍の再発、または、治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現分析に適しているサンプル原料を採用する。疑わしい塊が存在する場所で細針吸引(FNA)を採用し、その後、塊から採取された細胞の遺伝子発現プロファイルを、上記のように分析する。あるいは、組織サンプルを、以前に腫瘍が除去された組織の近傍の領域から採取してもよい。特に、このアプローチは、他の試験があいまいな結果を生じる場合に有用である。
本発明にしたがって作られるキットには、遺伝子発現プロファイルを決定するためのフォーマット化された解析が含まれる。これらには、バイオマーカーを解析する試薬、使用説明書、媒体のような解析を実施するために必要とされるすべての材料、または、いくつかの材料が含まれうる。
本発明の物品には、疾患を治療し、診断し、予後し、さもなければ、評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの説明が含まれる。これらのプロファイルの説明は、コンピュータで読み取り可能な媒体(磁気的、光学的、同様の媒体)のような、機械によって自動的に読むことができる媒体へ変換される。物品には、このような媒体で遺伝子発現プロファイルを評価するための使用説明書も含まれうる。例えば、物品は、上記の遺伝子ポートフォリオについての遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータの使用説明書を有するCD-ROMを備えてもよい。物品はまた、電子的に記録された遺伝子発現プロファイルを有していてもよく、それらを患者サンプルの遺伝子発現データと比較してもよい。あるいは、プロファイルを異なる表現フォーマットで記録することができる。図形的な記録はこのようなフォーマットの1つである。例えば、上記のPartek, Inc.の「DISCOVERY」、「INFER」ソフトウェアに組み込まれているような、クラスタリングアルゴリズム(clustering algorithms)は、このようなデータの視覚化の際に、最も良く役立ちうる。
本発明にしたがって製造される異なる種類の物品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いられる媒体、または、フォーマット化された解析である。これらは、例えば、マイクロアレイを含むことができ、そのマイクロアレイにおいて、相補配列またはプローブが、目的の遺伝子を示す配列が結合して読み取り可能なそれらの存在の決定因子を生成するマトリックスに、貼り付けられる。あるいは、本発明に係る物品を、がんを検出するための目的の遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーション、増幅、シグナル生成を実施するための試薬キットへと作り上げることができる。
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載した発明を例示したものではあるが、これに限定されない。本明細書に引用したすべての参照文献は、参照により本明細書に組み入れる。
本発明の好ましいプロファイルは、表2に示される7個の遺伝子ポートフォリオと、表3に示される15個の遺伝子ポートフォリオである。その他の独立に検証された大腸予後遺伝子(例えば、Cadherin 17)と、表2と表3の両方の遺伝子の組み合わせとともに作られた遺伝子発現ポートフォリオが、最も好ましい(表4)。この最も好ましいポートフォリオは、高い再発危険度のデュークスB患者を、そうではない者から、最もよく分離する。一度危険度の高い患者を同定すると、その後、その患者をアジュバント療法で治療することができる。他の独立に検証された予後遺伝子を、Cadherin 17の代わりに用いることができる。
本発明において、大腸がんの予後を決定するために患者の遺伝子発現パターンを分析するための最も好ましい方法は、コックスハザード分析プログラムを用いるものである。最も好ましくは、その分析を、S-Plusソフトウェア(Insightful Corporationから市販されている)を用いて実施する。このような方法を用いて、遺伝子発現プロファイルを、明確に再発を示す(すなわち、プロファイルにおける遺伝子の組み合わせについての発現レベルが、再発を示している)プロファイルと比較する。確立された閾値を有するコックスハザードモデルを、2つのプロファイル(既知の再発者対患者)の類似性を比較するために用い、その後、患者プロファイルが閾値を超えるかどうか決定する。もし患者プロファイルが閾値を越えるならば、患者を再発するであろう者として分類し、アジュバント療法のような治療を行う。患者プロファイルが閾値を超えていないならば、再発しない患者として分類する。他の分析ツール(例えば、線形判別分析、ロジスティック回帰、ニューラルネットワークアプローチ)もまた、同じ問いに答えるために用いられうる。
パターン認識に関する多くの他の周知の方法が利用できる。以下の参照文献は、いくつかの例を提示する。
加重投票:Golub et al. (1999)
サポートベクターマシン、k近傍法:Su et al. (2001);Ramaswamy et al. (2001)
相関係数:Van't Veer et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer Nature 415:530-536
加重投票:Golub et al. (1999)
サポートベクターマシン、k近傍法:Su et al. (2001);Ramaswamy et al. (2001)
相関係数:Van't Veer et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer Nature 415:530-536
また、本発明の遺伝子発現プロファイルを、がんの診断、予後、もしくは、治療観察において有用な、他の非遺伝的診断法とあわせて用いることができる。例えば、いくつかの状況では、上記の方法に基づいた遺伝子発現の診断力を、例えば、血清タンパク質マーカー[例えば、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen)]のような従来マーカーと組み合わせることが有用である。このようなマーカーの範囲は、CEAのような分析対象を含んで存在する。このような方法の1つでは、血液を治療患者から定期的に採取し、その後上記の血清マーカーの1つについて酵素免疫測定を行う。マーカーの濃度が腫瘍の再発、または、治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現分析に適しているサンプル原料を採用する。疑わしい塊が存在するところで、細針吸引を採用し、その後、塊から採取された細胞の遺伝子発現プロファイルを、上記のように分析する。あるいは、組織サンプルを、以前に腫瘍が除去された組織の近傍の領域から採取してもよい。特に、このアプローチは他の試験があいまいな結果を生じる場合に有用である。
本発明の物品には、疾患を治療し、診断し、予後し、さもなければ、評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの説明が含まれる。これらのプロファイルの説明は、コンピュータで読み取り可能な媒体(磁気的、光学的、同様の媒体)のような、機械によって自動的に読むことができる媒体へ変換される。物品には、このような媒体で遺伝子発現プロファイルを評価するための使用説明書も含まれうる。例えば、物品は、上記の遺伝子ポートフォリオについての遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータの使用説明書を有するCD-ROMを備えてもよい。物品はまた、電子的に記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それらを患者サンプルの遺伝子発現データと比較してもよい。あるいは、プロファイルを異なる表現フォーマットで記録することができる。図形的な記録はこのようなフォーマットの1つである。例えば、上記のPartek, Inc.の「DISCOVERY」、「INFER」ソフトウェアに組み込まれているような、クラスタリングアルゴリズムは、このようなデータの視覚化の際に、最も良く役立ちうる。
本発明にしたがって製造される異なる種類の物品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために用いられる媒体、または、フォーマット化された解析である。これらは、例えば、マイクロアレイを含むことができ、そのマイクロアレイにおいて、相補配列またはプローブが、目的の遺伝子を示す配列が結合し読み取り可能なそれらの存在の決定因子を生成するマトリックスに、貼り付けられる。あるいは、本発明に係る物品を、大腸がんを検出するための目的の遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーション、増幅、シグナル生成を実施するための試薬キットへと作り上げることができる。
本発明にしたがって作られるキットには、遺伝子発現プロファイルを決定するためのフォーマット化された解析が含まれる。これらには、バイオマーカーを解析する試薬、使用説明書、媒体のような解析を実施するために必要とされるすべての材料、または、いくつかの材料が含まれうる。
本発明で有用なプライマーおよびプローブには、限定されないが、以下のものの1つもしくはいくつかが含まれる。
Laforinフォワード,cattattcaaggccgagtacagatg;配列番号29
Laforinリバース,cacgtacacgatgtgtcccttct;配列番号30
Laforinプローブ,caggcggtgtgcctgctgcat;配列番号31
RCC1フォワード,tttgtggtgcctatttcaccttt;配列番号32
RCC1リバース,cggagttccaagctgatggta;配列番号33
RCC1プローブ,ccacgtgtacggcttcggcctc;配列番号34
YWHAHフォワード,ggcggagcgctacga;配列番号35
YWHAHリバース,ttcattcgagagaggttcattcag;配列番号36
YWHAHプローブ,cctccgctatgaaggcggtga;配列番号37
β-actinフォワード,aagccaccccacttctctctaa;配列番号38
β-actinリバース,aatgctatcacctcccctgtgt;配列番号39
β-actinプローブ,agaatggcccagtcctctcccaagtc;配列番号40
HMBSフォワード,cctgcccactgtgcttcct;配列番号41
HMBSリバース,ggttttcccgcttgcagat;配列番号42
HMBSプローブ,ctggcttcaccatcg;配列番号43
GUSBフォワード,tggttggagagctcatttgga;配列番号44
GUSBリバース,actctcgtcggtgactgttcag;配列番号45
GUSBプローブ,ttttgccgatttcatg;配列番号46
RPL13Aフォワード,cggaagaagaaacagctcatga;配列番号47
RPL13Aリバース,cctctgtgtatttgtcaattttcttctc;配列番号48
RPL13Aプローブ,cggaaacaggccgagaa;配列番号49
Laforinフォワード,cattattcaaggccgagtacagatg;配列番号29
Laforinリバース,cacgtacacgatgtgtcccttct;配列番号30
Laforinプローブ,caggcggtgtgcctgctgcat;配列番号31
RCC1フォワード,tttgtggtgcctatttcaccttt;配列番号32
RCC1リバース,cggagttccaagctgatggta;配列番号33
RCC1プローブ,ccacgtgtacggcttcggcctc;配列番号34
YWHAHフォワード,ggcggagcgctacga;配列番号35
YWHAHリバース,ttcattcgagagaggttcattcag;配列番号36
YWHAHプローブ,cctccgctatgaaggcggtga;配列番号37
β-actinフォワード,aagccaccccacttctctctaa;配列番号38
β-actinリバース,aatgctatcacctcccctgtgt;配列番号39
β-actinプローブ,agaatggcccagtcctctcccaagtc;配列番号40
HMBSフォワード,cctgcccactgtgcttcct;配列番号41
HMBSリバース,ggttttcccgcttgcagat;配列番号42
HMBSプローブ,ctggcttcaccatcg;配列番号43
GUSBフォワード,tggttggagagctcatttgga;配列番号44
GUSBリバース,actctcgtcggtgactgttcag;配列番号45
GUSBプローブ,ttttgccgatttcatg;配列番号46
RPL13Aフォワード,cggaagaagaaacagctcatga;配列番号47
RPL13Aリバース,cctctgtgtatttgtcaattttcttctc;配列番号48
RPL13Aプローブ,cggaaacaggccgagaa;配列番号49
これらのプライマーとプローブには、対象遺伝子の既知の配列に基づいた5’と3’両側に、約1〜5個の塩基が含まれうる。好ましくは、PCR反応における対象遺伝子の発現を測定するために、プライマーとプローブセットとをあわせて用いる。
以下の非限定的な実施例によって、本発明を更に説明する。本明細書で引用した参照文献を、参照により本明細書に組み入れる。
≪実施例≫
本発明にしたがって分析される遺伝子は、一般的に、タンパク質またはペプチドの産生をコードする全長の核酸配列に関する。全長配列が分析上の観点から必ずしも必要でないことを、本分野における当業者は認識するだろう。すなわち、対応する遺伝子についての遺伝子発現を評価するようにプローブを設計することができる周知の原則にしたがって、配列の部分またはESTを選択しうる。
本発明にしたがって分析される遺伝子は、一般的に、タンパク質またはペプチドの産生をコードする全長の核酸配列に関する。全長配列が分析上の観点から必ずしも必要でないことを、本分野における当業者は認識するだろう。すなわち、対応する遺伝子についての遺伝子発現を評価するようにプローブを設計することができる周知の原則にしたがって、配列の部分またはESTを選択しうる。
〔実施例1〕
≪サンプルの取り扱いとLCM≫
大腸腫瘍について手術を受けた患者から、新鮮な凍結組織サンプルを収集した。用いられたサンプルは、標準的な臨床診断および病理学にしたがってデュークスBと病期分類された63人の患者由来のものであった。患者の臨床結果は既知であった。36人の患者が3年より長く無病のままであったが、27人の患者は3年以内に腫瘍再発した。
≪サンプルの取り扱いとLCM≫
大腸腫瘍について手術を受けた患者から、新鮮な凍結組織サンプルを収集した。用いられたサンプルは、標準的な臨床診断および病理学にしたがってデュークスBと病期分類された63人の患者由来のものであった。患者の臨床結果は既知であった。36人の患者が3年より長く無病のままであったが、27人の患者は3年以内に腫瘍再発した。
