BRPI0708534A2 - ensaio molecular para prognosticar a recorrência de cáncer do cólon dukes b - Google Patents

Abstract

ENSAIO MOLECULAR PARA PROGNOSTICAR A RECORRêNCIA DE CáNCER DO CóLON DUKES B. A presente invenção refere-se a avaliação do status do câncer colorretal por determinação da expressão diferencial de uma coleção de genes. Especificamente usada para distinguir entre pacientes operados Duke's B recorrentes e não-recorrentes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO MO-LECULAR PARA PROGNOSTICAR A RECORRÊNCIA DE CÂNCER DOCÓLON DUKES B".

A presente invenção refere-se aos prognósticos para o câncercolorretal com base nos perfis de expressão dos genes das amostrasbiológicas.

O câncer colorretal é uma doença heterogênea com origenscomplexas. Logo que o paciente é tratado para o câncer colorretal, a proba-bilidade de uma recorrência está relacionada ao grau de penetração dotumor através da parede do intestino e à presença ou ausência de envol-vimento nodal. Estas características são a base para o sistema de estadia-mento atual, definido pela classificação de Duke. A doença Dukes B estáconfinada às camadas submucosas do cólon ou reto. O tumor Dukes Binvade através da lâmina muscular própria e poderia penetrar na parede docólon ou do reto. A doença Dukes C inclui qualquer grau de invasão daparede do intestino com metástase de Iinfonodo regional.

A ressecção cirúrgica é altamente efetiva para os câncerescolorretais em estágio inicial, proporcionando taxas de cura de 95% empacientes Dukes A e 75% nos Dukes Β. A presença de Iinfonodo positivo nadoença Dukes C prognostica uma probabilidade de 60% de recorrênciadentro de cinco anos. O tratamento dos pacientes Dukes C com um cursopós-cirúrgico de quimioterapia reduz a taxa de recorrência para 40%-50%, e éagora o padrão de cuidado para os pacientes Dukes C. Por causa da taxarelativamente baixa de recorrência, o benefício da quimioterapia pós-cirúrgica emDuke B tem sido mais difícil de detectar e permanece controverso. Entretanto, aclassificação de Dukes B è imperfeita, visto que aproximadamente 20 - 30%destes pacientes comportam-se mais como Dukes C e têm recaída dentrode um intervalo de tempo de 5 anos.

Há claramente uma necessidade de identificar fatores prognósti-cos melhores do que o envolvimento nodal para a seleção orientadora deDukes B naqueles que são prováveis de terem recaída e naqueles quesobreviverão. Rosenwald e outros (2002); Compton e outros (2000); Ratto eoutros (1998); Watanabe e outros (2001); Noura e outros (2002); Halling eoutros (1999); Martinez-Lopez1 e outros (1998); Zhou e outros (2002);Ogunbiyi e Outros "(1998);-SWibãra-e outros (1996); Sun e outros (1999); eMcLeod e outros (1999). Esta informação permitiria um planejamento melhorinformado identificando pacientes que são mais prováveis de requerer epossivelmente beneficiar-se da terapia adjuvante. Johnston (2005); Saltz eoutros (1997); Wolmark e outros (1999); International multicenter pooledanalysis of B2 colon câncer trials (IMPACT B2) investigators: Efficacy ofadjuvant fluorouracil and folinic acid in B2 colon câncer (1999); e Mamounase outros (1999).

A aplicação clínica da genômica no diagnóstico e no controle decâncer está ganhando força, à medida que a descoberta e os estudos devalidação iniciais são completados. Allen e outros (2005a); Allen e outros(2005b); Van't Veer e outros (2002); Van de Vijver e outros (2002); Wang e col(2005); Beer e outros (2002); e Shipp e outros (2002). À medida que maisestudos são publicados, tem havido uma apreciação crescente dos desafiosque se voltam para a implementação destas assinaturas na prática clínicageral. Ransohoff (2005) e Simon e outros (2003) descreveram recentementeo mérito da eliminação de aspectos de distorção e críticos da avaliação demarcadores moleculares. Uma exigência clara comum para a aceitação maisampla de uma marca molecular é a validação do desempenho do ensaiosobre uma população de pacientes verdadeiramente independente. Umalimitação adicional é que os ensaios à base de microarranjos de DNArequerem amostras de tecidos congeladas novas. Como um resultado, estestestes não podem ser prontamente aplicados ao material clínico padrão, talcomo as amostras de tecidos incrustadas em parafina congelada (FPE).

Nos Pedidos de Patentes publicados US de propriedade comum20050048526, 20050048494, 20040191782, 20030186303 r 20030186302 eWang e outros (2005), foram apresentados perfis de expressão dos genespara o câncer do cólon. Este relatório descritivo apresenta materiais emétodos para determinar os perfis de expressão dos genes.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona materiais e métodos para avaliar aprobabilidade-de uma recorrência de câncer colorretal em um pacientediagnosticado com, ou tratado para, câncer colorretal. O método envolve aanálise de um perfil de expressão do gene.

Em um aspecto da invenção, o perfil de expressão do gene incluiiniciadores e sondas para detectar a expressão de pelo menos sete genesparticulares.

Os artigos usados na prática dos métodos são também umaspecto da invenção. Tais artigos incluem os perfis de expressão do gene ouas representações deles que são fixadas em meio capaz de ser lido pormáquina, tal como um meio capaz de ser lido por computador.

Os artigos usados para identificar os perfis de expressão dogene podem também incluir os substratos ou as superfícies, tais como osmicroarranjos, para capturar e/ou indicar a presença, a ausência, ou o graude expressão do gene.

Em mais um outro aspecto da invenção, os kits incluemreagentes para conduzir o prognóstico por análise da expressão do gene darecorrência de câncer colorretal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um Gráfico de Kaplan-Meier padrão, construído apartir do conjunto de dados de pacientes independentes de 27 pacientes (14sobreviventes, 13 recorrentes), como descrito nos Exemplos, para a análisedo portfólio de sete genes. Duas classes de pacientes são indicadas comoprognosticadas pelos dados do fragmento. O eixo vertical mostra aprobabilidade de sobrevivência sem doença entre os pacientes em cadaclasse.

A figura 2 é um Gráfico de Kaplan-Meier padrão, construído apartir do conjunto de dados de pacientes independentes de 9 pacientes (6sobreviventes, 3 recorrentes), como descrito nos Exemplos, para a análisedo portfólio de 15 genes. Duas classes de pacientes são indicadas comoprognosticadas pelos dados do fragmento. O eixo vertical mostra aprobabilidade de sobrevivência sem doença entre os pacientes em cadaclasse.

A figura 3-é um Gráfico de Kaplan-Meier padrão, construído apartir de dados de pacientes, conforme descrito nos Exemplos, e usando operfil de 22 genes com a inclusão da Caderina 17 (SEQ ID NO: 6) noportfólio. Trinta e seis amostras foram testadas (20 sobreviventes, 16recorrentes). Duas classes de pacientes são indicadas como prognosticadaspelos dados do fragmento do painel de 23 genes. O eixo vertical mostra aprobabilidade de sobrevivência sem doença entre os pacientes em cadaclasse.

A figura 4 é uma análise de ROC e da sobrevivência de Kaplan-Meier das marcas de prognóstico sobre 123 pacientes independentes. A. Acurva de ROC da marca de gene. B. Curva de Kaplan-Meier e teste por Iogde classificação de 123 amostras de tumor congeladas. O risco derecorrência para cada paciente foi avaliado com base na marca de gene e olimiar foi determinado pelo conjunto de treinamento. Os conjuntos de alto ebaixo riscos diferem significativamente (P = 0,04).

A figura 5 é uma análise de ROC e da sobrevivência Kaplan-Meier das marcas de prognóstico sobre 110 pacientes independentes. A. Acurva de ROC da marca de gene. B. Curva de Kaplan-Meier e teste por Iogde classificação de 110 amostras de tumor FPE. O risco de recorrência paracada paciente foi avaliado com base na marca de gene e o limiar foideterminado pelo conjunto de treinamento. Os conjuntos de alto e baixoriscos diferem significativamente (P < 0,0001).

A figura 6 é um eletroforetograma.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Um Biomarcador é qualquer sinal do nível de expressão de umGene marcador indicado. O sinal pode ser direto ou indireto e medir a super-ou a subexpressão do gene, dados os parâmetros fisiológicos e emcomparação com um controle interno, um tecido normal ou um outrocarcinoma. Os Biomarcadores incluem, sem limitação, os ácidos nucléicos(tanto a super e a subexpressão quanto direto e indireto). A utilização dosácidos nucléicos como Biomarcadores pode incluir qualquer métodoconhecido na técnica, incluindo, sem limitação, medir a amplificação do DNA,o RNA-o-micro RNA, a perda-de heterozigosidade-^OH), os polimorfismosde nucleotídeos individuais (SNPs, Brookes (1999)), o DNA microssatélite, ahipo- ou a hipermetilação do DNA. A utilização de proteínas comoBiomarcadores inclui qualquer método conhecido na técnica, incluindo, semlimitação, medir a quantidade, a atividade, as modificações, tais como aglicosilação, a fosforilação, a ribosilação do ADP, a ubiquitinação, etc., ou aimunoistoquímica (IHC). Os outros Biomarcadores incluem o imageamento,a contagem de células e os Marcadores da apoptose.

Os genes indicados proporcionados neste documento sãoaqueles associados com um tipo de tumor ou tecido particular. Um Genemarcador pode estar associado com diversos tipos de câncer, porém desdeque a expressão do gene esteja suficientemente associada com um tipo detumor ou tecido a ser identificado usando os métodos descritos nestedocumento e aqueles sabidos na técnica prognosticar a recorrência docâncer do cólon Dukes Β. A presente invenção proporciona Genesmarcadores preferidos e combinações de Genes marcadores ainda maispreferidas. Estes são descritos neste documento em detalhe.

Um Gene marcador corresponde à seqüência designada poruma SEQ ID NO quando ele contiver aquela seqüência. Um segmento oufragmento de gene corresponde à seqüência de tal gene quando ele contiveruma parte da seqüência referida ou de seu complemento, suficiente paradistingui-la como sendo a seqüência do gene. Um produto da expressão dogene corresponde a tal seqüência quando o seu RNA, mRNA, ou cDNAhibridizar com a composição tendo tal seqüência (por exemplo, uma sonda)ou, no caso de um peptídeo ou proteína, for codificado por tal mRNA. Umsegmento ou fragmento de um produto da expressão do gene corresponde àseqüência de tal gene ou produto da expressão do gene quando ele contiveruma parte do produto da expressão do gene referido ou de seucomplemento, suficiente para distingui-la como sendo a seqüência do geneou produto da expressão do gene.Os métodos, as composições, os artigos, e os kits inventivosdescritos e reivindicados neste relatório descritivo incluem um ou maisGenes marcadores. O-Marcador" ou o !,Gene-marcador"-é usado por todoeste relatório descritivo para referir-se aos genes e aos produtos daexpressão dos genes que correspondem com qualquer gene, cuja super- ousubexpressão está associada com um tipo de tumor ou tecido. Os Genesmarcadores preferidos são aqueles associados com as SEQ ID NOs: 7-28.Os iniciadores e as sondas de polinucleotídeos da invenção são mostradoscomo SEQ ID NOs: 29-79 e 94-97. Os amplicons da presente invenção sãomostrados como SEQ ID NOs: 5-6, 80-93.

Amplicons

Seqüência seq id nogaattcgcccttgagaaaacgacgcatccactactgcgattaccctgg ttgcacaaaagi i iacaccaagtcttctcatttaaaagctcacctgag gactaagggcgaattc 5aaacg acgcatccactactgcgattaccctggttgcacaaaagttt ac accaagtcttct 6aaacgacgcatccactactgcgattaccctggttgcacaaaagtttat accaagtcttct 80c attt aa a ag ctc acctg ag gact 81cai i iaaaagctcacctgaggact 82gaattcgcccttgggctctgtggcaagatctatatctggaaggggcga aadagcgaatgagaaggagcggcaagggcgaattcgtttaaacctgc aggactgagt 83gggctctgtggcaagatctatatctggaaggggcgaaaagcgaatga gaaggagcggca 84gggctctgtggcaagatct at atctgg aaggggcgaaaagcg aatga gaaggagcggca 85gaattcgcccttccctggcatccgagacagtgccttctccatggagtc cattgatgattacgtgaacgttccgaagggcgaattcgttt aaacctg caggactagt 86ccctggcatccgagacagtgccttctccatggagtccattgatgatta 87<table>table see original document page 8</column></row><table>

Em uma modalidade, os Genes marcadores são aqueles asso-ciados com qualquer uma de SEQ ID NOs: 7-28. Em uma outra modalidade,os iniciadores e as sondas de polinucleotídeos da invenção são pelo menosuma de SEQ ID NOs: 29-79 e 94-97. Em uma outra modalidade, osMarcadores são identificados pela produção de pelo menos um dosamplicons SEQ ID NOs: 5-6, 80-93. A presente invenção adicionalmenteproporciona kits para conduzir um ensaio de acordo com os métodosproporcionados neste documento e adicionalmente contendo reagentes dedetecção de Biomarcadores.

A presente invenção adicionalmente proporciona microarranjosou fragmentos de genes para efetuar os métodos descritos neste documento.

A presente invenção proporciona métodos de obter informaçãoclínica adicional, incluindo obter conjuntos de biomarcadores ótimos para oscarcinomas; proporcionar a direção da terapia e identificar o tratamentoapropriado para eles; e proporcionar um prognóstico.

A presente invenção adicionalmente proporciona métodos deencontrar Biomarcadores por determinação do nível de expressão de umGene marcador em uma metástase particular, medição de um Biomarcadorpara o Gene marcador para determinar a sua expressão, análise daexpressão do Gene marcador de acordo com quaisquer dos métodosproporcionados neste documento ou conhecidos na técnica e determinaçãose o Gene marcador é efetivamente específico para o prognóstico.

A presente invenção adicionalmente-proporciona portfóliosdiagnósticos/prognósticos contendo seqüências isoladas de ácidos nucléicos,seus complementos, ou suas porções de uma combinação de genes,conforme descritos neste documento, em que a combinação é suficientepara medir ou caracterizar a expressão do gene em uma amostra biológicatendo células metastáticas em relação às células de diferentes carcinomasou tecido normal.

Qualquer método descrito na presente invenção pode adicional-mente incluir medir a expressão de pelo menos um gene constitutivamenteexpresso na amostra.

A mera presença ou ausência de seqüências de ácidos nuclé-icos particulares em uma amostra de tecido tem somente sido raramenteverificada ter valor diagnóstico ou prognóstico. A informação sobre aexpressão de diversas proteínas, peptídeos ou mRNA, por outro lado, é vistacada vez mais como importante. A mera presença de seqüências de ácidosnucléicos tendo o potencial de expressar proteínas, peptídeos, ou mRNA(tais seqüências referidas como "genes") dentro do genoma, sozinhas, não édeterminativa de se uma proteína, peptídeo, ou mRNA é expresso em umadada célula. Se um dado gene capaz de expressar proteínas, peptídeos, oumRNA assim o faz ou não, e até que proporção ocorre tal expressão, sealguma, é determinado por uma variedade de fatores complexos. Indepen-dente das dificuldades em entender e avaliar estes fatores, o teste daexpressão do gene pode proporcionar informação útil sobre a ocorrência deeventos importantes, tais como a tumorigênese, a metástase, a apoptose, eoutros fenômenos clinicamente relevantes. As indicações relativas do grauaté o qual os genes são ativos ou inativos podem ser verificadas em perfisde expressão do gene. Os perfis de expressão do gene desta invenção sãousados para proporcionar um diagnóstico e tratar os pacientes.

A preparação da amostra requer a coleta de amostras dopaciente. As amostras do paciente usadas no método inventivo são aquelasque são suspeitas de conter células doentes, tais como as células retiradasde um nódulo em um aspirado com agulha fina (FNA) do tecido. Apreparação de tecido em volume obtida de uma biópsia ou uma amostracirúrgica e uma microdissecção por captura a laser são também adequadaspara uso. A tecnologia de Microdissecção por Captura a Laser (LCM) é ummodo de selecionar as células a serem estudadas, minimizando a varia-bilidade causada pela heterogeneidade dos tipos de células. Conseqüente-mente, as alterações moderadas ou pequenas na expressão do Genemarcador entre as células normais ou benignas e cancerosas podem serprontamente detectadas. As amostras podem também compreender célulasepiteliais circulantes extraídas do sangue periférico. Estas podem ser obtidasde acordo com diversos métodos, porém o método mais preferido é atécnica de separação magnética descrita em 6136182. Assim que a amostracontendo as células de interesse tiver sido obtida, um perfil de expressão dogene é obtido usando um Biomarcador, para genes nos portfóliosapropriados.

Os métodos preferidos para estabelecer os perfis de expressãodo gene incluem determinar a quantidade de RNA que é produzido por umgene que pode codificar uma proteína ou peptídeo. Isto é efetuado portranscritase reversa e PCR (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR emtempo real, RT-PCR de exposição diferencial, análise por Northern Blot eoutros testes relacionados. Embora seja possível conduzir estas técnicasusando reações PCR individuais, é melhor amplificar o DNA complementar(cDNA) ou o RNA complementar (cRNA) produzido a partir do mRNA eanalisá-lo via microarranjo. Diversas configurações de arranjos diferentes emétodos para a sua produção são conhecidos para aqueles de habilidade natécnica e são descritos, por exemplo, em 5445934; 5532128; 5556752;5242974; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327;5472672; 5527681; 5529756; 5545531; 5554501; 5561071; 5571639;5593839; 5599695; 5624711; 5658734; e 5700637.

A tecnologia do microarranjo permite medir o nível de mRNA emestado estacionário de milhares de genes simultaneamente, proporcionandouma ferramenta poderosa para identificar efeitos tais como o início, ainterrupção, ou a modulação da proliferação descontrolada de células. Duastecnologias de microarranjos estão atualmente em-amplo uso, os arranjos decDNA e de oligonucleotídeos. Embora existam diferenças na construçãodestes fragmentos, essencialmente toda a análise de dados a jusante e aprodução são iguais. O produto destas análises são tipicamente mediçõesda intensidade do sinal recebido de uma sonda marcada, usada paradetectar uma seqüência de cDNA a partir da amostra que hibridiza com umaseqüência de ácidos nucléicos, em uma posição conhecida sobre omicroarranjo. Tipicamente, a intensidade do sinal é proporcional à quanti-dade de cDNA, e assim, de mRNA, expresso nas células da amostra. Umgrande número de tais técnicas está disponível e é útil. Os métodospreferidos para determinar a expressão do gene podem ser encontrados em6271002; 6218122; 6218114; e 6004755.

A análise dos níveis de expressão é conduzida comparando-setais intensidades de sinal. Isto é mais bem feito gerando uma matriz derazão das intensidades de expressão dos genes em uma amostra de testeversus aquelas em uma amostra de controle. Por exemplo, as intensidadesde expressão dos genes a partir de um tecido doente podem ser compara-das com as intensidades de expressão geradas a partir de tecido benigno ounormal do mesmo tipo. Uma razão destas intensidades de expressão indicaa quantidade de vezes de alteração na expressão do gene entre asamostras de teste e de controle.

A seleção pode ser baseada em testes estatísticos que produ-zem listas com pontuações relacionadas à evidência de significado para aexpressão diferencial de cada gene entre os fatores relacionados aoprognóstico do tumor. Os exemplos de tais testes incluem ANOVA e Kruskal-Wallis. As pontuações podem ser usadas como ponderações em um modeloprojetado para interpretar o somatório de tais ponderações, até um corte,como a preponderância de evidência em favor de uma classe sobre outra. Aevidência prévia, conforme descrita na literatura, pode também ser usadapara ajustar as ponderações.Uma modalidade preferida é normalizar cada medição poridentificação de um conjunto de controle estável e escalonar este conjuntoaté-a-variância zero através de todas as amostras. Este conjunto-de-oontroleé definido como qualquer transcrito endógeno individual ou conjunto detranscritos endógenos afetado por erro sistemático no ensaio, e não sabidoalterar-se independentemente deste erro. Todos os marcadores sãoajustados pelo fator específico da amostra que gera variância zero paraqualquer estatística descritiva do conjunto de controle, tal como a média ou amediana, ou para uma medição direta. Alternativamente, se a premissa devariação dos controles relacionada somente ao erro sistemático não forverdadeira, contudo o erro de classificação resultante for menor quando anormalização for efetuada, o conjunto de controle ainda será usadoconforme estabelecido. Os controles fixados não endógenos poderiamtambém ser úteis, porém não são preferidos.