組織を、採取後20〜30分以内に液体窒素で急速凍結し、その後-80℃で保管した。レーザーキャプチャーのために、サンプルを切断し(6μm)、1つの切片をガラススライドの上に、第2の切片をフィルム(P.A.L.M.)の上にのせ、ガラススライド(Micro Slides Colorfrost;VWR Scientific, Media, PA)の上で固定した。ガラススライドの上にのせた切片を、固定後、冷アセトンの中に入れ、メイヤーのヘマトキシリン(Mayer's Haematoxylin)(Sigma, St. Louis, MO)で染色した。病理学者がサンプルを、診断およびグレード(grade)のために分析した。デュークス分類を検証するために、付随する外科病理学および臨床報告から、臨床病期を推定した。フィルムの上にのせられた切片を、固定後5分間、100%エタノールに入れ、エオシン/100%エタノール(エオシン100μg、脱水エタノール100mL)で1分間対比染色し、余分な染色液を除去するために一度100%エタノールに少し浸し、10分間風乾した。
LCMに使用する前に、RNaseを破壊し組織サンプルのフィルムへの付着を高めるために、メンブレン(LPC-MEMBRANE PEN FOIL 1.35 μm No 8100;P.A.L.M. GmbH Mikrolaser Technologie, Bernried, Germany)とスライドとをあらかじめ処理した。簡単に言えば、スライドをDEP水で洗浄し、そして、フィルムをRNase AWAY(Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA)で洗浄した後、DEP水ですすいだ。フィルムをガラススライドの上に付着させた後、スライドを120℃で、8時間焼き、TI-SAD(Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA)(DEP水の中に1:50、精製綿でろ過した)で処理し、37℃で、30分間インキュベーションした。使用する直前に、RNase阻害溶液10μL分割量[Rnasin Inhibitor 2500U=33U/μL N211A(Promega GmbH, Mannheim, Germany)0.5μL、凍結溶液(0.15M NaCl、10mM Tris pH 8.0、0.25mmol ジチオトレイトールを含む)400μL]をフィルムの上に広げ、組織サンプルをのせた。
フィルムにのせた組織切片をLCMに使用した。Zeiss Axiovert 135顕微鏡(Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany)に組み合わせたPALM Robot-Microbeam technology(P.A.L.M. Mikrolaser Technologie;Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)を用いて、およそ2,000個の上皮細胞/サンプルを捕獲した。正常粘膜では周辺の間質を含み、がんサンプルでは偶然介在する間質成分を含んでいた。捕獲された細胞を100%エタノールの入ったチューブに入れ、-80℃で保存した。
〔実施例2〕
≪RNA抽出と増幅≫
LCM捕獲サンプルから全RNAを抽出するために、Zymoスピンカラム(Zymo-Spin Column)(Zymo Research, Orange, CA 92867)を用いた。約2ngの全RNAを水10μLに再懸濁し、T7 RNAポリメラーゼによる増幅を2ラウンド実行し、約50μgの増幅RNAを産生した。
≪RNA抽出と増幅≫
LCM捕獲サンプルから全RNAを抽出するために、Zymoスピンカラム(Zymo-Spin Column)(Zymo Research, Orange, CA 92867)を用いた。約2ngの全RNAを水10μLに再懸濁し、T7 RNAポリメラーゼによる増幅を2ラウンド実行し、約50μgの増幅RNAを産生した。
〔実施例3〕
≪DNAマイクロアレイハイブリダイゼーションと定量≫
およそ23,000個のヒトクローンで構成されるDNAマイクロアレイのセットを、Affymetrix, Inc.から入手し市販されているhumanU133aチップを使用することにより、サンプルを試験するために用いた。全RNAを上記に概説したように入手し準備して、チップに適用し、業者のプロトコルにしたがって、Agilent BioAnalyzerで分析した。63個すべてのサンプルが品質管理基準を通過し、そのデータをマーカー選択のために用いた。
≪DNAマイクロアレイハイブリダイゼーションと定量≫
およそ23,000個のヒトクローンで構成されるDNAマイクロアレイのセットを、Affymetrix, Inc.から入手し市販されているhumanU133aチップを使用することにより、サンプルを試験するために用いた。全RNAを上記に概説したように入手し準備して、チップに適用し、業者のプロトコルにしたがって、Agilent BioAnalyzerで分析した。63個すべてのサンプルが品質管理基準を通過し、そのデータをマーカー選択のために用いた。
チップの強度データを、Affymetrix, Inc.から市販されているMAS Version 5.0ソフトウェア(「MAS 5.0」)を用いて分析した。再発するであろう患者をそうでない者と区別するような2個の遺伝子を同定するために、以下のとおり、教師なし分析(unsupervised analysis)を用いた。
上記のように得られたチップ強度のデータを、PARTEK version 5.1ソフトウェアとして市販されている、教師なしクラスタリングソフトウェア(unsupervised clustering software)についての入力とした。この教師なしクラスタリングアルゴリズムは、高い再発率を有する20人の患者グループ(再発者13人、生存者7人)を同定した。試験分析により、もともとの23,000個の遺伝子から、これらの患者で有意に異なって発現する276個の遺伝子を選択した。このグループから、再発患者を再発しない者から最も良く区別する2個の遺伝子、Human intestinal peptide-associated transporter(配列番号3)とHomo sapiens fatty acid binding protein 1(配列番号1)を選択した。これら2個の遺伝子は、この患者グループの再発患者で、ダウンレギュレーションされる(つまり、遮断されるか、発現しない)。
その後、残りの43人の患者について、再発患者を再発しない患者から更に区別するために、教師あり分析(Supervised analysis)を実施した。この患者データのグループを、次に、以下のグループに分けた。27人の患者を訓練セットとして割り当て、16人の患者を試験セットとして割り当てた。このことにより、マーカーを同定するためにもその後その実用を検証するためにも、同じデータを用いなかったことが保証された。
不等分散t検定を訓練セットに実行した。有意に補正されたp値を有する28個の遺伝子のリストから、MHC II-DR-Bを選んだ。これらの遺伝子は、再発者においてダウンレギュレーションされる。また、MHC II-DR-B(配列番号2)は最も小さいp値を有した。
教師あり分析の更なるラウンドで、訓練セットにおいて再発者を生存者から分離するために、上記のPartek Version 5.0ソフトウェアを用いて、線形判別分析のための変数選択手順を実施した。検索方法は前進選択であった。最も低い事後誤差で選択された変数は、immunoglobulin-like transcript 5 protein(配列番号4)であった。その後、コックス比例ハザードモデル(Insightful, Inc.の「S-Plus」ソフトウェアを用いた)を遺伝子選択のために用い、生存期間について上記で同定された遺伝子選択を確認した。全27回のサイクルの各サイクルで、訓練セットにおける27人の患者のいずれか1人を取り除き、遺伝子発現と患者生存期間との関連の強固性を評価するために、残りの26人の患者を単変量コックスモデル回帰において用いた。対応する推定された規格化パラメーターの推定値と、コックスモデル回帰から導かれたP値によって、このような関連の強固性を評価した。1つ取り除き(leave-one-out)遺伝子選択の各サイクルから最上位の遺伝子を選択するための閾値として、P=0.01を用いた。その後、全27回の1つ取り除き遺伝子選択サイクルにおいて、少なくとも26回現れたものを選択するために、各サイクルから選択された最上位の遺伝子を比較した。全体で70個の遺伝子を選択し、MHC II-DR-Bとimmunoglobulin-like transcript 5 proteinの両方が共通していた(再び、ダウンレギュレーションを示した)。
<複数の遺伝子予測因子の構築>
線形判別分析を用いて予測因子を産生するために、2個の遺伝子、MHC II-DR-Bとimmunoglobulin-like transcript 5 proteinを用いた。投票スコアを再発の事後確率として定義した。患者のスコアが0.5より高い場合、患者を再発者に分類した。患者のスコアが0.5よりも低い場合、患者を生存者に分類した。予測因子を訓練セットで試験した。
線形判別分析を用いて予測因子を産生するために、2個の遺伝子、MHC II-DR-Bとimmunoglobulin-like transcript 5 proteinを用いた。投票スコアを再発の事後確率として定義した。患者のスコアが0.5より高い場合、患者を再発者に分類した。患者のスコアが0.5よりも低い場合、患者を生存者に分類した。予測因子を訓練セットで試験した。
<予測因子の交差検定と評価>
予測因子の性能は、独立したデータセットで決定されるべきである。なぜならば、ほとんどの分類方法は、それらを確立するために用いた例で、良く機能するからである。16人の患者の試験セットを、予測の精度を評価するために用いた。分類についてのカットオフを、ROC曲線を用いることで決定した。選択されたカットオフで、試験セットにおける再発患者と生存患者についての正しい予測の数を決定した。
予測因子の性能は、独立したデータセットで決定されるべきである。なぜならば、ほとんどの分類方法は、それらを確立するために用いた例で、良く機能するからである。16人の患者の試験セットを、予測の精度を評価するために用いた。分類についてのカットオフを、ROC曲線を用いることで決定した。選択されたカットオフで、試験セットにおける再発患者と生存患者についての正しい予測の数を決定した。
<全体の予測>
63人のデュークスB大腸がん患者の遺伝子発現プロファイリングによって、これらの患者で差異のある発現(ダウンレギュレーションか遮断されるか)を有する4個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4である。36人の患者が3年を超えて無病のままであったが、27人の患者が3年以内に腫瘍再発した。配列番号2、配列番号3、配列番号4の3個の遺伝子マーカーポートフォリオを用いることで、27人の再発患者のうちの22人、36人の無病患者のうちの27人を正確に同定する。この結果は、感度82%、特異度75%を示す。陽性予測値は71%で、陰性予測値は84%である。
63人のデュークスB大腸がん患者の遺伝子発現プロファイリングによって、これらの患者で差異のある発現(ダウンレギュレーションか遮断されるか)を有する4個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4である。36人の患者が3年を超えて無病のままであったが、27人の患者が3年以内に腫瘍再発した。配列番号2、配列番号3、配列番号4の3個の遺伝子マーカーポートフォリオを用いることで、27人の再発患者のうちの22人、36人の無病患者のうちの27人を正確に同定する。この結果は、感度82%、特異度75%を示す。陽性予測値は71%で、陰性予測値は84%である。
〔実施例4〕
≪更なるサンプル収集≫
その後、デュークスB大腸がん患者由来とされた74個の凍結腫瘍標本を研究した。原発腫瘍および隣接する非腫瘍性大腸組織を、手術時に収集した。診断と一様な腫瘍の浸潤を確認するために、各標本の組織病理学を再検査した。分析のために選ばれた領域は、腫瘍細胞質を50%より多く含み、混在した組織学を全く伴わないものであった。また、一様な追跡調査情報も利用可能であった。
≪更なるサンプル収集≫
その後、デュークスB大腸がん患者由来とされた74個の凍結腫瘍標本を研究した。原発腫瘍および隣接する非腫瘍性大腸組織を、手術時に収集した。診断と一様な腫瘍の浸潤を確認するために、各標本の組織病理学を再検査した。分析のために選ばれた領域は、腫瘍細胞質を50%より多く含み、混在した組織学を全く伴わないものであった。また、一様な追跡調査情報も利用可能であった。
〔実施例5〕
≪遺伝子発現分析≫
実施例1〜3で説明した方法にしたがって、全RNAを実施例4のサンプルから抽出した。標準的なAffymetrixプロトコルとスキャナーを用いて、アレイをスキャンした。その後の分析のために、各プローブセットを別々の遺伝子と見なした。各遺伝子についての発現値を、Affymetrix GeneChip分析ソフトウェアMAS 5.0を用いて計算した。その後の分析のために用いられたすべてのデータが、品質管理基準を通過した。
≪遺伝子発現分析≫
実施例1〜3で説明した方法にしたがって、全RNAを実施例4のサンプルから抽出した。標準的なAffymetrixプロトコルとスキャナーを用いて、アレイをスキャンした。その後の分析のために、各プローブセットを別々の遺伝子と見なした。各遺伝子についての発現値を、Affymetrix GeneChip分析ソフトウェアMAS 5.0を用いて計算した。その後の分析のために用いられたすべてのデータが、品質管理基準を通過した。
<統計的方法>
まず、すべてのサンプルにおいて「不在」と呼ばれる遺伝子を除く検証フィルターに、遺伝子発現データをさらした。考慮された22,000個の遺伝子のうちの17,616個が、このフィルターを通過し、クラスタリングのために用いられた。階層的クラスタリング(hierarchical clustering)に先立って、各遺伝子を患者における発現レベルの中央値で分けた。少なくとも10%の患者で、平均発現レベルの4倍より大きな変化を示した遺伝子を、クラスタリングに含めた。異なる遺伝的プロファイルを有する患者サブグループを同定するために、平均連結階層的クラスタリングとk-平均クラスタリングを、それぞれGeneSpring 5.0(San Jose, CA)とPartek 5.1ソフトウェア(St. Louis, MO)を用いて実行した。クラスタリング結果によって示唆された2つの患者サブグループ間で異なる発現レベルを有する遺伝子を同定するために、ボンフェローニ補正したt検定を用いた。ボンフェローニ補正された0.01のP値を、遺伝子選択のための閾値に選んだ。異なる発現プロファイルを有する各クラスターの患者を、結果情報により更に検査した。