Os perfis de expressão dos genes podem ser mostrados emdiversos modos. O mais comum é dispor as intensidades de fluorescênciabrutas ou a matriz de razão em um dendrograma gráfico, em que as colunasindicam as amostras de teste e as linhas indicam os genes. Os dados sãodispostos de modo que os genes que tenham perfis de expressão similaresestejam próximos um do outro. A razão de expressão para cada gene évisualizada como uma cor. Por exemplo, uma razão menor do que um (infra-regulação) aparece na porção azul do espectro, enquanto que uma razãomaior do que um (supra-regulação) aparece na porção vermelha do espectro.Os programas de software de computadores comercialmente disponíveisestão disponíveis para mostrar tais dados, incluindo o "GeneSpring" (SiliconGenetics, Inc.) e o "Discovery" e o "Infer" (Partek, Inc.).

As medições da abundância de espécies únicas de RNA sãocoletadas dos tumores primários ou dos tumores metastáticos. Estas leituras,juntamente com os registros clínicos, incluindo, porém não limitados à idade deum paciente, sexo, local de origem do tumor primário, e local da metástase(se aplicável), são usadas para gerar um banco de dados relacionai. Obanco de dados é usado para selecionar os transcritos de RNA e os fatoresclínicos que podem ser usados como variáveis de marcadores paraprognosticar o risco de recorrência de um tumor.

No caso de medir os níveis de proteína para determinar aexpressão do gene, qualquer método conhecido na técnica é adequado,desde que ele resulte em especificidade e sensibilidade adequadas. Porexemplo, os níveis de proteína podem ser medidos por ligação a umanticorpo ou fragmento de anticorpo específico para a proteína e medição daquantidade de proteína Iigante ao anticorpo. Os anticorpos podem sermarcados por reagentes radioativos, fluorescentes ou outros reagentesdetectáveis, para facilitar a detecção. Os métodos de detecção incluem, semlimitação, o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA) e astécnicas de imunoblot.

Os genes modulados, usados nos métodos da invenção, sãodescritos nos Exemplos. Os genes que são expressos diferencialmente sãosupra regulados ou infra regulados nos pacientes com recorrência versusaqueles sem recorrência do câncer do cólon Dukes Β. A supra regulação e ainfra regulação são termos relativos, significando que uma diferençadetectável (além da contribuição do ruído no sistema usado para medi-lo) éverificada na quantidade de expressão dos genes em relação a alguma linhade base. Neste caso, a linha de base é determinada com base na árvore declassificação. Os genes de interesse nas células doentes são então supraregulados ou infra regulados em relação ao nível da linha de base, usando omesmo método de medição. Doente, neste contexto, refere-se a umaalteração do estado de um corpo que interrompe ou perturba, ou tem opotencial de perturbar, o desempenho adequado das funções corpóreas,conforme ocorre com a proliferação descontrolada de células. Alguém édiagnosticado com uma doença quando algum aspecto do genótipo ou dofenótipo desta pessoa está consistente com a presença da doença.

Entretanto, o ato de conduzir um diagnóstico ou prognóstico pode incluir adeterminação de questões de doença/status, tal como a determinação daprobabilidade de recorrência, o tipo de terapia e o monitoramento da terapia.

No monitoramento da terapia, os julgamentos clínicos são feitos com relaçãoao efeito de um dado curso de terapia por comparação da expressão dosgenes com o tempo, para determinar se os perfis de expressão dos genes-alteraram-se- ou- estão-alterando -para padrões mais- consistentes- com otecido normal.

Os genes podem ser agrupados de modo que a informaçãoobtida sobre o conjunto de genes no conjunto proporcione uma base segurapara fazer um julgamento clinicamente relevante, tal como um diagnóstico,prognóstico, ou escolha de tratamento. Estes conjuntos de genes constituem osportfólios da invenção. Como com a maior parte dos Marcadores diagnós-ticos, é freqüentemente desejável usar o menor número de Marcadores,suficiente para fazer um julgamento médico correto. Isto impede um retardono tratamento aguardando mais análise, bem como o. uso improdutivo detempo e recursos.

Um método de estabelecer os portfólios de expressão dos genesé através do uso de algoritmos de otimização, tais como o algoritmo devariância média, amplamente usado no estabelecimento de portfólios deestoque. Este método é descrito em detalhe em 20030194734. Essencial-mente, o método requer o estabelecimento de um conjunto de insumos(estoques em aplicações financeiras, expressão conforme medida pelaintensidade aqui) que otimizará o retorno (por exemplo, o sinal que é gerado)que se recebe por utilizá-lo, ao mesmo tempo minimizando a variabilidadedo retorno. Muitos programas comerciais de software estão disponíveis paraconduzir tais operações. O "Wagner Associates Mean-Variance OptimizationApplication", referido como "Software Wagner" por todo este relatóriodescritivo, é preferido. Este software, que utiliza funções da "WagnerAssociates Mean-Variance Optimization Library" para determinar umafronteira eficiente e portfólios ótimos no sentido de Markowitz, é preferido.Markowitz (1952). O uso deste tipo de software requer que o dado domicroarranjo seja transformado, de modo que ele possa ser tratado como uminsumo no retorno do caminho do estoque, e as medições de risco sãousadas quando o software for usado para os seus propósitos de análisefinanceira pretendidos.O processo de selecionar um portfólio pode também incluir aaplicação de regras heurísticas. De preferência, tais regras são formuladascom base na biologia-e -em Hjrrv entendimento da- tecnologia-usada paraproduzir os resultados clínicos. Mais preferivelmente, elas são aplicadas aoproduto do método de otimização. Por exemplo, o método de variânciamédia de seleção de portfólio pode ser aplicado ao dado do microarranjopara diversos genes diferencialmente expressos em pacientes com câncer.O produto do método seria um conjunto otimizado de genes que poderiaincluir alguns genes que são expressos no sangue periférico, bem como notecido doente. Se as amostras usadas no método de teste forem obtidas apartir do sangue periférico e certos genes diferencialmente expressos emsituações de câncer pudessem também ser diferencialmente expressos nosangue periférico, então uma regra heurística pode ser aplicada, na qual umportfólio é selecionado a partir da fronteira eficiente, excluindo aqueles quesão diferencialmente expressos no sangue periférico. Obviamente, a regrapode ser aplicada antes da formação da fronteira eficiente, por exemplo,aplicando a regra durante a pré-seleção de dados.

Podem ser aplicadas outras regras heurísticas que não estejamnecessariamente relacionadas à biologia em questão. Por exemplo, pode-seaplicar uma regra que somente uma porcentagem prescrita do portfólio podeser representada por um gene ou conjunto de genes particular. Um softwarecomercialmente disponível, tal como o Software de Wagner, prontamenteconcilia estes tipos de heurística. Isto pode ser útil, por exemplo, quandofatores diferentes da exatidão e da precisão (por exemplo, taxas delicenciamento antecipadas) tiverem um impacto sobre a conveniência deincluir um ou mais genes.

Os perfis de expressão dos genes desta invenção podemtambém ser usados em conjunção com outros métodos diagnósticos nãogenéticos, úteis no diagnóstico, prognóstico, ou monitoramento dotratamento de câncer. Por exemplo, em algumas circunstâncias, é benéficocombinar a capacidade diagnostica dos métodos à base de expressão degenes descritos acima com os dados de Marcadores convencionais, taiscomo os Marcadores de proteínas do soro (por exemplo, o Antígeno doCâncer 27.29 ("CA 27.29")). Existe uma faixa de tais Marcadores, incluindo4ais-analitos <ξογτίθ o CA--27-:-29. Em-tal método, o sangue-é-periodicamenteretirado de um paciente tratado e então submetido a um imunoensaio deenzima para um dos Marcadores do soro descritos acima. Quando aconcentração do Marcador sugerir o retorno dos tumores ou o fracasso daterapia, retira-se uma fonte da amostra receptiva à análise da expressão dogene. Em que existir uma massa suspeita, um aspirado com agulha fina(FNA) é retirado e os perfis de expressão do gene das células retiradas damassa são então analisados, conforme descrito acima. Alternativamente, asamostras de tecido podem ser retiradas de áreas adjacentes ao tecido apartir do qual um tumor foi anteriormente removido. Esta abordagem podeser particularmente útil quando outro teste produzir resultados ambíguos.

Os kits feitos de acordo com a invenção incluem ensaiosformatados para determinar os perfis de expressão dos genes. Estes podemincluir todos ou alguns dos materiais necessários para conduzir os ensaios,tais como reagentes e instruções e um meio através do qual são testados osBiomarcadores.

Os artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão dos genes, úteis para tratar, diagnosticar, prognosticar, e de outromodo avaliar as doenças. Estas representações dos perfis são reduzidas atéum meio que possa ser automaticamente lido por uma máquina, tal comomeios capazes de serem lidos por computador (magnéticos, ópticos, esimilares). Os artigos podem também incluir instruções para avaliar os perfisde expressão dos genes em tais meios. Por exemplo, os artigos podemcompreender um CD ROM tendo instruções de computador para compararos perfis de expressão dos genes dos portfólios de genes descritos acima.

Os artigos podem também ter perfis de expressão de genes registradosdigitalmente neles, de modo que eles possam ser comparados com dadosde expressão de genes de amostras de pacientes. Alternativamente, osperfis podem ser registrados em diferente formato representacional. Umregistro gráfico é tal formato. Algoritmos de conglomerado ("clustering"), taiscomo aqueles incorporados no software "DISCOVERY" e "INFER" da Partek,Inc., mencionados acima, podem melhor auxiliar na visualização de tais dados.