まず、すべてのサンプルにおいて「不在」と呼ばれる遺伝子を除く検証フィルターに、遺伝子発現データをさらした。考慮された22,000個の遺伝子のうちの17,616個が、このフィルターを通過し、クラスタリングのために用いられた。階層的クラスタリング(hierarchical clustering)に先立って、各遺伝子を患者における発現レベルの中央値で分けた。少なくとも10%の患者で、平均発現レベルの4倍より大きな変化を示した遺伝子を、クラスタリングに含めた。異なる遺伝的プロファイルを有する患者サブグループを同定するために、平均連結階層的クラスタリングとk-平均クラスタリングを、それぞれGeneSpring 5.0(San Jose, CA)とPartek 5.1ソフトウェア(St. Louis, MO)を用いて実行した。クラスタリング結果によって示唆された2つの患者サブグループ間で異なる発現レベルを有する遺伝子を同定するために、ボンフェローニ補正したt検定を用いた。ボンフェローニ補正された0.01のP値を、遺伝子選択のための閾値に選んだ。異なる発現プロファイルを有する各クラスターの患者を、結果情報により更に検査した。
再発患者と無病患者とを識別することのできる遺伝子マーカーを同定するために、以下に更に説明するように、患者の各サブグループを別々に分析した。すべての統計的分析をS-Plusソフトウェア(Insightful, VA)を用いて実行した。
<患者および腫瘍の特徴>
患者およびその患者の腫瘍の、臨床上および病理学上の特色を、表1に要約した。患者には、年齢、性別、TNM病期(TNM stage)、グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の位置についての情報があった。74人の患者のうちの73人には、検査されたリンパ節の数についてのデータがあり、74人の患者のうちの72人には、推定された腫瘍の大きさについての情報があった。患者および腫瘍の特徴は、再発患者と非再発患者との間で、有意に差異はなかった。患者のうち、手術前の治療を受けたものは全くいなかった。研究された患者全員について、最低3年の追加調査データが利用可能であった。
患者およびその患者の腫瘍の、臨床上および病理学上の特色を、表1に要約した。患者には、年齢、性別、TNM病期(TNM stage)、グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の位置についての情報があった。74人の患者のうちの73人には、検査されたリンパ節の数についてのデータがあり、74人の患者のうちの72人には、推定された腫瘍の大きさについての情報があった。患者および腫瘍の特徴は、再発患者と非再発患者との間で、有意に差異はなかった。患者のうち、手術前の治療を受けたものは全くいなかった。研究された患者全員について、最低3年の追加調査データが利用可能であった。
<遺伝的プロファイルによって同定された患者サブグループ>
教師なし階層的クラスター分析により、17,000個を超える有意な遺伝子を測定された発現プロファイルの類似に基づいて、結果的に74人の患者についてのクラスターを生じた。2つの患者サブグループは、サブグループ間で差異のあるように発現する遺伝子を600個より多く有する(p<0.00001)ことが同定された。より大きなサブグループとより小さなサブグループには、それぞれ54人の患者と20人の患者が含まれた。54人の患者からなる、より大きなサブグループでは、18人の患者(33%)のみが3年以内に腫瘍が再発し、20人の患者からなる、より小さなサブグループでは、13人の患者(65%)が進行性の疾患を有した。χ2分析によりp値0.028が与えられた。
教師なし階層的クラスター分析により、17,000個を超える有意な遺伝子を測定された発現プロファイルの類似に基づいて、結果的に74人の患者についてのクラスターを生じた。2つの患者サブグループは、サブグループ間で差異のあるように発現する遺伝子を600個より多く有する(p<0.00001)ことが同定された。より大きなサブグループとより小さなサブグループには、それぞれ54人の患者と20人の患者が含まれた。54人の患者からなる、より大きなサブグループでは、18人の患者(33%)のみが3年以内に腫瘍が再発し、20人の患者からなる、より小さなサブグループでは、13人の患者(65%)が進行性の疾患を有した。χ2分析によりp値0.028が与えられた。
2種類の腫瘍間で劇的に差異のある発現を有する2個の優性遺伝子クラスターを選択し、検査した。第1の遺伝子クラスターは、20人の患者からなる、より小さなサブグループにおいてダウンレギュレーションされる遺伝子群を有し、liver-intestine specific cadherin 17、fatty acid binding protein 1、caudal type homeobox transcription factors CDX1およびCDX2、mucin and cadherin-like protein MUCDHLによって示される。第2の遺伝子クラスターは、より小さなサブグループでアップレギュレーションされる遺伝子群を有し、serum-inducible kinase SNK、annexin A1、B cell RAG associated protein、calbindin 2、tumor antigen L6が含まれる。したがって、20人の患者からなる、より小さなサブグループは、遺伝的プロファイルを基礎としたあまり分化していない腫瘍を示している。
<遺伝子特性とその予後値>
再発患者と無病患者とを区別することのできる遺伝子マーカーを同定するために、患者の各サブグループを別々に分析した。まず、各サブグループの患者を、おおむね等しい数の患者を有する訓練セットと試験セットに分けた。訓練セットを、遺伝子マーカーを選択し、予後特性を構築するために用いた。試験セットを、独立した検証のために用いた。54個の腫瘍からなる、より大きなサブグループにおいて、36人の患者が最初の診断後少なくとも3年間は無病のままであり、18人の患者が3年以内に腫瘍が再発した。54人の患者を2つのグループに分けた。訓練セットには、21人の無病患者と6人の再発患者が含まれた。20個の腫瘍からなる、より小さなサブグループにおいて、7人の患者が少なくとも3年間は無病のままであり、13人の患者が3年で腫瘍が再発した。20人の患者を2つのグループに分けた。訓練セットには、4人の無病患者と7人の再発患者が含まれた。良好な予後グループを不良な予後グループから区別するような遺伝子特性を同定するために、各訓練セットに対して、教師あり分類法を用いた。発現レベルが患者の生存期間と相関するような遺伝子を同定するために、単変量コックス比例ハザード回帰を用いた。選択基準として0.02より小さいp値を用いて、遺伝子を選択した。次に、再発患者と無病患者間の差異のある発現の有意性を決定するために、選択された遺伝子について、t検定を実行した(P<0.01)。訓練セットに過剰適合する遺伝子の選択を避けるように、80%を超える再サンプリング試験で有意なp値を有する遺伝子を探索するために、100回の再サンプリングをt検定とともに実行した。7個の遺伝子(表2)を27人の患者訓練セットから選択し、15個の遺伝子(表3)を11人の患者訓練セットから選択した。この22個の遺伝子とcadherin 17をともに採用し、患者の再発を予測するためのコックスモデルをS-Plusソフトウェアを用いて構築した。カプラン・マイヤー生存分析は、患者が無病のままであるだろう確率について、良好な予後を有すると予測されたグループと不良な予後を有すると予測されたグループ間で明らかな差異を示した(図3)。
再発患者と無病患者とを区別することのできる遺伝子マーカーを同定するために、患者の各サブグループを別々に分析した。まず、各サブグループの患者を、おおむね等しい数の患者を有する訓練セットと試験セットに分けた。訓練セットを、遺伝子マーカーを選択し、予後特性を構築するために用いた。試験セットを、独立した検証のために用いた。54個の腫瘍からなる、より大きなサブグループにおいて、36人の患者が最初の診断後少なくとも3年間は無病のままであり、18人の患者が3年以内に腫瘍が再発した。54人の患者を2つのグループに分けた。訓練セットには、21人の無病患者と6人の再発患者が含まれた。20個の腫瘍からなる、より小さなサブグループにおいて、7人の患者が少なくとも3年間は無病のままであり、13人の患者が3年で腫瘍が再発した。20人の患者を2つのグループに分けた。訓練セットには、4人の無病患者と7人の再発患者が含まれた。良好な予後グループを不良な予後グループから区別するような遺伝子特性を同定するために、各訓練セットに対して、教師あり分類法を用いた。発現レベルが患者の生存期間と相関するような遺伝子を同定するために、単変量コックス比例ハザード回帰を用いた。選択基準として0.02より小さいp値を用いて、遺伝子を選択した。次に、再発患者と無病患者間の差異のある発現の有意性を決定するために、選択された遺伝子について、t検定を実行した(P<0.01)。訓練セットに過剰適合する遺伝子の選択を避けるように、80%を超える再サンプリング試験で有意なp値を有する遺伝子を探索するために、100回の再サンプリングをt検定とともに実行した。7個の遺伝子(表2)を27人の患者訓練セットから選択し、15個の遺伝子(表3)を11人の患者訓練セットから選択した。この22個の遺伝子とcadherin 17をともに採用し、患者の再発を予測するためのコックスモデルをS-Plusソフトウェアを用いて構築した。カプラン・マイヤー生存分析は、患者が無病のままであるだろう確率について、良好な予後を有すると予測されたグループと不良な予後を有すると予測されたグループ間で明らかな差異を示した(図3)。
いくつかの遺伝子が細胞増殖または腫瘍進行に関連する。例えば、tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(YWHAH)は、ヒト細胞においてDNA損傷に反応しG2細胞周期制御のために機能するタンパク質の14-3-3ファミリーに属する。RCCは染色体凝縮の開始制御に関係している。BTEB2は、beta-catenin independent Wnt-1 responsive genesを意味するジンクフィンガー転写因子である。少数の遺伝子は局所的な免疫反応に関わっているようである。immunoglobulin-like transcript 5 proteinは、MHC I分子に対する共通の阻害性レセプターである。gelsolin/villin family capping protein特有のメンバーであるCAPGは、主としてマクロファージにおいて発現する。LATは、T細胞レセプターを細胞活性と連結するチロシンが強くリン酸化されたタンパク質である。このように、腫瘍細胞で発現する遺伝子と免疫細胞で発現する遺伝子の両方が、患者再発のための予後因子として用いられうる。
23個の遺伝子の予後特性を検証するために、より大きなサブグループ由来の27人の患者と、より小さなサブグループ由来の9人の患者を含んだ2つの試験セットを組み合わせ、その試験セットの36人の独立した患者について、結果を予測した。この試験セットは、3年以内に腫瘍が再発した18人の患者と、3年を超えて無病のままであった18人の患者で構成された。予測では、正しい再発分類13人と正しい無病分類15人という結果を生じた。全体の性能精度は78%(36人中28人)であり、感度72%(18人中13人)、特異度83%(18人中15人)であった。この性能は、予後特性の閾値より低い値を有するデュークスB患者が、予後特性の閾値よりも高い値を有するものと比較して、13倍のオッズ比(95% CI: 2.6, 65;p=0.003)で、3年以内に腫瘍が再発することを示している。更に、カプラン・マイヤー生存分析は、患者が無病のままであるだろう確率について、良好な予後を有すると予測されたグループと不良な予後を有すると予測されたグループ間で、有意な差異を示した(P<0.0001)。多変量コックス比例ハザード回帰において、腫瘍再発に対して推定されたハザード率は0.41(95%信頼区間: 0.24, 0.71;P=0.001)であり、23個の遺伝子セットが予後特性を示し、逆に、より高い再発危険度と関連することを示している。7個の遺伝子ポートフォリオ(表2)を用いて、感度83%と特異度80%が得られた(12人の再発者と15人の生存者のサンプルセットに基づく)。15個の遺伝子ポートフォリオ(表3)を用いて、感度50%と特異度100%が得られた(6人の再発者と3人の生存者のサンプルセットに基づく)。図1と図2はそれぞれ、7個の遺伝子ポートフォリオと15個の遺伝子ポートフォリオについてのカプラン・マイヤー分析のグラフ状の描写である。
更に、これらの結果は、予後が原発腫瘍の遺伝子発現に由来しうることを示している。
〔実施例6〕
本研究では、2つの原料から得られた123人のデュークスB大腸がんの独立したシリーズにおいて、この予後特性の独立した評価を完了した。加えて、FPEサンプルにおいて予後遺伝子特性を試験するために、RTQ-PCR解析を開発した。このデータによって、デュークスB大腸がん患者についてあらかじめ特定された予後遺伝子特性に関して高い信頼性を有する検証を提供する。
本研究では、2つの原料から得られた123人のデュークスB大腸がんの独立したシリーズにおいて、この予後特性の独立した評価を完了した。加えて、FPEサンプルにおいて予後遺伝子特性を試験するために、RTQ-PCR解析を開発した。このデータによって、デュークスB大腸がん患者についてあらかじめ特定された予後遺伝子特性に関して高い信頼性を有する検証を提供する。
<目的>
デュークスB大腸がんを有する患者の5年の生存率は、およそ75%である。以前のゲノム全体の遺伝子発現の測定では、臨床結果にしたがってデュークスBを有する患者を下位分類し、これらの患者に関する個々の危険度について、より良い予測因子を提供することができるような23個の遺伝子特性を同定した。Wang et al. (2005)参照。本研究は、独立した、より様々な患者のグループで、この遺伝子特性を検証し、固定パラフィン包埋(FPE)腫瘍組織を用いた臨床上実現可能な試験へと、この予後特性を発展させる。
デュークスB大腸がんを有する患者の5年の生存率は、およそ75%である。以前のゲノム全体の遺伝子発現の測定では、臨床結果にしたがってデュークスBを有する患者を下位分類し、これらの患者に関する個々の危険度について、より良い予測因子を提供することができるような23個の遺伝子特性を同定した。Wang et al. (2005)参照。本研究は、独立した、より様々な患者のグループで、この遺伝子特性を検証し、固定パラフィン包埋(FPE)腫瘍組織を用いた臨床上実現可能な試験へと、この予後特性を発展させる。
<患者と方法>
アジュバント全身療法を受けていない123人のデュークスB患者由来の凍結腫瘍サンプルの全RNAにおいて、Affymetrix U133a GeneChipを用いて23個の遺伝子の発現を分析した。更に、標準的な臨床FPEサンプルにより試験を実行するために、この遺伝子特性についてのリアルタイム定量PCR(real time quantitative PCR)(RTQ-PCR)を開発した。
アジュバント全身療法を受けていない123人のデュークスB患者由来の凍結腫瘍サンプルの全RNAにおいて、Affymetrix U133a GeneChipを用いて23個の遺伝子の発現を分析した。更に、標準的な臨床FPEサンプルにより試験を実行するために、この遺伝子特性についてのリアルタイム定量PCR(real time quantitative PCR)(RTQ-PCR)を開発した。
<結果>
123人の患者の独立した検証セットにおいて、その23個の遺伝子特性が、遠隔転移になるだろう患者を同定する際に、高度な情報を有することが証明され[ハザード率(hazard ratio)(HR)2.56;95%信頼区間(confidence interval)(CI)1.01 - 6.48]、たとえ、多変量分析で従来の予後因子に対して補正した場合でも、同様であった(HR, 2.73;95%CI, 0.97 - 7.73)。この遺伝子特性のために開発されたRTQ-PCR解析もまた、利用可能なFPE組織を有する110人の患者の独立したセットにおいて検証され、単変量分析(HR, 6.55;95%CI, 2.89 - 14.8)でも、多変量分析(HR, 13.9;95% CI, 5.22 - 37.2)でも、遠隔再発の発症についての強力な予後因子であった。
123人の患者の独立した検証セットにおいて、その23個の遺伝子特性が、遠隔転移になるだろう患者を同定する際に、高度な情報を有することが証明され[ハザード率(hazard ratio)(HR)2.56;95%信頼区間(confidence interval)(CI)1.01 - 6.48]、たとえ、多変量分析で従来の予後因子に対して補正した場合でも、同様であった(HR, 2.73;95%CI, 0.97 - 7.73)。この遺伝子特性のために開発されたRTQ-PCR解析もまた、利用可能なFPE組織を有する110人の患者の独立したセットにおいて検証され、単変量分析(HR, 6.55;95%CI, 2.89 - 14.8)でも、多変量分析(HR, 13.9;95% CI, 5.22 - 37.2)でも、遠隔再発の発症についての強力な予後因子であった。
<結論>
本結果は、独立した集団におけるデュークスB大腸がん患者についてのあらかじめ定められた予後遺伝子特性を検証し、標準的なFPE標本でRTQ-PCRを用いて遺伝子特性を試験することの実現可能性を示している。好ましくない結果を有する大腸がん患者を同定するための、このような試験の能力により、より積極的な治療選択を必要とする高い再発危険度の患者を同定することに役立つような臨床的関連が示される。
本結果は、独立した集団におけるデュークスB大腸がん患者についてのあらかじめ定められた予後遺伝子特性を検証し、標準的なFPE標本でRTQ-PCRを用いて遺伝子特性を試験することの実現可能性を示している。好ましくない結果を有する大腸がん患者を同定するための、このような試験の能力により、より積極的な治療選択を必要とする高い再発危険度の患者を同定することに役立つような臨床的関連が示される。
≪患者と方法≫
<患者サンプル>
デュークスB大腸がん患者由来とされた123個の凍結腫瘍標本と、これらの患者のうちの110人に由来するFPE腫瘍標本を、施設内倫理委員会によりそれぞれの場所で承認されたプロトコルにしたがって、Cleveland Clinic Foundation(Cleveland, OH)、Aros Applied Biotechnology, LLC(Aarhus, Denmark)、Proteogenix, LLC(Culver City, CA)から入手した。54人の患者が、凍結サンプルとFPEサンプルとに一致した。保管された原発腫瘍サンプルを手術時に収集した。各標本の組織病理学を、診断と腫瘍内容物を確認するために再検査した。全体の細胞集団は、少なくとも70%の腫瘍細胞から構成された。
<患者サンプル>
デュークスB大腸がん患者由来とされた123個の凍結腫瘍標本と、これらの患者のうちの110人に由来するFPE腫瘍標本を、施設内倫理委員会によりそれぞれの場所で承認されたプロトコルにしたがって、Cleveland Clinic Foundation(Cleveland, OH)、Aros Applied Biotechnology, LLC(Aarhus, Denmark)、Proteogenix, LLC(Culver City, CA)から入手した。54人の患者が、凍結サンプルとFPEサンプルとに一致した。保管された原発腫瘍サンプルを手術時に収集した。各標本の組織病理学を、診断と腫瘍内容物を確認するために再検査した。全体の細胞集団は、少なくとも70%の腫瘍細胞から構成された。
その時点の前に遠隔再発を発症した患者を除いて、少なくとも3年の追加調査を必要とした。手術のみで患者を治療した。患者についての身体検査、血球数検査、肝機能検査、血清CEA、大腸内視鏡検査を含んだ大腸がん患者に対する一般的な実務にしたがって、手術後の患者サーベイランスを実行した。選択された患者に、腹部CTスキャンと胸部X線を行った。腫瘍再発が疑われるならば、その患者に、腹部/骨盤CTスキャン、胸部X線、大腸内視鏡検査、生検を含んだ集中精密検査を、適用できる場合に行った。再発時または無病時を、再発患者については、手術の日から腫瘍再発を確認した日までの期間として定義し、無病患者については、手術の日から最後に追加調査した日までの期間として定義した。
<マイクロアレイ分析>
初期の研究で説明したように、RNA単離のためにすべての腫瘍組織を加工した。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。ビオチニル化された標的を、公開された方法(Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて準備し[Lipshutz et al. (1999)参照]、Affymetrix U133a GeneChips(Affymetrix, Santa Clara, CA)にハイブリダイゼーションした。標準的なAffymetrixプロトコルを用いて、アレイをスキャンした。各プローブセットを別々の遺伝子と見なした。各遺伝子の発現値を、Affymetrix GeneChip(登録商標)分析ソフトウェアMAS 5.0を用い、以前に説明された分析方法にしたがって計算した。Wang et al. (2005)参照。
初期の研究で説明したように、RNA単離のためにすべての腫瘍組織を加工した。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。ビオチニル化された標的を、公開された方法(Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて準備し[Lipshutz et al. (1999)参照]、Affymetrix U133a GeneChips(Affymetrix, Santa Clara, CA)にハイブリダイゼーションした。標準的なAffymetrixプロトコルを用いて、アレイをスキャンした。各プローブセットを別々の遺伝子と見なした。各遺伝子の発現値を、Affymetrix GeneChip(登録商標)分析ソフトウェアMAS 5.0を用い、以前に説明された分析方法にしたがって計算した。Wang et al. (2005)参照。
<FPEサンプルからのRNA単離>
110人の患者についてFPE組織が利用可能である。FPEサンプルは、ホルマリン固定されたFPE(n=45)またはHollandes固定されたFPE(n=65)のいずれかであった。High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)を用いた改良されたプロトコルにしたがって、FPE組織サンプルからのRNA単離を実行した。FPE組織ブロックをブロックの大きさに応じて切断した(6〜8mm=6×10μm、8〜10以上mm=3×10μm)。業者のマニュアルで説明されているように、切片を脱パラフィン化した。組織ペレットを55℃のオーブンで10分間乾燥させ、組織溶解バッファー100μL、10%SDS 16μL、タンパク質分解酵素K 80μLに再懸濁した。サンプルを撹拌し、400rpmに設定したサーモミキサーで、55℃、3時間、インキュベーションした。その後のサンプルを加工する工程を、キットのマニュアルにしたがって実行した。RNAサンプルを、分光光度計を用いたOD 260/280測定値によって定量し、最終濃度50ng/μLに希釈した。単離したRNAサンプルを、使用するまで、RNaseを含まない水に-80℃で保管した。
110人の患者についてFPE組織が利用可能である。FPEサンプルは、ホルマリン固定されたFPE(n=45)またはHollandes固定されたFPE(n=65)のいずれかであった。High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)を用いた改良されたプロトコルにしたがって、FPE組織サンプルからのRNA単離を実行した。FPE組織ブロックをブロックの大きさに応じて切断した(6〜8mm=6×10μm、8〜10以上mm=3×10μm)。業者のマニュアルで説明されているように、切片を脱パラフィン化した。組織ペレットを55℃のオーブンで10分間乾燥させ、組織溶解バッファー100μL、10%SDS 16μL、タンパク質分解酵素K 80μLに再懸濁した。サンプルを撹拌し、400rpmに設定したサーモミキサーで、55℃、3時間、インキュベーションした。その後のサンプルを加工する工程を、キットのマニュアルにしたがって実行した。RNAサンプルを、分光光度計を用いたOD 260/280測定値によって定量し、最終濃度50ng/μLに希釈した。単離したRNAサンプルを、使用するまで、RNaseを含まない水に-80℃で保管した。
<RTQ-PCR分析>
FPE組織から単離したRNAサンプルとともに一段階マルチプレックスRTQ-PCR解析を用いて、23個の遺伝子特性のうちの7個の遺伝子を評価した。RTQ-PCR反応のばらつきを最小にするために、β-actin、HMBS、GUSB、RPL13Aを含む4個のハウスキーピング対照遺伝子を、RNAの入力量を正規化するために用いた。増幅によるサンプルの任意のDNA汚染を避けるために、RTQ-PCR解析のためのPCRプライマーまたはプローブを、イントロンをはさむように設計して、任意の残りのゲノムDNAを増幅しないようにした。一段階RTQ-PCR反応のために、全RNA 100ngを用いた。TaqMan(登録商標)one-step PCR Master Mix reagents kit(Applied Biosystems, Fresno, CA)に含まれる40×MultiscribeとRNase inhibitor mixを用いて、逆転写を実行した。その後、cDNAを、ウラシル−N−グリコシラーゼ(uracil-N-glycosylase)(UNG)を含まない2×Master Mixにさらした。384穴ブロックフォーマットを用いたABI 7900HT sequence detection system(Applied Biosystems, Frenso, CA)において、反応量10μLで、PCR増幅を実行した。プライマーとプローブの濃度は、それぞれ4μmol/Lと2.5μmol/Lであった。
FPE組織から単離したRNAサンプルとともに一段階マルチプレックスRTQ-PCR解析を用いて、23個の遺伝子特性のうちの7個の遺伝子を評価した。RTQ-PCR反応のばらつきを最小にするために、β-actin、HMBS、GUSB、RPL13Aを含む4個のハウスキーピング対照遺伝子を、RNAの入力量を正規化するために用いた。増幅によるサンプルの任意のDNA汚染を避けるために、RTQ-PCR解析のためのPCRプライマーまたはプローブを、イントロンをはさむように設計して、任意の残りのゲノムDNAを増幅しないようにした。一段階RTQ-PCR反応のために、全RNA 100ngを用いた。TaqMan(登録商標)one-step PCR Master Mix reagents kit(Applied Biosystems, Fresno, CA)に含まれる40×MultiscribeとRNase inhibitor mixを用いて、逆転写を実行した。その後、cDNAを、ウラシル−N−グリコシラーゼ(uracil-N-glycosylase)(UNG)を含まない2×Master Mixにさらした。384穴ブロックフォーマットを用いたABI 7900HT sequence detection system(Applied Biosystems, Frenso, CA)において、反応量10μLで、PCR増幅を実行した。プライマーとプローブの濃度は、それぞれ4μmol/Lと2.5μmol/Lであった。
逆転写のために反応溶液を48℃、30分間インキュベーションし、その後、Amplitaq(登録商標)活性化ステップを95℃、10分間行い、その後、変性のために95℃、15秒、アニーリングと伸張のために60℃、1分間を40サイクル行った。100pg〜100ngの範囲の出発物質により標準曲線を生成し、R2値が0.99より大きい場合、サイクル閾値(cycle threshold)(Ct)値を受け入れた。加えて、業者のプロトコルにしたがった同じ増幅効率に関して、すべてのプライマーとプローブを最適化した。Applied Biosystems' Assay-On-Demandを7個の遺伝子のうちの4個(BTEB2、LAT、CAPG、Immunoglobulin-like transcript 5 protein)のために用いた。他の3個の遺伝子と4個のハウスキーピング対照遺伝子についてのプライマーとプローブの配列は、以下のとおりである。いずれも5’から3’の方向に記載されている。
Laforinフォワード,CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG;配列番号29
Laforinリバース,CACGTACACGATGTGTCCCTTCT;配列番号30
Laforinプローブ,CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT;配列番号31
RCC1フォワード,TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT;配列番号32
RCC1リバース,CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA;配列番号33
RCC1プローブ,CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC;配列番号34
YWHAHフォワード,GGCGGAGCGCTACGA;配列番号35
YWHAHリバース,TTCATTCGAGAGAGGTTCATTCAG;配列番号36
YWHAHプローブ,CCTCCGCTATGAAGGCGGTGA;配列番号37
β-actinフォワード,AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA;配列番号38
β-actinリバース,AATGCTATCACCTCCCCTGTGT;配列番号39
β-actinプローブ,AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC;配列番号40
HMBSフォワード,CCTGCCCACTGTGCTTCCT;配列番号41
HMBSリバース,GGTTTTCCCGCTTGCAGAT;配列番号42
HMBSプローブ,CTGGCTTCACCATCG;配列番号43
GUSBフォワード,TGGTTGGAGAGCTCATTTGGA;配列番号44
GUSBリバース,ACTCTCGTCGGTGACTGTTCAG;配列番号45
GUSBプローブ,TTTTGCCGATTTCATG;配列番号46
RPL13Aフォワード,CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA;配列番号47
RPL13Aリバース,CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC;配列番号48