Os diferentes tipos de artigos de fabricação de acordo com ainvenção são os meios ou os ensaios formatados usados para revelar osperfis de expressão dos genes. Estes podem compreender, por exemplo, osmicroarranjos, nos quais os complementos de seqüências ou as sondas sãounidas a uma matriz à qual as seqüências indicativas dos genes de interessecombinam-se, criando um determinante de sua presença capaz de ser lido.

Alternativamente, os artigos de acordo com a invenção podem seradaptados nos kits de reagentes para conduzir a hibridização, a amplificação,e a geração de sinais, indicativas do nível de expressão dos genes deinteresse para detectar o câncer.

Os exemplos a seguir são proporcionados para ilustrar, porémnão limitar a invenção reivindicada. Todas as referências citadas nestedocumento são, pelo presente, incorporadas aqui por referência.

Os perfis preferidos desta invenção são o portfólio de sete genesmostrado na Tabela 2 e o portfólio de quinze genes mostrado na Tabela 3.

São mais preferidos os portfólios de expressão dos genes constituídos deum outro gene prognóstico independentemente verificado colorretal, talcomo a Caderina 17, juntamente com a combinação de genes em ambas aTabela 2 e a Tabela 3 (Tabela 4). Este portfólio mais preferido melhorsegrega os pacientes Dukes B em alto risco de recorrência daqueles quenão estão. Assim que os pacientes de alto risco forem identificados, elespodem então ser tratados com terapia adjuvante. Outros genes prognósticosindependentemente verificados podem ser usados no Iugarda Caderina 17.

Nesta invenção, o método mais preferido para analisar o padrãode expressão do gene de um paciente, para determinar o prognóstico decâncer do cólon, é através do uso de um programa de análise de risco deCox. Mais preferivelmente, a análise é conduzida usando o software S-Plus(comercialmente disponível da Insightful Corporation). Usando tais métodos,um perfil de expressão do gene é comparado com aquele de um perfil querepresenta com certeza a recorrência (isto é, os níveis de expressão para acombinação de genes no perfil são indicativos da recorrência). O modelo deriseo-de-Gox com o limiar-estabelecido é usado para-comparar a-similaridadedos dois perfis (recorrência conhecida versus paciente) e então determina seo perfil do paciente excede o limiar. Se exceder, então o paciente éclassificado como um que terá recorrência e é consentido o tratamento, talcomo a terapia adjuvante. Se o perfil dos pacientes não exceder o limiar,então eles são classificados como um paciente sem recorrência. Outrasferramentas analíticas podem também ser usadas para responder à mesmapergunta, tais como análise discriminante linear, regressão logística eabordagens de redes neurais.

Estão disponíveis diversos outros métodos bastante conhecidosde reconhecimento de padrão. As seguintes referências proporcionamalguns exemplos:

Weighted Voting: Golub e outros (1999).

Support Vector Machines and K-nearest Neighbors: Su e outros(2001); e Ramaswamy e outros (2001).

Correlation Coefficients: van 't Veer e outros (2002) Geneexpression profiling predicts clinicai outcome of breast câncer Nature415:530-536.

Os perfis de expressão dos genes desta invenção podem tambémser usados em conjunção com outros métodos diagnósticos não-genéticos, úteisno diagnóstico, prognóstico, ou monitoramento do tratamento de câncer. Porexemplo, em algumas circunstâncias, é benéfico combinar a capacidadediagnostica dos métodos à base de expressão de genes descritos acimacom os dados de marcadores convencionais, tais como os marcadores deproteínas do soro (por exemplo, o antígeno carcinoembrionário). Existe umafaixa de tais marcadores, incluindo tais analitos como o CEA. Em tal método,o sangue é periodicamente retirado de um paciente tratado e entãosubmetido a um imunoensaio de enzima para um dos marcadores do sorodescritos acima. Quando a concentração do marcador sugerir o retorno dostumores ou o fracasso da terapia, retira-se uma fonte da amostra receptiva àanálise da expressão do gene. Em que existir uma massa suspeita, umaspirado com agulha fina é retirado e os perfis de expressão do gene dascélulas retiradas da massa são então analisados, conforme descrito acima.Alternativamente, as amostras de tecido podem ser retiradas de áreasadjacentes ao tecido a partir do qual um tumor foi anteriormente removido.Esta abordagem pode ser particularmente útil quando outro teste produzirresultados ambíguos.

Os artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão dos genes, úteis para tratar, diagnosticar, prognosticar, e de outromodo avaliar as doenças. Estas representações dos perfis são reduzidas atéum meio que possa ser automaticamente lido por uma máquina, tal comomeios capazes de serem lidos por computador (magnéticos, ópticos, esimilares). Os artigos podem também incluir instruções para avaliar os perfisde expressão dos genes em tais meios. Por exemplo, os artigos podemcompreender um CD ROM tendo instruções de computador para compararos perfis de expressão dos genes dos portfólios de genes descritos acima.Os artigos podem também ter perfis de expressão de genes registradosdigitalmente neles, de modo que eles possam ser comparados com dadosde expressão de genes de amostras de pacientes. Alternativamente, osperfis podem ser registrados em diferente formato representacional. Umregistro gráfico é tal formato. Algoritmos de conglomerado, tais comoaqueles incorporados no software "DISCOVERY" e "INFER" da Partek, Inc.,mencionados acima, podem melhor auxiliar na visualização de tais dados.

Os diferentes tipos de artigos de fabricação de acordo com ainvenção são os meios ou os ensaios formatados usados para revelar osperfis de expressão dos genes. Estes podem compreender, por exemplo, osmicroarranjos, nos quais os complementos de seqüências ou as sondas sãounidas a uma matriz à qual as seqüências indicativas dos genes de interessecombinam-se, criando um determinante de sua presença capaz de ser lido.Alternativamente, os artigos de acordo com a invenção podem seradaptados nos kits de reagentes para conduzir a hibridização, a amplificação,e a geração de sinais, indicativas do nível de expressão dos genes deinteresse para detectar o câncer colorretal.

Os kits feitos de acordo com a invenção incluem ensaiosformatados para determinar os- perfis de expressão dos genes. Estes- podemincluir todos ou alguns dos materiais necessários para conduzir os ensaios,tais como reagentes e instruções.

Os iniciadores e as sondas úteis na invenção incluem, semlimitação, um ou diversos dos que se seguem:

Laforina forward, cattattcaaggccgagtacagatg; SEQ ID NO: 29Laforina reverse, cacgtacacgatgtgtcccttct; SEQ ID NO: 30Sonda de laforina, caggcggtgtgcctgctgcat; SEQ ID NO: 31RCC1 forward, tttgtggtgcctatttcaccttt; SEQ ID NO: 32RCC1 reverse, cggagttccaagctgatggta; SEQ ID NO: 33Sonda de RCC1, ccacgtgtacggcttcggcctc. SEQ ID NO: 34YWHAH forward, ggcggagcgctacga; SEQ ID NO: 35YWHAH reverse, ttcattcgagagaggttcattcag; SEQ ID NO: 36Sonda de YWHAH, cctccgctatgaaggcggtgã SEQ ID NO: 37β-actina forward, aagccaccccacttctctctaa; SEQ ID NO: 38β-actina reverse, aatgctatcacctcccctgtgt; SEQ ID NO: 39Sonda de β-actina, agaatggcccagtcctctcccaagtc. SEQ ID NO: 40HMBS forward, cctgcccactgtgcttcct; SEQ ID NO: 41HMBS reverse, ggttttcccgcttgcagat; SEQ ID NO: 42Sonda de HMBS, ctggcttcaccatcg. SEQ ID NO: 43GUSB forward, tggttggagagctcatttgga; SEQ ID NO: 44GUSB reverse, actctcgtcggtgactgttcag; SEQ ID NO: 45Sonda de GUSB, ttttgccgatttcatg. SEQ ID NO: 46RPL13A forward, cggaagaagaaacagctcatga; SEQ ID NO: 47RPL13A reverse, cctctgtgtatttgtcaattttcttctc; SEQ ID NO: 48Sonda de RPL13A, cggaaacaggccgagaa. SEQ ID NO: 49

Estes iniciadores e sondas podem incluir aproximadamente 1-5bases tanto 5' quanto 3', com base nas seqüências conhecidas dos genesexpostos. De preferência, os conjuntos de iniciadores e sondas são usadosjuntos para medir a expressão do gene exposto em uma reação PCR.A invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos não-Iimitativos a seguir. Todas as referências citadas neste documento são, pelopresente, incorporadas-aqui por referência.

Exemplos: Os genes analisados de acordo com esta invençãoestão tipicamente relacionados às seqüências de ácidos nucléicos de tamanhonatural que codificam para a produção de uma proteína ou peptídeo. Alguémversado na técnica reconhecerá que a identificação das seqüências detamanho natural não é necessária a partir de um ponto de vista analítico. Ouseja, as porções das seqüências ou ESTs podem ser selecionadas deacordo com princípios bastante conhecidos, para os quais podem serprojetadas sondas para avaliar a expressão do gene para o gene corres-pondente.

Exemplo 1 - Manuseio e LCM da Amostra.

As amostras de tecidos congeladas novas foram coletadas depacientes que tiveram cirurgia para tumores colorretais. As amostras queforam usadas eram de 63 pacientes estagiados com Dukes B de acordo como diagnóstico clínico padrão e a patologia. O resultado clínico dos pacientesera conhecido. Trinta e seis dos pacientes mantiveram-se sem a doença pormais do que 3 anos, enquanto 27 pacientes tiveram recorrência do tumordentro de 3 anos.