RPL13Aプローブ,CGGAAACAGGCCGAGAA;配列番号49
Laforinフォワード,CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG;配列番号29
Laforinリバース,CACGTACACGATGTGTCCCTTCT;配列番号30
Laforinプローブ,CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT;配列番号31
RCC1フォワード,TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT;配列番号32
RCC1リバース,CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA;配列番号33
RCC1プローブ,CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC;配列番号34
YWHAHフォワード,GGCGGAGCGCTACGA;配列番号35
YWHAHリバース,TTCATTCGAGAGAGGTTCATTCAG;配列番号36
YWHAHプローブ,CCTCCGCTATGAAGGCGGTGA;配列番号37
β-actinフォワード,AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA;配列番号38
β-actinリバース,AATGCTATCACCTCCCCTGTGT;配列番号39
β-actinプローブ,AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC;配列番号40
HMBSフォワード,CCTGCCCACTGTGCTTCCT;配列番号41
HMBSリバース,GGTTTTCCCGCTTGCAGAT;配列番号42
HMBSプローブ,CTGGCTTCACCATCG;配列番号43
GUSBフォワード,TGGTTGGAGAGCTCATTTGGA;配列番号44
GUSBリバース,ACTCTCGTCGGTGACTGTTCAG;配列番号45
GUSBプローブ,TTTTGCCGATTTCATG;配列番号46
RPL13Aフォワード,CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA;配列番号47
RPL13Aリバース,CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC;配列番号48
RPL13Aプローブ,CGGAAACAGGCCGAGAA;配列番号49
各サンプルについて、ΔCt=Ct(標的遺伝子)−Ct(4個の対照遺伝子の平均)が計算された。ΔCt正規化は、臨床上のRTQ-PCRにおいて広く用いられている。
<統計的方法>
個々の診療機関でサンプルの取り扱いについてのプロトコルが異なる結果生じるデータのばらつきを、分散分析(analysis of variance)(ANOVA)を遺伝子発現データに用いることによって最小化した。これまでの研究で説明したように、サブグループへの患者の割り当てを決定するために、アレイにおけるCadherin 17遺伝子発現の測定値を用いた。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。検出可能なCadherin 17の発現レベルを有する患者をサブグループIに分類し、結果を23個の遺伝子特性のうちの7個の遺伝子サブセットを用いて予測した。検出できないCadherin 17の発現レベルを有する患者をサブグループIIに分類し、結果を23個の遺伝子特性のうちの15個の遺伝子サブセットを用いて予測した。各患者について再発スコアを計算し、3年以内に遠隔転移を発症することに関して、患者を、危険度の高いグループまたは危険度の低いグループに分類するために、そのスコアを用いた。0を超える再発スコアを有する患者を高危険度に分類し、0未満の再発スコアを有する患者を低危険度に分類した。再発スコアの計算は、以下のとおりであった。
ただし、
AおよびBは、定数
w iは、標準化コックス回帰係数
x iは、log2目盛における発現値
個々の診療機関でサンプルの取り扱いについてのプロトコルが異なる結果生じるデータのばらつきを、分散分析(analysis of variance)(ANOVA)を遺伝子発現データに用いることによって最小化した。これまでの研究で説明したように、サブグループへの患者の割り当てを決定するために、アレイにおけるCadherin 17遺伝子発現の測定値を用いた。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。検出可能なCadherin 17の発現レベルを有する患者をサブグループIに分類し、結果を23個の遺伝子特性のうちの7個の遺伝子サブセットを用いて予測した。検出できないCadherin 17の発現レベルを有する患者をサブグループIIに分類し、結果を23個の遺伝子特性のうちの15個の遺伝子サブセットを用いて予測した。各患者について再発スコアを計算し、3年以内に遠隔転移を発症することに関して、患者を、危険度の高いグループまたは危険度の低いグループに分類するために、そのスコアを用いた。0を超える再発スコアを有する患者を高危険度に分類し、0未満の再発スコアを有する患者を低危険度に分類した。再発スコアの計算は、以下のとおりであった。
w iは、標準化コックス回帰係数
x iは、log2目盛における発現値
予測された高危険度グループおよび低危険度グループの差異を評価するために、カプラン・マイヤー生存プロット[Kaplan et al. (1958)参照]とログランク検定を用いた。感度を、遺伝子特性によって正しく予測された3年以内に遠隔転移を発症する患者の割合(%)として定義し、特異度を、遺伝子特性によって無再発と予測された少なくとも3年以内に遠隔再発がない患者の割合(%)として定義した。オッズ比(odds ratio)(OR)を、予測された再発患者と無再発患者間の遠隔転移のオッズの比率として計算した。コックス比例ハザード回帰を用いた単変量分析、多変量分析を、患者の個々の臨床パラメーター、および、臨床パラメーターと遺伝子特性(年齢、性別、Tステージ、グレード、腫瘍の大きさを含む)との組み合わせについて実行した。HRと95% CIは、これらの結果に由来した。S-Plus(登録商標)6.1ソフトウェア(Insightful, Fairfax Station, VA)を用いて、すべての統計的解析を実行した。
≪結果≫
<患者と腫瘍特徴>
患者とその腫瘍の臨床上、病理学上の特徴を、表5と表6に要約する。すべての患者について、年齢、性別、TNMステージ、グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の位置の情報があった。患者と腫瘍特徴には、再発患者と非再発患者間で有意な差異はなかった。患者は手術でのみ治療され、ネオアジュバント療法(neo-adjuvant treatment)またはアジュバント療法を受けた患者は全くいなかった。最低3年の追跡調査が、3年未満で再発した患者を除いた本研究のすべての患者について、利用可能であった。
<患者と腫瘍特徴>
患者とその腫瘍の臨床上、病理学上の特徴を、表5と表6に要約する。すべての患者について、年齢、性別、TNMステージ、グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の位置の情報があった。患者と腫瘍特徴には、再発患者と非再発患者間で有意な差異はなかった。患者は手術でのみ治療され、ネオアジュバント療法(neo-adjuvant treatment)またはアジュバント療法を受けた患者は全くいなかった。最低3年の追跡調査が、3年未満で再発した患者を除いた本研究のすべての患者について、利用可能であった。
<新鮮な凍結サンプルにおける遺伝子特性の分析>
23個の遺伝子特性の関数として、生存分析を実行した。まず、ROC曲線を評価した(図4)。予測因子の性能を評価するために、濃度曲線下面積(area under the curve)(AUC)を用いた。23個の遺伝子予測因子によりAUC値0.66が与えられた。3年の定義点を用いて、この方法から計算された再発スコアは、3年以内に発症した13人の再発者のうちの8人(感度62%)、108人の非再発者のうちの74人(特異度69%)を正確に予測した。腫瘍再発の頻度は、123人の患者からなる、このグループでは11%のみであったが、カプラン・マイヤー分析は、患者グループについての生存曲線を生成し、ログランク検定は、良好な予後と予測されたグループと、不良な予後と予測されたグループ間についての再発時における有意な差異を示した(P=0.04)(図4)。123人の患者についての単変量分析、多変量分析において、23個の遺伝子特性が遠位転移を発症する患者を同定する際の高い情報を有することが証明され(ハザード率HR, 2.56;95%信頼区間CI, 1.01 - 6.48)、多変量分析における従来の予後因子について補正された場合も同様であった(HR, 2.73;95% CI, 0.97 - 7.73)。
23個の遺伝子特性の関数として、生存分析を実行した。まず、ROC曲線を評価した(図4)。予測因子の性能を評価するために、濃度曲線下面積(area under the curve)(AUC)を用いた。23個の遺伝子予測因子によりAUC値0.66が与えられた。3年の定義点を用いて、この方法から計算された再発スコアは、3年以内に発症した13人の再発者のうちの8人(感度62%)、108人の非再発者のうちの74人(特異度69%)を正確に予測した。腫瘍再発の頻度は、123人の患者からなる、このグループでは11%のみであったが、カプラン・マイヤー分析は、患者グループについての生存曲線を生成し、ログランク検定は、良好な予後と予測されたグループと、不良な予後と予測されたグループ間についての再発時における有意な差異を示した(P=0.04)(図4)。123人の患者についての単変量分析、多変量分析において、23個の遺伝子特性が遠位転移を発症する患者を同定する際の高い情報を有することが証明され(ハザード率HR, 2.56;95%信頼区間CI, 1.01 - 6.48)、多変量分析における従来の予後因子について補正された場合も同様であった(HR, 2.73;95% CI, 0.97 - 7.73)。
初期の研究[Wang et al. (2005)参照]の患者サンプルグループでは、それぞれよく分化した腫瘍、あまり分化していない腫瘍を示す2つの腫瘍サブグループを検出した。デュークスB腫瘍を2つのサブグループに階層化するために、Cadherin 17遺伝子発現を用い、サブグループI(7個の遺伝子)とサブグループII(15個の遺伝子)に対する分類器を含むように、予後遺伝子特性を設計した。本検証研究では、2つの原料由来の123人のデュークスB患者の独立したサンプルグループを検査し、サブグループIIがデュークスB腫瘍の一般的な構成のほんのわずかな部分(2%)を占めるのみであることがわかった。したがって、その後のRTQ-PCR解析において、サブグループIIについて選択された15個の遺伝子を除去することによって、予後遺伝子特性を単純化した。
マイクロアレイデータセットを、NCBI/Genbank GEOデータベース(一連のエントリーは保留中)に提出した。
<FPEサンプルにおける遺伝子特性の分析>
上記のサブグループIについて選択された7個の遺伝子を用いて、RTQ-PCR解析を実行した。これらの7個の遺伝子は、典型的な集団において、95%より多い患者についての結果を分類することができるだろう。生存分析を実行した。まず、ROC曲線を評価した(図5)。予測因子の性能を評価するために用いられるパラメーターは、濃度曲線下面積(AUC)であった。7個の遺伝子予測因子から、AUC値0.76が与えられた。3年の定義点を用いて、この方法から計算された再発スコアは、3年以内に発症した17人の再発者のうちの11人(感度65%)、92人の非再発者のうちの78人(特異度85%)を正確に予測した。更に、カプラン・マイヤー分析とログランク検査はいずれも、良好な予後と予測されたグループと、不良な予後と予測されたグループ間についての再発時における有意な差異を示した(P<0.0001)(図5)。110人の患者において、7個の遺伝子特性は、単変量分析(HR, 6.55;95% CI, 2.89 - 14.8)および多変量分析(HR, 13.9;95% CI, 5.22 - 37.2)の両方で、遠隔再発の発症についての強力な予後因子として確認された(表7)。
上記のサブグループIについて選択された7個の遺伝子を用いて、RTQ-PCR解析を実行した。これらの7個の遺伝子は、典型的な集団において、95%より多い患者についての結果を分類することができるだろう。生存分析を実行した。まず、ROC曲線を評価した(図5)。予測因子の性能を評価するために用いられるパラメーターは、濃度曲線下面積(AUC)であった。7個の遺伝子予測因子から、AUC値0.76が与えられた。3年の定義点を用いて、この方法から計算された再発スコアは、3年以内に発症した17人の再発者のうちの11人(感度65%)、92人の非再発者のうちの78人(特異度85%)を正確に予測した。更に、カプラン・マイヤー分析とログランク検査はいずれも、良好な予後と予測されたグループと、不良な予後と予測されたグループ間についての再発時における有意な差異を示した(P<0.0001)(図5)。110人の患者において、7個の遺伝子特性は、単変量分析(HR, 6.55;95% CI, 2.89 - 14.8)および多変量分析(HR, 13.9;95% CI, 5.22 - 37.2)の両方で、遠隔再発の発症についての強力な予後因子として確認された(表7)。
マイクロアレイに基づく解析とRTQ-PCR解析の両方のために用いられた共通の54人の患者サンプルにおいて、アレイの結果からは、15人の患者が再発者として、39人の患者が非再発者として分類され、一方、RTQ-PCRの結果からは、9人の患者が再発者として、45人の患者が非再発者として分類された。54人の患者のうちの40人(74%)が、両方の方法によって矛盾なく予測されたが、14人の患者(26%)は、方法間で矛盾して予測された。2つの解析(凍結対FPE)に対して、異なる種類の組織サンプルを用いた場合、分類結果は2つの方法の間でよく一致する。14個の不一致なサンプルでは、4人の患者がカットオフに非常に近いスコアを有した(カットオフの5%以内)が、残りの10人の患者は、2つの方法間で非常に相関していないスコアを有した(相関係数:0.15)。10個の不一致サンプルで、同じRNAサンプルを用いてRTQ-PCR解析を繰り返し、2つのERQ-PCR解析のスコアから、相関係数0.998が与えられた。データは、これらの患者の不一致なスコアが、同じ腫瘍のサンプリングの際の差異のためかもしれないことを示唆した。臨床上のFPE材料におけるサンプリングのばらつきを評価するために、更なる試験が必要である。
≪議論≫
以前に確立した23個の遺伝子特性における検証研究の結果を提供する。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。上記の研究において、特性の感度および特異度はそれぞれ、72%、83%であった。あらかじめ特定された基準にしたがって、独立した一連の123人のデュークスB大腸がん患者における遠位再発を予測するために、この予後特性を用いた。更に、7個の遺伝子特性を用いた110人のデュークスB患者の独立したセットにおける遠位再発の成功した検証について報告する。その検証は、FPEサンプルのRTQ-PCR解析を用いたものである。この研究によって、このような分子的予後試験を、大腸がん患者に対する臨床に適用する工程に、より近づく。このことは、デュークスB大腸がん患者のための現在の治療計画の効率について強調する。
以前に確立した23個の遺伝子特性における検証研究の結果を提供する。上記の実施例とWang et al. (2005)参照。上記の研究において、特性の感度および特異度はそれぞれ、72%、83%であった。あらかじめ特定された基準にしたがって、独立した一連の123人のデュークスB大腸がん患者における遠位再発を予測するために、この予後特性を用いた。更に、7個の遺伝子特性を用いた110人のデュークスB患者の独立したセットにおける遠位再発の成功した検証について報告する。その検証は、FPEサンプルのRTQ-PCR解析を用いたものである。この研究によって、このような分子的予後試験を、大腸がん患者に対する臨床に適用する工程に、より近づく。このことは、デュークスB大腸がん患者のための現在の治療計画の効率について強調する。
初期の研究[Wang et al. (2005)参照]における患者サンプル集団では、17,000個を超える情報のある遺伝子(informative genes)の教師なし階層的クラスタリングによって、それぞれよく分化した腫瘍、あまり分化していない腫瘍を示す2つの腫瘍サブグループが検出された。デュークスB腫瘍を2つのサブグループへ階層化するための指標としてCadherin 17遺伝子発現を用い、サブグループI(7個の遺伝子)とサブグループII(15個の遺伝子)に対する分類器を含むように、予後遺伝子特性を設計した。初期の患者セットでは、デュークスB腫瘍の一般的な構成、特にサブグループIとサブグループIIとの患者の比率が示されなかったかもしれない。本検証研究では、2つの原料由来の独立したサンプルグループを試験し、両方の部分由来のサンプルにおいて、サブグループIIがデュークスB腫瘍の一般的な構成のほんのわずかな部分(2%)を占めるのみであることがわかった。したがって、サブグループIIについて選択された15個の遺伝子を除去することによって、予後遺伝子特性を単純化した。
分子的遺伝子特性を発展することをねらいとする研究は、厳格に検証されなければならず、結果が適切に確認され、方法的、統計的、臨床的な観点で高い再現性があることが示されるまで、臨床上の適用に考慮することはできない。この点において、独立した検証セットの省略、訓練セットと試験セットの大きさ、もしくは、研究された患者集団に対する治療の効果を取り違える可能性に関連する問題で、公開された遺伝子発現プロファイリング研究について、いくつかの反論が生じていた。Ransohoff (2005);Simon et al. (2003)参照。本研究は、あらかじめ特定された大腸がん患者のための予後プロファイルの、成功した最初の検証を示している。研究の強度は、複数の機関由来のさまざまな患者グループと、標準的な臨床FPE材料を使用したことによる。腫瘍標本を、機関のプロトコルにしたがって収集、保管して、RNAサンプルを容易に適用可能な手順を用いて準備した。異なる機関における組織の取り扱いの差異にもかかわらず、遺伝子特性は、初期の分析と一致する、強固で、呈示された結果を証明した。
結論的には、本検証研究の結果は、初期の報告の結果を確認する。証明された結果の再現性は、予後遺伝子特性が将来的な臨床研究のために推奨されうるものであり、潜在的に臨床実務における使用のために推奨されうるものであることを示している。およそ20〜30%のデュークスB大腸がん患者が再発するために、予後特性は、高い再発危険度の患者を選択し、可能性のある追加的なアジュバント療法を選択するための強力なツールを提供する。Liefers et al. (1998);Markowitz et al. (2002)参照。集中的な臨床介入を必要とする患者を同定する、この能力は、疾患生存を改善させるかもしれない。
〔実施例7〕
≪Cepheid PCR反応≫
材料と方法
<FFPEサンプルからのRNA単離>
パラフィン組織切片からのRNA単離は、以下の改良とともにHigh Pure RNA Paraffin Kit manual(Roche)に記載されている方法と試薬とに基づいた。各パラフィン包埋組織サンプルから、12×10μmの切片を採取した。キットのマニュアルで説明されているように、切片を脱パラフィン化し、組織ペレットを55℃のオーブンで5〜10分間乾燥させ、組織溶解バッファー100μL、10%SDS 16μL、タンパク質分解酵素K 80μLに再懸濁した。サンプルを撹拌し、400rpmに設定したサーモミキサーで、55℃、3時間、インキュベーションした。High Pure RNA Paraffin Kit manualにしたがって、その後のサンプル加工を実行した。サンプルを、分光光度計から得たOD 260/280測定値によって定量し、単離したRNAを、使用するまで、RNaseを含まない水に-80℃で保管した。
≪Cepheid PCR反応≫
材料と方法
<FFPEサンプルからのRNA単離>
パラフィン組織切片からのRNA単離は、以下の改良とともにHigh Pure RNA Paraffin Kit manual(Roche)に記載されている方法と試薬とに基づいた。各パラフィン包埋組織サンプルから、12×10μmの切片を採取した。キットのマニュアルで説明されているように、切片を脱パラフィン化し、組織ペレットを55℃のオーブンで5〜10分間乾燥させ、組織溶解バッファー100μL、10%SDS 16μL、タンパク質分解酵素K 80μLに再懸濁した。サンプルを撹拌し、400rpmに設定したサーモミキサーで、55℃、3時間、インキュベーションした。High Pure RNA Paraffin Kit manualにしたがって、その後のサンプル加工を実行した。サンプルを、分光光度計から得たOD 260/280測定値によって定量し、単離したRNAを、使用するまで、RNaseを含まない水に-80℃で保管した。
<一段階定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応>
加水分解プローブを開発するために、適切なmRNA参照配列のアクセッション番号をPrimer Express 2.0とともに用いた。大腸予後は、immunoglobulin-like transcript 5 protein(LILRB3)、tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(YWHAH)、cell cycle gene RCC1(CHC1)、transcription factor BTEB2(KLF5)、capping protein (actin filament) gelsolin-like(CAPG)、linker for activation of T cells(LAT)、lafora disease(EP2MA)、ribosomal protein L13a(RPL13A)、actin, beta actin(ACTB)、hydroxymethylbilane synthase(PBGD)を解析する。最適化された一段階qRT-PCR解析のための遺伝子特異的プライマーおよび加水分解プローブを、表8にリストにする。エキソン−イントロンスプライシングサイトの周囲に解析を設計することによって、ゲノムDNA増幅を除外した。加水分解プローブを、5’ヌクレオチド側で、レポーター染料としてFAM、Quasar 570、Texas RedもしくはQuasar 670により標識し、3’ヌクレオチド側で、内部クエンチング染料としてBHQにより標識した。
加水分解プローブを開発するために、適切なmRNA参照配列のアクセッション番号をPrimer Express 2.0とともに用いた。大腸予後は、immunoglobulin-like transcript 5 protein(LILRB3)、tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(YWHAH)、cell cycle gene RCC1(CHC1)、transcription factor BTEB2(KLF5)、capping protein (actin filament) gelsolin-like(CAPG)、linker for activation of T cells(LAT)、lafora disease(EP2MA)、ribosomal protein L13a(RPL13A)、actin, beta actin(ACTB)、hydroxymethylbilane synthase(PBGD)を解析する。最適化された一段階qRT-PCR解析のための遺伝子特異的プライマーおよび加水分解プローブを、表8にリストにする。エキソン−イントロンスプライシングサイトの周囲に解析を設計することによって、ゲノムDNA増幅を除外した。加水分解プローブを、5’ヌクレオチド側で、レポーター染料としてFAM、Quasar 570、Texas RedもしくはQuasar 670により標識し、3’ヌクレオチド側で、内部クエンチング染料としてBHQにより標識した。
遺伝子特異的なRNAの定量を、Smartcycler II sequence detection system(Cepheid)で、25μL反応チューブ中で、実行した。PCR効率を証明するために、各解析遺伝子について、遺伝子が増幅される前に標準曲線を増幅した。このマーカーのための標準曲線は、反応当たり2×102ng、1×102ng、5×10ngの濃度の全RNAサンプルにおける標的遺伝子から構成された。環境汚染がないことを確認するために、各解析実行には、無標的対照も含まれた。すべてのサンプルと対照について、2回実行した。以下の25μL反応ミックスで、定量リアルタイムPCRを実行した。鋳型RNA 100ng、RT-PCRバッファー(125mM Bicine、48mM KOH、287.5nM KAc、15%グリセロール、3.125mM MgCl、7.5mM MnSO4、各0.5mM dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、添加物(125mM Tris-Cl pH 8、0.5mg/mL ウシアルブミン、374.5mMトレハロース、0.5% Tween 20)、酵素ミックス[0.65U Tth(Roche)、0.13mg/mL Ab TP6-25、Tris-Cl 9mM、グリセロール3.5%]、プライマーとプローブ濃度は異なっており、表9に記載されている。Smartcycler II Sequence Detection System(Cepheid, Sunnyvale, CA)で、反応を実行した。続くサイクリングパラメーターは、以下のとおりである。95℃、15秒を1サイクル;55℃、6分を1サイクル;59℃、6分を1サイクル;64℃、10分を1サイクル、95℃、20秒、58℃、30秒を40サイクル。PCR反応が完了した後、Cepheidソフトウェアと計算されたCt値をMicrosoft Excelへエクスポートした。
〔実施の態様〕
(1)デュークスB大腸がんの再発の予測を決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、デュークスB大腸がんの再発の予測を示す、方法。
(2)患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。
(3)患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。
(4)患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。
(5)患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。
(1)デュークスB大腸がんの再発の予測を決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、デュークスB大腸がんの再発の予測を示す、方法。
(2)患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。
(3)患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。
(4)患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。
(5)患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。
(6)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記サンプルが、原発腫瘍から入手される、方法。
(7)実施態様1、2、もしくは、4の方法において、
標本が、生検もしくは外科検体から入手される、方法。
(8)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現される少なくとも1つの遺伝子の前記発現レベルを測定するステップ、
を更に含む、方法。
(9)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
特異度が、少なくとも約40%である、方法。
(10)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
感度が、少なくとも約90%である、方法。
前記サンプルが、原発腫瘍から入手される、方法。
(7)実施態様1、2、もしくは、4の方法において、
標本が、生検もしくは外科検体から入手される、方法。
(8)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現される少なくとも1つの遺伝子の前記発現レベルを測定するステップ、
を更に含む、方法。
(9)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
特異度が、少なくとも約40%である、方法。
(10)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
感度が、少なくとも約90%である、方法。
(11)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を示す発現パターンと比較される、方法。
(12)実施態様11の方法において、
発現パターンの前記比較が、パターン認識法で実施される、方法。
(13)実施態様12の方法において、
前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード分析を使用することを含む、方法。
(14)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、少なくとも1.5倍高い、もしくは低い、前記サンプル中の発現である、方法。
(15)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、高い、もしくは低い、転移細胞を有する前記サンプル中の発現で、少なくとも統計的に有意なp値を有する、方法。