Os tecidos foram congelados rapidamente em nitrogênio líquidodentro de 20-30 minutos da coleta, e armazenados a -80°C após isso. Paraa captura a laser, as amostras foram cortadas (6 μηι), e uma secção foimontada sobre uma lâmina de vidro, e a segunda sobre um filme (P.A.L.M.),o qual tinha sido fixado sobre uma lâmina de vidro (Micro Slides Colorfrost,VWR Scientific, Media, PA). A secção montada sobre uma lâmina de vidrofoi depois fixada em acetona gelada, e colorida com Hematoxilina de Mayer(Sigma, St. Louis, MO). Um patologista analisou as amostras para odiagnóstico e o grau. O estágio clínico foi estimado a partir da patologiacirúrgica acompanhante e de relatórios clínicos para verificar a classificaçãode Dukes. A secção montada sobre o filme foi depois fixada por cincominutos em etanol a 100%, contracolorida por 1 minuto em eosina/etanol a100% (100 μς de Eosina em 100 ml de etanol desidratado), rapidamenteembebida uma vez em etanol a 100% para remover o corante livre, e secadaao ar-por-40 minutos.

Antes do uso na LCM1 a membrana (LPC-MEMBRANE PENFOIL 1,35 μηι N- 8100, P.A.L.M. GmbH Mikrolaser Technologie, Bernried,Alemanha) e as lâminas foram pré-tratadas para eliminar as RNases, e paraaumentar a ligação da amostra de tecido ao filme. Resumidamente, aslâminas foram lavadas em DEP H2O, e o filme foi lavado em RNase AWAY(Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA) e enxaguado em DEP H2O.

Após unir o filme às lâminas de vidro, as lâminas foram cozidas a +120°Cpor 8 horas, tratadas com TI-SAD (Diagnostic Products Corporation, LosAngeles, CA, 1:50 em DEP H2O1 filtrado através de algodão), e incubadas a+37°C por 30 minutos. Imediatamente antes do uso, uma alíquota de 10 μΙde solução inibidora de RNase (Inibidor RNasina 2500υ=33υ/μΙ de N211A,Promega GmbH, Mannheim, Alemanha, 0,5 μΙ em 400 μΙ de solução decongelamento, contendo NaCI a 0,15 M, Tris a 10 mM pH 8,0, ditiotreitol a0,25 mmol) foi espalhada sobre o filme, em que a amostra de tecido era paraser montada.

As secções de tecido montadas sobre o filme foram usadas paraa LCM. Aproximadamente 2000 células epiteliais/amostra foram capturadasusando a tecnologia de Robô-Microfeixe PALM (P.A.L.M. MikrolaserTechnologie, Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY), acoplada ao microscópioZeiss Axiovert 135 (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemanha). O estromacircundante na mucosa normal, e os componentes estromais intermediáriosocasionais nas amostras de câncer, foram incluídos. As células capturadasforam colocadas em tubos em etanol a 100% e conservadas a -80°C .

Exemplo 2 - Extração e Amplificacão do RNA

A coluna Zymo-Spin (Zymo Research, Orange, CA 92867) foiusada para extrair o RNA total das amostras capturadas por LCM. Cerca de2 ng de RNA total foram suspensos novamente em 10 μΙ de água e 2rodadas da amplificação baseada em T7 RNA polimerase foram efetuadaspara produzir cerca de 50 μg de RNA amplificado.Exemplo 3 - Hibridizacão e Quantificação do Microarranio de DNA.

Um conjunto de microarranjos de DNA consistindo emaprex-imadamente-23-.Θ0Ο clones-de- DNA humanos foi usado para testar asamostras por uso do fragmento U133a humano obtido e comercialmentedisponível da Affymetrix1 Inc. O RNA total obtido e preparado conformeresumido acima e aplicado aos fragmentos e analisado pelo BioAnaIisadorAgilent de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as 63 amostrasforam aprovadas nos padrões de controle de qualidade e os dados foramusados para a seleção do marcador.

O dado da intensidade do fragmento foi analisado usando osoftware MAS Versão 5.0, comercialmente disponível da Affymetrix, Inc.("MAS 5.0"). Uma análise não supervisionada foi usada para identificar osdois genes que distinguem os pacientes que teriam recorrência daquelesque não teriam, como a seguir.

O dado da intensidade do fragmento obtido conforme descrito foia entrada de informações para o software de conglomerado não supervisi-onado, comercialmente disponível como software PARTEK versão 5.1. Estealgoritmo de conglomerado não supervisionado identificou um conjunto de20 pacientes com uma alta freqüência de recorrência (13 recorrentes e 7sobreviventes). A partir dos 23.000 genes originais, a análise de testeselecionou 276 genes que significativamente expressavam de modo diferen-cial nestes pacientes. A partir deste conjunto, dois genes foram selecionadosque melhor distinguem os pacientes com recorrência daqueles que não têmrecorrência: Transportador associado ao peptídeo intestinal humano (SEQID NO: 3) e Proteína de ligação ao ácido graxo de Homo sapiens 1 (SEQ IDNO: 1). Estes dois genes são infra-regulados (na realidade, eles sãodesativados ou não expressos) nos pacientes com recorrência a partir desteconjunto de pacientes.

A análise supervisionada foi então conduzida para diferenciaradicionalmente os pacientes com recorrência daqueles que não tinhamrecorrência nos 43 pacientes restantes. Este conjunto de dados dospacientes foi então dividido nos seguintes conjuntos: 27 pacientes foramdesignados como o conjunto de treinamento e 16 pacientes foram designa-dos como o conjunto de teste. Isto assegurou que o mesmo dado não fosse usado tanto para identificar os marcadores quanto para então validar a suautilidade.

Um teste t de variância desigual foi efetuado sobre o conjunto detreinamento. A partir de uma lista de 28 genes que têm valores de ρ corri-gidos significativos, o MHC II-DR-B foi escolhido. Estes genes são infra-regulados nos recorrentes. O MHC II-DR-B (SEQ ID NO: 2) também tinha omenor valor de p.

Em uma rodada adicional de análise supervisionada, um proce-dimento de seleção de variável para a análise discriminante linear foiimplementado, usando o software Partek Versão 5.0 descrito acima, paraseparar os recorrentes dos sobreviventes no conjunto de treinamento. Ométodo de busca foi a seleção forward. A variável selecionada com o menorerro posterior foi a proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulina (SEQ IDNO: 4). Um modelo de risco proporcional de Cox (usando o sofware "S Plus"da lnsightful, INc.) foi então usado para a seleção do gene, para confirmar aseleção do gene identificada acima para o tempo de sobrevivência. Em cadaciclo de 27 ciclos totais, cada um dos 27 pacientes no conjunto detreinamento agüentou, os 26 pacientes restantes foram usados na regressãodo modelo de Cox de apenas uma variável para avaliar a resistência daassociação da expressão do gene com o tempo de sobrevivência dopaciente. A resistência de tal associação foi avaliada pela estimativa doparâmetro padronizado estimado correspondente e pelo valor de P retornadoda regressão do modelo de Cox. O valor de P de 0,01 foi usado como olimiar para selecionar os genes de topo a partir de cada ciclo da seleção degenes por exclusão de um. Os genes de topo selecionados a partir de cadaciclo foram então comparados para selecionar aqueles genes que sedestacam em pelo menos 26 vezes no total de 27 ciclos de seleção degenes por exclusão de um. Um total de 70 genes foi selecionado e tanto oMHC II-DR-B quanto a proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulinaestavam entre eles (Novamente, mostrando infra regulação).Construção de um indicador de múltiplos genes: Dois genes,MHC II-DR-B e proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulina, foram-usados-para-produzir um indicador usando a análise discriminante linear. Oescore de votação foi definido como a probabilidade posterior de recorrência.

Se o escore do paciente fosse maior do que 0,5, o paciente era classificadocomo um recorrente. Se o escore do paciente fosse menor do que 0,5, opaciente era classificado como um sobrevivente. O indicador foi testado noconjunto de treinamento.

Validação cruzada e avaliação do indicador: O desempenho doindicador deve ser determinado sobre uma série de dados independentes,porque a maior parte dos métodos de classificação funciona bem sobre osexemplos que foram usados em seu estabelecimento. O conjunto de testede 16 pacientes foi usado para avaliar a precisão do prognóstico. O cortepara a classificação foi determinado usando uma curva de ROC. Com ocorte selecionado, os números do prognóstico correto para os pacientes comrecorrência e de sobrevivência no conjunto de teste foram determinados.

Prognóstico global: O perfil de expressão dos genes dospacientes com câncer do cólon Dukes B resultou na identificação de 4 genesque têm expressão diferencial (infra regulação ou desativados) nestespacientes. Estes genes são a SEQ ID NO: 1, a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,e a SEQ ID NO: 4. Trinta e seis dos pacientes permaneceram sem a doençapor mais do que 3 anos, enquanto 27 pacientes tiveram recorrência do tumordentro de 3 anos. Usando o portfólio de marcadores de 3 genes de SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 4, 22 dos 27 pacientes com recorrênciae 27 dos 36 pacientes sem a doença são identificados corretamente. Esteresultado representa uma sensibilidade de 82% e uma especificidade de75%. O valor prognóstico positivo é 71% e o valor prognóstico negativo é 84%.

Exemplo 4: Amostragem Adicional

As amostras de tumor congeladas de 74 pacientes com câncerdo cólon Dukes B foram então estudadas. O tumor primário e o tecido docólon não neoplástico adjacente foram coletados na hora da cirurgia. Ahistopatologia de cada amostra foi revista para confirmar o diagnóstico e oenvolvimento uniforme com o tumor. As regiões escolhidas para análise con-tinham-uma celularidade do tumor maior-do-que 50%, sem-nenhuma histolo-gia mista. A informação uniforme de acompanhamento estava tambémdisponível.

Exemplo 5: Análise da Expressão do Gene

O RNA total foi extraído das amostras do Exemplo 4 de acordocom o método descrito nos Exemplos 1-3. Os arranjos foram varridosusando protocolos e digitalizadores padrões da Affymetrix. Para a análisesubseqüente, cada conjunto de sondas foi considerado como um geneseparado. Os valores da expressão para cada gene foram calculadosusando o software de análise Affymetrix GeneChip MAS 5.0. Todos osdados usados para a análise subseqüente passaram nos critérios decontrole de qualidade.