前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を示す発現パターンと比較される、方法。
(12)実施態様11の方法において、
発現パターンの前記比較が、パターン認識法で実施される、方法。
(13)実施態様12の方法において、
前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード分析を使用することを含む、方法。
(14)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、少なくとも1.5倍高い、もしくは低い、前記サンプル中の発現である、方法。
(15)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、高い、もしくは低い、転移細胞を有する前記サンプル中の発現で、少なくとも統計的に有意なp値を有する、方法。
(16)実施態様15の方法において、
前記p値が、0.05よりも小さい、方法。
(17)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレイ上で、もしくは、遺伝子チップ上で、測定される、方法。
(18)実施態様17の方法において、
前記マイクロアレイが、cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイである、方法。
(19)実施態様18の方法において、
前記マイクロアレイ、もしくは、前記遺伝子チップが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。
(20)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出されるRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施される核酸増幅法によって決定される、方法。
前記p値が、0.05よりも小さい、方法。
(17)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレイ上で、もしくは、遺伝子チップ上で、測定される、方法。
(18)実施態様17の方法において、
前記マイクロアレイが、cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイである、方法。
(19)実施態様18の方法において、
前記マイクロアレイ、もしくは、前記遺伝子チップが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。
(20)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出されるRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施される核酸増幅法によって決定される、方法。
(21)実施態様20の方法において、
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である、方法。
(22)実施態様21の方法において、
前記RT-PCRが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。
(23)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を測定すること、もしくは、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を検出することによって、検出される、方法。
(24)実施態様23の方法において、
前記タンパク質が、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出される、方法。
(25)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特徴を測定することによって検出される、方法。
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である、方法。
(22)実施態様21の方法において、
前記RT-PCRが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。
(23)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を測定すること、もしくは、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を検出することによって、検出される、方法。
(24)実施態様23の方法において、
前記タンパク質が、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出される、方法。
(25)実施態様1〜5のうちのいずれか1つの方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特徴を測定することによって検出される、方法。
(26)実施態様25の方法において、
測定される前記特徴が、DNA増幅、メチル化、突然変異、および、対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
(27)組成物において、
配列番号29〜79からなる群から選択される、少なくとも1つのプローブセット、
を含む、組成物。
(28)生物由来サンプルのデュークスB大腸がんの再発の予測を決定するための解析を実施するためのキットにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、キット。
(29)実施態様28のキットにおいて、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、キット。
(30)実施態様28のキットにおいて、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、キット。
測定される前記特徴が、DNA増幅、メチル化、突然変異、および、対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
(27)組成物において、
配列番号29〜79からなる群から選択される、少なくとも1つのプローブセット、
を含む、組成物。
(28)生物由来サンプルのデュークスB大腸がんの再発の予測を決定するための解析を実施するためのキットにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、キット。
(29)実施態様28のキットにおいて、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、キット。
(30)実施態様28のキットにおいて、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、キット。
(31)状態を評価するための物品において、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、物品。
(32)実施態様31の物品において、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、物品。
(33)実施態様31の物品において、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、物品。
(34)マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
実施態様1〜5のいずれか1つの方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
(35)実施態様34のマイクロアレイにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、マイクロアレイ。
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、物品。
(32)実施態様31の物品において、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、物品。
(33)実施態様31の物品において、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、物品。
(34)マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
実施態様1〜5のいずれか1つの方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。
(35)実施態様34のマイクロアレイにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、マイクロアレイ。
(36)実施態様35のマイクロアレイにおいて、
前記配列が、配列番号29〜79、94〜97から選択される、マイクロアレイ。
(37)実施態様35のマイクロアレイにおいて、
cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイ、
を含む、マイクロアレイ。
(38)実施態様35のマイクロアレイにおいて、
1つ以上の内部対照試薬、
を更に含む、マイクロアレイ。
(39)診断/予後のポートフォリオにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、ポートフォリオ。
(40)実施態様39のポートフォリオにおいて、
前記配列は、配列番号29〜79、94〜97から選択される、ポートフォリオ。
前記配列が、配列番号29〜79、94〜97から選択される、マイクロアレイ。
(37)実施態様35のマイクロアレイにおいて、
cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイ、
を含む、マイクロアレイ。
(38)実施態様35のマイクロアレイにおいて、
1つ以上の内部対照試薬、
を更に含む、マイクロアレイ。
(39)診断/予後のポートフォリオにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、ポートフォリオ。
(40)実施態様39のポートフォリオにおいて、
前記配列は、配列番号29〜79、94〜97から選択される、ポートフォリオ。
Claims (40)
- デュークスB大腸がんの再発の予測を決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、デュークスB大腸がんの再発の予測を示す、方法。 - 患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。 - 患者の治療プロトコルを決定する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルよりも高い、もしくは、低い前記遺伝子発現レベルが、医師が再発を予防するために推奨される治療の程度および種類を決定することができるほど、十分に再発の危険度を示す、方法。 - 患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。 - 患者を治療する方法において、
a.患者から腫瘍サンプルを入手するステップと、
b.mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプル中の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子が、
i.配列番号7〜28に対応するか、
ii.配列番号29〜79、94〜97のうちの少なくとも1つに対応するプライマー、および/もしくは、プローブによって認識されるか、または、
iii.配列番号5〜6、80〜93から選択されるアンプリコンのうちの少なくとも1つの産生によって同定される、
ステップと、
c.前記患者が危険度の高い患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療するステップと、
を含む、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
前記サンプルが、原発腫瘍から入手される、方法。 - 請求項1、2、もしくは4に記載の方法において、
標本が、生検もしくは外科検体から入手される、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
前記サンプルにおいて構成的に発現される少なくとも1つの遺伝子の前記発現レベルを測定するステップ、
を更に含む、方法、 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
特異度が、少なくとも約40%である、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
感度が、少なくとも約90%である、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
前記遺伝子の発現パターンが、再発患者を示す発現パターンと比較される、方法。 - 請求項11記載の方法において、
発現パターンの前記比較が、パターン認識法で実施される、方法。 - 請求項12記載の方法において、
前記パターン認識法が、コックスの比例ハザード分析を使用することを含む、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、少なくとも1.5倍高い、もしくは低い、前記サンプル中の発現である、方法 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞もしくは正常組織に対して、高い、もしくは低い、転移細胞を有する前記サンプル中の発現で、少なくとも統計的に有意なp値を有する、方法。 - 請求項15記載の方法において、
前記p値が、0.05よりも小さい、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレイ上で、もしくは、遺伝子チップ上で、測定される、方法。 - 請求項17記載の方法において、
前記マイクロアレイが、cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイである、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記マイクロアレイ、もしくは、前記遺伝子チップが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出されるRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施される核酸増幅法によって決定される、方法。 - 請求項20記載の方法において、
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である、方法。 - 請求項21記載の方法において、
前記RT-PCRが、1つ以上の内部対照試薬を更に含む、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を測定すること、もしくは、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を検出することによって、検出される、方法。 - 請求項23記載の方法において、
前記タンパク質が、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出される、方法。 - 請求項1〜5のうちのいずれか1項記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特徴を測定することによって検出される、方法。 - 請求項25記載の方法において、
測定される前記特徴が、DNA増幅、メチル化、突然変異、および、対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。 - 組成物において、
配列番号29〜79からなる群から選択される少なくとも1つのプローブセット、
を含む、組成物。 - 生物由来サンプルのデュークスB大腸がんの再発の予測を決定するための解析を実施するためのキットにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、キット。 - 請求項28記載のキットにおいて、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、キット。 - 請求項28記載のキットにおいて、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、キット。 - 状態を評価するための物品において、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を検出するための材料、
を含む、物品。 - 請求項31記載の物品において、
マイクロアレイ分析を実施するための試薬、
を更に含む、物品。 - 請求項31記載の物品において、
前記核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列を解析する媒体、
を更に含む、物品。 - マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップにおいて、
請求項1〜5のいずれか1項記載の方法を実行するための、マイクロアレイ、もしくは、遺伝子チップ。 - 請求項34記載のマイクロアレイにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、マイクロアレイ。 - 請求項35記載のマイクロアレイにおいて、
前記配列が、配列番号29〜79、94〜97から選択される、マイクロアレイ。 - 請求項35記載のマイクロアレイにおいて、
cDNAアレイ、もしくは、オリゴヌクレオチドアレイ、
を含む、マイクロアレイ。 - 請求項35記載のマイクロアレイにおいて、
1つ以上の内部対照試薬、
を更に含む、マイクロアレイ。 - 診断/予後のポートフォリオにおいて、
配列番号7〜28に対応するmRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、それらの相補配列、もしくは、これらの部分配列、
を含む、ポートフォリオ。 - 請求項39記載のポートフォリオにおいて、
前記配列は、配列番号29〜79、94〜97から選択される、ポートフォリオ。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014501496A (ja) * | 2010-10-20 | 2014-01-23 | ユニヴェルシテ ボルドー セガラン | 消化管間質腫瘍における臨床転帰のシグネチャーおよび消化管間質腫瘍の治療の方法 |
JP2017510304A (ja) * | 2014-04-10 | 2017-04-13 | バイオ−マルケア テクノロジーズ リミテッド | 前癌性結腸直腸ポリープおよび結腸直腸癌を特定するための方法およびキット |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10533998B2 (en) | 2008-07-18 | 2020-01-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
WO2007081386A2 (en) | 2006-01-11 | 2007-07-19 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic devices and methods of use |
US20080014589A1 (en) | 2006-05-11 | 2008-01-17 | Link Darren R | Microfluidic devices and methods of use thereof |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
EP2077912B1 (en) | 2006-08-07 | 2019-03-27 | The President and Fellows of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
DE102006035393A1 (de) * | 2006-11-02 | 2008-05-15 | Signature Diagnostics Ag | Prognostische Marker für die Klassifizierung des dreijährigen progessionsfreien Überlebens von Patienten mit Kolonkarzinomen basierend auf Expressionsprofilen von biologischen Proben |
US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
WO2010009365A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet libraries |
WO2010096929A1 (en) * | 2009-02-25 | 2010-09-02 | Diagnocure Inc. | Method for detecting metastasis of gi cancer |
US8528589B2 (en) | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
EP2486409A1 (en) | 2009-10-09 | 2012-08-15 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
US10428388B2 (en) | 2009-11-05 | 2019-10-01 | Genomictree, Inc. | Method for detecting the methylation of colorectal-cancer-specific methylation marker genes for colorectal cancer diagnosis |
KR101142131B1 (ko) * | 2009-11-05 | 2012-05-11 | (주)지노믹트리 | 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법 |
US10837883B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
WO2011100604A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
EP3447155A1 (en) | 2010-09-30 | 2019-02-27 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
WO2012109600A2 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
WO2012112804A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
US10308980B2 (en) * | 2011-11-04 | 2019-06-04 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
WO2013120089A1 (en) | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Raindance Technologies, Inc. | Molecular diagnostic screening assay |
WO2013165748A1 (en) | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Raindance Technologies, Inc | Digital analyte analysis |
EP2986762B1 (en) | 2013-04-19 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
ES2534734B1 (es) * | 2013-09-26 | 2016-02-09 | Servicio Andaluz De Salud | Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes de cáncer colorrectal |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
EP3090063B1 (en) | 2013-12-31 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detection of latent retrovirus |
CN105468893B (zh) | 2014-09-26 | 2019-06-21 | 希森美康株式会社 | 辅助大肠癌的再发风险诊断的计算机系统、程序及方法 |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
US10900084B2 (en) | 2015-09-16 | 2021-01-26 | Sysmex Corporation | Method for supporting diagnosis of risk of colorectal cancer recurrence, treatment of colorectal cancer, and administration of anticancer drug |
US10998178B2 (en) | 2017-08-28 | 2021-05-04 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for sample analysis using swabs |
KR20200093438A (ko) * | 2017-12-01 | 2020-08-05 | 일루미나, 인코포레이티드 | 체성 돌연변이 클론형성능을 결정하기 위한 방법 및 시스템 |
CN111560433B (zh) * | 2020-04-28 | 2022-07-19 | 福建中医药大学 | 人nufip1的用途及相关产品 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7229770B1 (en) * | 1998-10-01 | 2007-06-12 | The Regents Of The University Of California | YKL-40 as a marker and prognostic indicator for cancers |
EP1358349A2 (en) * | 2000-06-05 | 2003-11-05 | Avalon Pharmaceuticals | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets |
US20030194734A1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-10-16 | Tim Jatkoe | Selection of markers |
US7348142B2 (en) * | 2002-03-29 | 2008-03-25 | Veridex, Lcc | Cancer diagnostic panel |
US20030186302A1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-10-02 | Yixin Wang | Colorectal cancer diagnostics |
US20030186303A1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-10-02 | Yixin Wang | Colorectal cancer diagnostics |
US20040191782A1 (en) * | 2003-03-31 | 2004-09-30 | Yixin Wang | Colorectal cancer prognostics |
US20050048494A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-03 | Yixin Wang | Colorectal cancer prognostics |
CA2475769C (en) * | 2003-08-28 | 2018-12-11 | Veridex, Llc | Colorectal cancer prognostics |
-
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- 2007-03-05 CN CNA2007800159533A patent/CN101437962A/zh active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014501496A (ja) * | 2010-10-20 | 2014-01-23 | ユニヴェルシテ ボルドー セガラン | 消化管間質腫瘍における臨床転帰のシグネチャーおよび消化管間質腫瘍の治療の方法 |
JP2017510304A (ja) * | 2014-04-10 | 2017-04-13 | バイオ−マルケア テクノロジーズ リミテッド | 前癌性結腸直腸ポリープおよび結腸直腸癌を特定するための方法およびキット |
US10407737B2 (en) | 2014-04-10 | 2019-09-10 | Bio-Marcare Technologies Ltd. | Methods and kits for identifying pre-cancerous colorectal polyps and colorectal cancer |
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