Métodos Estatísticos

Os dados da expressão do gene foram primeiramente subme-tidos a um filtro de variação que excluía os genes chamados "ausentes" emtodas as amostras. Dos 22.000 genes considerados, 17.616 foram aceitospor este filtro e foram usados para o conglomerado. Antes do conglomeradohierárquico, cada gene foi dividido por seu nível de expressão médio nospacientes. Os genes que mostraram alterações de mais do que 4 vezessobre o nível de expressão médio em pelo menos 10% dos pacientes foramincluídos no conglomerado. Para identificar os subgrupos de pacientes comperfis genéticos distintos, o conglomerado hierárquico de ligação médio e oconglomerado médio k foram efetuados usando o software GeneSpring 5.0(San Jose, CA) e Partek 5.1 (St. Louis, MO), respectivamente. Os testes tcom as correções de Bonferroni foram usados para identificar os genes quetêm níveis de expressão diferentes entre 2 subgrupos de pacientesimplicados pelo resultado do conglomerado. Um valor de P corrigido deBonferroni de 0,01 foi escolhido como o limiar para a seleção do gene. Ospacientes em cada conglomerado que tinham um perfil de expressão distintoforam examinados adicionalmente com a informação do resultado.Para identificar os marcadores de genes que podem distinguir ospacientes com recorrência e os sem doença, cada subgrupo dos pacientesfoi—analisado -separadamente, conforme descrito-adicionalmente - abaixo.Todas as análises estatísticas foram efetuadas usando o software S-Plus(Insightful, VA).

Características dos Pacientes e dos Tumores

As características clínicas e patológicas dos pacientes e de seustumores são resumidas na Tabela 1. Os pacientes tiveram informação sobrea idade, o sexo, o estágio de TNM, o grau, tamanho do tumor e a localizaçãodo tumor. Setenta e três dos 74 pacientes tiveram dados sobre o número deIinfonodos que foram examinados, e 72 dos 74 pacientes tiveram informaçãosobre o tamanho estimado do tumor. As características dos pacientes e dostumores não diferiram significativamente entre os pacientes com recorrênciae os sem recorrência. Nenhum dos pacientes recebeu tratamento pós-operativo. Um mínimo de 3 anos de dados de acompanhamento estavadisponível para todos os pacientes no estudo.

Subgrupos de Pacientes Identificados por Perfis Genéticos

A análise de conglomerado hierárquico não supervisionadoresultou em um conglomerado dos 74 pacientes na base das similaridadesde seus perfis de expressão medidos sobre 17.000 genes significativos. Doissubgrupos de pacientes foram identificados que têm mais de 600 genesdiferencialmente expressos entre eles (p < 0,00001). O subgrupo maior e osubgrupo menor continham 54 e 20 pacientes, respectivamente. Nosubgrupo maior, dos 54 pacientes, somente 18 pacientes (33%) desen-volveram recorrência do tumor dentro de 3 anos, enquanto no subgrupomenor, dos 20 pacientes, 13 pacientes (65%) tiveram doenças progressivas.A análise de qui-quadrado deu um valor de ρ de 0,028.

Dois conglomerados de genes dominantes que tiveram expressãodiferencial drástica entre os dois tipos de tumores foram selecionados eexaminados. O primeiro conglomerado de genes tinha um conjunto de genesinfra-regulados no subgrupo menor dos 20 pacientes, representado pelacaderina 17 específica para fígado-intestino, pela proteína 1 de ligação aoácido graxo, pelos fatores de transcrição de homeo caixa do tipo caudalCDX1 e CDX2, pela mucina e pela proteína similar à caderina MUCDHL. Osegundo conglomerado-de genes é representado por um conjunto de genessupra-regulados no subgrupo menor, incluindo a cinase SNK induzível porsoro, a anexina A1, a proteína associada ao RAG de células B, a calbindina2, e o antígeno do tumor L6. O subgrupo menor dos 20 pacientes assimrepresenta menos tumores diferenciados na base de seus perfis genéticos.

Marca de Gene e seu Valor Prognóstico

Para identificar os marcadores de genes que podem distinguir ospacientes com recorrência e os sem doença, cada subgrupo dos pacientesfoi analisado separadamente. Os pacientes em cada subgrupo foramprimeiramente divididos em um conjunto de treinamento e um conjunto deteste, com um número aproximadamente igual de pacientes. O conjunto detreinamento foi usado para selecionar os marcadores de gene e construiruma marca de prognóstico. O conjunto de teste foi usado para validaçãoindependente. No subgrupo maior dos 54 tumores, 36 pacientes permane-ceram sem a doença por pelo menos 3 anos após o seu diagnóstico inicial e18 pacientes desenvolveram recorrência do tumor com 3 anos. Os 54pacientes foram divididos em dois conjuntos. O conjunto de treinamentocontinha 21 pacientes sem doença e 6 pacientes com recorrência. Nosubgrupo menor dos 20 tumores, 7 pacientes permaneceram sem a doençapor pelo menos 3 anos e 13 pacientes desenvolveram a recorrência dotumor com 3 anos. Os 20 pacientes foram divididos em dois conjuntos. Oconjunto de treinamento continha 4 pacientes sem doença e 7 pacientescom recorrência. Para identificar uma marca de gene que distinga o conjuntode prognóstico bom do conjunto de prognóstico insatisfatório, um método declassificação supervisionado foi usado em cada um dos conjuntos detreinamento. A regressão de riscos proporcionais de Cox de apenas umavariável foi usada para identificar os genes cujos níveis de expressãoestejam correlacionados com o tempo de sobrevivência dos pacientes. Osgenes foram selecionados usando os valores de ρ menores do que 0,02,como os critérios de seleção. A seguir, os testes t foram efetuados nosgenes selecionados para determinar o significado da expressão diferencialentre os pacientes com recorrência e os sem a doença (P < 0,01). Paraevitar a -seleção de genes que se enquadram demais no-conjunto detreinamento, a reamostragem de 100 tempos foi efetuada com o teste t parabuscar genes que tivessem valores de ρ significativos em mais do que 80%dos testes de reamostragem. Sete genes (Tabela 2) foram selecionados apartir do conjunto de treinamento de 27 pacientes e 15 genes (Tabela 3)foram selecionados a partir do conjunto de treinamento de 11 pacientes.Considerando-se os 22 genes e a caderina 17 juntos, um modelo de Coxpara prognosticar a recorrência no paciente foi construído usando o softwareS-Plus. A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou uma claradiferença na probabilidade que os pacientes permaneceriam sem a doençaentre o conjunto prognosticado com bom prognóstico e o conjuntoprognosticado com prognóstico insatisfatório (figura 3).

Diversos genes estão relacionados à proliferação das células ouà progressão do tumor. Por exemplo, a proteína de ativação de 3 monoxige-nase triptofano 5-monoxigenase tirosina (YWHAH) pertence à família 14-3-3de proteínas que é responsável pelo controle do ciclo das células G2 emresposta ao dano do DNA nas células humanas. O RCC1 é um outro genedo ciclocelular envolvido na regulação do início da condensação de cro-mossomo. O BTEB2 é um fator de transcrição de dedo de zinco que temestado implicado como um gene sensível ao wnt-1 independente de beta-catenina. Alguns genes estão provavelmente envolvidos nas respostasimunes locais. A proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulina é umreceptor inibitório comum para as moléculas de MHC I. Um membro único daproteína de capeamento da família de gelsolina/vilina, CAPG, é principal-mente expresso nos macrófagos. A LAT é uma proteína altamentefosforilada de tirosina que liga o receptor de células T à ativação celular.Assim, ambos os genes expressos pelas células de tumor e pelas célulasimunes podem ser usados como fatores de prognóstico para a recorrênciano paciente.

Para validar a marca de prognóstico de 23 genes, os pacientesnos dois conjuntos de teste, que incluíam 27 pacientes do subgrupo maior e9 pacientes do subgrupo menor, foram combinados e o resultado foiprognosticado para os 36 paeientes4ndependentes nos conjuntos-de .teste.Este conjunto de teste consistia em 18 pacientes que desenvolveramrecorrências do tumor dentro de 3 anos e 18 pacientes que permaneceramsem a doença por mais do que 3 anos. O prognóstico resultou em 13classificações corretas de recorrência e 15 classificações corretas de semdoença. A precisão global de desempenho foi 78% (28 de 36), com umasensibilidade de 72% (13 de 18) e uma especificidade de 83% (15 de 18).Este desempenho indica que os pacientes Dukes B que têm um valor abaixodo limiar da marca de prognóstico têm uma razão de chances de 13 vezesde (Cl de 95%: 2,6, 65; ρ = 0,003) desenvolver uma recorrência do tumordentro de 3 anos, comparados com aqueles que têm um valor acima dolimiar da marca de prognóstico. Além disso, a análise de sobrevivência deKaplan-Meier mostrou uma diferença significativa na probabilidade que ospacientes permaneceriam sem a doença entre o conjunto prognosticado combom prognóstico e o conjunto prognosticado com prognóstico insatisfatório(P < 0,0001). Em uma regressão de riscos proporcionais de Cox multivariada,a razão de riscos estimados para a recorrência do tumor foi 0,41 (intervalode confiança de 95%, 0,24 a 0,71; P = 0,001), indicando que o conjunto de23 genes representa uma marca de prognóstico e está inversamenteassociado com um risco maior de recorrência do tumor. Usando o portfóliode sete genes (Tabela 2), uma sensibilidade de 83% e uma especificidadede 80% foram obtidas (com base em um conjunto de amostra de 12recorrentes e 15 sobreviventes). Usando o portfólio de 15 genes (Tabela 3),uma sensibilidade de 50% e uma especificidade de 100% foram obtidas(com base nos conjuntos de amostra de 6 recorrentes e três sobreviventes).As Figuras 1 e 2 são descrições gráficas das análises de Kaplan-Meier paraos portfólios de sete e quinze genes, respectivamente.

Além disso, conforme estes resultados demonstram, oprognóstico pode ser derivado dos perfis de expressão dos genes do tumorprimário.Tabela 1. Características Clínicas e Patológicas dos Pacientes e de Seus Tumores

<table>table see original document page 31</column></row><table>

* Os valores de P para a Idade, o Número de Iinfonodos e o Teor de tumor sãoobtidos pelos testes t; os valores de P para os outros são obtidos pelos testes D2.Tabela 2: Listagem dos 7 Genes

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tabela 3: Listagem dos 15 Genes

<table>table see original document page 32</column></row><table>Tabela 4. Vinte e três genes formam a marca de prognóstico.

SEQ ID NO: valor de P

(Cox) Descrição do Gene

7 0,0011 proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulina

8 proteína de ativação de tirosina 3-monoxigenase0,0016 triptofano 5-monoxigenase

9 0,0024 gene do ciclocelular RCC1

10 0,0027 fator de transcrição BTEB2

11 proteína de capeamento (filamento de actina), similar à0,0045 gelsolina (CAPG)

12 0,0012 Iigador para a ativação das células T (LAT)

13 0,0046 Doença de Lafora (Iaforina)

14 proteína de interação com a proteína de retardo mental X0,0110 frágil nuclear 1 (NUFIP1)

15 similar à disintegrina e metaloprotease (tipo reprolisina)0,0126 com motivo de trombospondina tipo 1,12 (ADAMTS12)

16 0,0126 antígeno G 4 (GAGE4)

17 receptor similar à mucina contendo módulo similar ao0,0130 EGFEMR3

18 0,0131 alanina:glioxilato aminotransferase

19 0,0131 peptidil arginina deiminase, tipo V (PAD)

20 canal retificador internamente de potássio, subfamília K,0,0136 membro 4 (KCNK4)

21 0,0139 produto de gene KlAA0125 (KIAA0125)

22 0,0142 proteína hipotética FLJ20712 (FLJ20712)

23 0,0145 apolipoproteína C-I (APOC1)

24 0,0146 Consenso inclui gb:AL545035

25 0,0149 proteína hipotética FLJ12455 (FLJ12455)

26 0,0150 Consenso inclui gb:AL133089.1Exemplo 6

Neste estudo, foi agora completada uma avaliação independentedesta marca de prognóstico em uma série independente de 123 pacientescom câncer do cólon Dukes B obtidos de duas fontes. Além disso, foidesenvolvido um ensaio de RTQ-PCR para testar a marca de gene deprognóstico em amostras FPE. Os dados proporcionam validação com altaconfiança de uma marca de gene de prognóstico pré-especificada para ospacientes com câncer do cólon Dukes B.

Propósito: A taxa de sobrevivência de 5 anos para os pacientescom câncer do cólon Dukes B é aproximadamente 75%. Nessas mediçõesde genoma amplo anterior da expressão do gene, foi identificada uma marcade 23 genes que subclassifica os pacientes com Dukes B de acordo com oresultado clínico e pode proporcionar um melhor indicador do risco individualpara estes pacientes. Wang, e outros, (2005). O presente estudo valida estamarca de gene em um conjunto de pacientes independente e mais diverso, edesenvolve esta marca de prognóstico para um teste clinicamente viávelusando tecidos de tumor incrustados em parafina fixa (FPE).

Pacientes e Métodos: Usando o GeneChip U133a da Affymetrix,foi analisada a expressão dos 23 genes no RNA total de amostrascongeladas de tumor a partir de 123 pacientes Dukes B que não receberamtratamento sistêmico adjuvante. Além disso, foi desenvolvido um ensaio de(RTQ)-PCR quantitativo em tempo real para esta marca de gene paraefetuar o teste com amostras FPE clínicas padrões.

Resultados: No conjunto de validação independente de 123pacientes, a marca de 23 genes provou ser altamente informativa naidentificação dos pacientes que desenvolveriam metástase remota (razão derisco, HR 2,56; intervalo de confiança de 95% Cl, 1,01 - 6,48), mesmoquando corrigida para os fatores de prognósticos tradicionais na análisemultivariada (HR1 2,73; Cl de 95%, 0,97 - 7,73). O ensaio de RTQ-PCRdesenvolvido para esta marca de gene foi também validado em um conjuntoindependente de 110 pacientes com tecido FPE disponível e era um fator deprognóstico forte para o desenvolvimento de recorrência remota (HR, 6,55;Cl de 95%, 2,89 - 14,8) em ambas as análises de apenas uma variável emultivariada (HR, 13,9; Cl de 95%, 5,22 - 37,2).

Conclusão: Esses resultados validam a marca de gene deprognóstico predefinida para os pacientes com câncer do cólon Dukes B emuma população independente e mostram a viabilidade de testar a marca degene usando RTQ-PCR em amostras FPE padrões. A capacidade de talteste de identificar os pacientes com câncer do cólon que têm um resultadodesfavorável demonstra uma relevância clínica para auxiliar a identificar ospacientes em alto risco por recorrência que requeiram opções terapêuticasmais agressivas.

PACIENTES e MÉTODOS

Amostras dos Pacientes

As amostras congeladas de tumor de 123 pacientes com câncerdo cólon Dukes B e as amostras de tumor FPE de 110 destes pacientesforam obtidas da Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH), da ArosApplied Biotechnology, LLC (Aarhus, Dinamarca) e da Proteogenix, LLC(Culver City, CA) de acordo com os protocolos aprovados do InstitutionalReview Board em locais individuais. Cinqüenta e quatro pacientes eramcompatíveis com as amostras congeladas e FPE. As amostras de tumorprimário arquivadas foram coletadas na hora da cirurgia. A histopatologia decada amostra foi revista para confirmar o diagnóstico e o teor de tumor. Apopulação total de células era composta de pelo menos 70% de células detumor.

Foram requeridos pelo menos 3 anos de acompanhamento,exceto para os pacientes que desenvolveram recorrência remota antes destetempo. Os pacientes foram tratados por cirurgia somente. A inspeção dospacientes após a cirurgia foi realizada de acordo com a prática geral parapacientes com câncer do cólon, incluindo exame físico, contagenssangüíneas, testes da função do fígado, CEA no soro, e colonoscopia paraos pacientes. Os pacientes selecionados tiveram varredura por CTabdominal e raios X do tórax. Se a recorrência do tumor fosse suspeita, opaciente sofria preparação intensiva, incluindo varredura por CT abdominal/pélvica, raio X do tórax, colonoscopia e biopsia, quando aplicável. O tempoaté a recorrência ou o tempo sem a doença foi definido como o período detempo a partir da data da cirurgia até a data confirmada da recorrência dotumor, para os pacientes com recorrência, e a partir da data da cirurgia até adata do último acompanhamento, para os pacientes sem a doença.

Análise do Microarranio

Todos os tecidos de tumor foram processados para o isolamentodo RNA conforme descrito nesse estudo inicial. Exemplos acima e Wang eoutros (2005). Os alvos biotinilados foram preparados usando métodospublicados (Affymetrix, Santa Clara, CA) (Lipshutz e outros (1999)) e hibridi-zados com os GeneChips U 133a da Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Os arranjos foram varridos usando o protocolo padrão da Affymetrix. Cadaconjunto de sondas foi considerado um gene separado. Os valores daexpressão para cada gene foram calculados usando o software de análiseGeneChip® MAS 5.0 da Affymetrix e de acordo com o método de análisedescrito anteriormente. Wang e outros (2005).

Isolamento do RNA de amostras FPE

O tecido FPE estava disponível para 110 pacientes. As amostrasFPE eram tecidos FPE fixados em formalina (n = 45) ou fixados emHollandes (n = 65). O isolamento do RNA das amostras de tecidos FPE foirealizado de acordo com um protocolo modificado, usando o Kit de Alto Teorde RNA Puro em Parafina (Roche Applied Sciences, Indianápolis, IN). Osblocos de tecidos FPE foram seccionados dependendo do tamanho dosblocos (6-8 mm = 6 X 10 μηι, 8->10 mm = 3 X 10 μηη). As secções foramdesparafinizadas conforme descrito no manual do fabricante. O precipitadode tecido foi secado em forno a 55°C , por 10 minutos, e suspensonovamente em 100 μL de tampão de Iise de tecido, 16 μL de SDS a 10% e80 μL de Proteinase Κ. A amostra foi redemoinhada e incubada em umtermomisturador ajustado a 400 rpm, por 3 horas, a 55°C. As etapassubseqüentes de processamento da amostra foram efetuadas de acordocom o manuaUdo Kit. A amostra de RNA-foi quantificada por leituras em DOde 260/280 usando espectrofotômetro e diluída até uma concentração finalde 50 ng/μl-. As amostras isoladas de RNA foram armazenadas em águasem RNase a -80°C até o uso.

Análise por RTQ-PCR

Sete genes da marca de 23 genes foram avaliados usando umensaio de RTQ-PCR multiplex de uma etapa com as amostras de RNAisoladas dos tecidos FPE. Para minimizar a variabilidade da reação de RTQ-PCR1 quatro genes de controle de manutenção, incluindo β-actina, HMBS,GUSB, e RPL13A, foram usados para normalizar a quantidade de produtode RNA. Para impedir qualquer DNA contaminante nas amostras daamplificação, os iniciadores ou as sondas de PCR para o ensaio de RTQ-PCR foram projetados para alcançar um intron, de modo que o ensaio nãoamplificasse nenhum DNA genômico residual. Cem nanogramas de RNAtotal foram usados para a reação de RTQ-PCR em uma etapa. A transcriçãoreversa foi efetuada usando 40 χ uma mistura de Multiscribe e inibidor deRNase contida no kit de reagente de Mistura Máster para PCR de uma etapaTaqMan® (Applied Biosystems, Fresno1 CA). O cDNA foi então submetido a2 χ Mistura Máster sem a uracil-N-glicosilase (UNG). A amplificação por PCRfoi efetuada sobre o sistema de detecção de seqüência ABI 7900HT (AppliedBiosystems, Frenso, CA) usando o formato de bloco de 384 cavidades comvolume de reação de 10 μΙ_. As concentrações dos iniciadores e das sondaseram 4 e 2,5 μι-nols/L, respectivamente.

A mistura de reação foi incubada a 48°C por 30 minutos para atranscrição reversa, seguida por uma etapa de ativação com Amplitaq® a95°C por 10 minutos e então 40 ciclos de 95°C por 15 segundos para adesnaturação e de 60°C por 1 minuto para o anelamento e a extensão. Umacurva padrão foi gerada a partir de uma faixa de 100 pg a 100 ng dosmateriais de partida, e quando o valor de R2 era >0,99, os valores de limiardo ciclo (Ct) foram aceitos. Ademais, todos os iniciadores e sondas foramotimizados para a mesma eficiência de amplificação de acordo com oprotocolo do fabricante. Foi usado o Ensaio da Applied Biosystems a pedidopara 4 dos 7 genes (BTEB2, LAT1CAPG, e Proteína de transcrito 5 similar àimunoglobulina). As seqüências dos iniciadores e das sondas para os outros3 genes e os 4 genes de controle de manutenção foram como se segue,cada uma escrita na direção 5' para 3':

Laforina forward, CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG; SEQ ID NO: 29Laforina reverse, CACGTACACGATGTGTCCCTTCT; SEQ ID NO: 30Sonda de Laforina, CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT. SEQ ID NO: 31RCC1 forward, TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT; SEQ ID NO: 32RCC1 reverse, CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA; SEQ ID NO: 33Sonda de RCC1, CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC. SEQ ID NO: 34YWHAH forward, GGCGGAGCGCTACGA; SEQ ID NO: 35YWHAH reverse, TTCATTCGAGAGAGGTTCATTCAG; SEQ ID NO: 36Sonda de YWHAH, CCTCCGCTATGAAGGCGGTGÃ SEQ ID NO: 37β-actina forward, AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA; SEQ ID NO: 38β-actina reverse, AATGCTATCACCTCCCCTGTGT; SEQ ID NO: 39Sonda de β-actina, AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC. SEQ ID NO: 40HMBS forward, CCTGCCCACTGTGCTTCCT; SEQ ID NO: 41HMBS reverse, GGTTTTCCCGCTTGCAGAT; SEQ ID NO: 42Sonda de HMBS, CTGGCTTCACCATCG. SEQ ID NO: 43GUSB forward, TGGTTGGAGAGCTCATTTGGA; SEQ ID NO: 44GUSB reverse, ACTCTCGTCGGTGACTGTTCAG; SEQ ID NO: 45Sonda de GUSB, TTTTGCCGATTTCATG. SEQ ID NO: 46RPL13A forward, CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA; SEQ ID NO: 47RPL13A reverse, CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC; SEQ ID NO: 48Sonda de RPL13A, CGGAAACAGGCCGAGAA. SEQ ID NO: 49

Para cada amostra, calculou-se a ACt = Ct (gene-alvo) - Ct(média de quatro genes de controle). A normalização de ACt tem sidoamplamente usada no ensaio de RTQ-PCR clínico.

Métodos Estatísticos

A variabilidade dos dados resultante de diferentes protocolospara o manuseio da amostra em instituições clínicas individuais foiminimizada usando a análise da variância (ANOVA) sobre os dados deexpressão dos ,genes. A medição da expressão-do gene Caderina 17 noarranjo foi usada para determinar a designação do paciente nos subgrupos,conforme descrito no estudo anterior. Exemplos acima e Wang e outros(2005). Os pacientes com níveis detectáveis de expressão da Caderina 17foram classificados como subgrupo I e o seu resultado foi prognosticadousando o subgrupo de 7 genes da marca de 23 genes. Os pacientes comníveis não detectáveis de expressão da Caderina 17 foram classificadoscomo subgrupo Il e o seu resultado foi prognosticado usando o subgrupo de 15genes da marca de 23 genes. O escore de recorrência foi calculado paracada paciente e usado para classificar o paciente em conjuntos de alto oubaixo risco para desenvolver metástase remota dentro de 3 anos. Ospacientes com um escore de recorrência >0 foram classificados como altorisco e os pacientes com um escore de recorrência <0 foram chamadoscomo baixo risco. O cálculo do escore de recorrência foi como se segue:

Escore de Risco de Recorrência =

<formula>formula see original document page 39</formula>

em que

<formula>formula see original document page 39</formula>

AeB são constantes

Wi é o coeficiente de regressão de Cox padronizado

Xi é o valor da expressão na escala log2

Os gráficos de sobrevivência de Kaplan-Meier (Kaplan e outros(1958)) e os testes por Iog de classificação foram usados para avaliar adiferença dos conjuntos de alto e baixo riscos prognosticados. Asensibilidade foi definida como a porcentagem dos pacientes com metástaseremota dentro de 3 anos que foram prognosticados corretamente pela marcade gene, e a especificidade foi definida como a porcentagem dos pacientesisentos de recorrência distante por pelo menos 3 anos que foramprognosticados como estando isentos de recorrência pela marca de gene. A~razão de chances (OR) foi calculada como a razão de chances de metástaseremota entre os pacientes com recorrência prognosticados e os pacientessem recorrência. As análises de apenas uma variável e multivariada usandoa regressão de risco proporcional de Cox foram efetuadas sobre osparâmetros clínicos individuais dos pacientes e a combinação dosparâmetros clínicos e a marca de gene, incluindo a idade, o sexo, o estágioΤ, o grau e o tamanho do tumor. A HR e o seu Cl de 95% foram derivadosdestes resultados. Todas as análises estatísticas foram efetuadas usando osoftware S-PIus® 61 (lnsightful, Fairfax Station, VA).

RESULTADOS

Características dos Pacientes e dos Tumores

As características clínicas e patológicas dos pacientes e de seustumores são resumidas na Tabela 5 e na Tabela 6. Todos os pacientetiveram informação sobre a idade, o sexo, o estágio de TNM, o grau, otamanho do tumor e a posição do tumor. As características dos pacientes edos tumores não diferiram significativamente entre os pacientes comrecorrência e sem recorrência. Os pacientes foram tratados por cirurgiasomente e nenhum dos pacientes recebeu tratamento neo-adjuvante ouadjuvante. Um mínimo de 3 anos de dados de acompanhamento estavadisponível para todos os pacientes no estudo, com a exceção daqueles comrecorrência < 3 anos.Tabela 5 Características dos pacientes e dos tumores (estudo em tecidos detumores congelados)

<table>table see original document page 41</column></row><table>Tabela 6 Características dos pacientes e dos tumores (estudo FPE)

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Análise da Marca de Gene nas Amostras Congeladas Novas

A análise de sobrevivência foi efetuada como uma função damarca de 23 genes. Primeiro, a curva de ROC foi avaliada (figura 4). A áreasob a curva (AUC) foi usada para avaliar o desempenho de um indicador. Oindicador de 23 genes deu um valor de AUC de 0,66. Usando o ponto dedefinição de 3 anos, o escore de recorrência calculado a partir deste métodoprognosticou corretamente 8 das 13 recorrências (62% de sensibilidade) queocorreram dentro de 3 anos e 74 das 108 não recorrências (69% deespecificidade). Embora a freqüência da recorrência do tumor seja somente11% neste conjunto dos 123 pacientes, a análise de Kaplan-Meier produziucurvas de sobrevivência para os conjuntos de pacientes e o teste do Iog declassificação mostrou uma diferença significativa no tempo até a recorrênciaentre o conjunto prognosticado com bom prognóstico e o conjunto prognos-ticado com prognóstico insatisfatório (P = 0,04) (figura 4). Nas análises deapenas uma variável e multivariada dos 123 pacientes, a marca de 23 genesprovou ser altamente informativa na identificação de pacientes que desen-volveriam metástase remota (razão de risco, HR 2,56; intervalo de confiança de95% Cl, 1,01 - 6,48), mesmo quando corrigida para os fatores de prognósticostradicionais na análise multivariada (HR, 2,73; Cl de 95%, 0,97 - 7,73).

No conjunto de amostras dos pacientes de nosso estudo inicial(Wang e outros (2005)), foram detectados 2 subgrupos de tumores represen-tando tumores bem diferenciados e fracamente diferenciados, respectiva-mente. A expressão do gene de Caderina 17 foi usada para estratificar ostumores Dukes B nos dois subgrupos e a marca de gene de prognóstico foiprojetada para incluir classificadores para o subgrupo I (7 genes) e osubgrupo II (15 genes). No presente estudo de validação, foi examinado umconjunto de amostras independentes de 123 pacientes Dukes B a partir de 2fontes e verificado que o subgrupo II somente era responsável por uma partemuito pequena de uma formação típica de tumores Dukes B (2%). Portanto,foi simplificada a marca de gene de prognóstico removendo os 15 genes queforam selecionados para o subgrupo II no ensaio de RTQ-PCR subseqüente.

O conjunto de dados do microarranjo tinha sido submetido aobanco de dados NCBI/Genbank GEO (entrada da série pendendo).

Análise da Marca de Gene nas Amostras FPE

O ensaio de RTQ-PCR foi efetuado usando os 7 genes queforam selecionados para os pacientes do subgrupo I, conforme acimamencionado. Estes 7 genes devem ser capazes de classificar os resultadosde mais do que 95% dos pacientes em uma população representativa. Aanálise de sobrevivência foi efetuada. Primeiro, a curva de ROC foi avaliada(figura 5). O parâmetro que foi usado para avaliar o desempenho de umindicador foi a área sob a curva (AUC). O indicador de 7 genes deu um valorde AUC de 0,76. Usando o ponto de definição de 3 anos, o escore derecorrência calculado a partir deste método prognosticou corretamente 11das 17 recorrências (65% de sensibilidade) que ocorreram dentro de 3 anose. 78 das 92 não recorrências (85% de especificidade). Além disso, a análisede Kaplan-Meier e o teste do Iog de classificação ambos mostraram umadiferença significativa no tempo até a recorrência entre o conjunto prognos-ticado com bom prognóstico e o conjunto prognosticado com prognósticoinsatisfatório (P < 0,0001) (figura 5). Nos 110 pacientes, a marca de 7 genesfoi confirmada como um fator de prognóstico forte para o desenvolvimentode recorrência remota (HR, 6,55; Cl de 95%, 2,89 - 14,8), e em ambas nasanálises de apenas uma variável e multivariada (HR, 13,9; Cl de 95%, 5,22 -37,2) (Tabela 7).

Tabela 7 Análise de Apenas uma Variável e Multivariada para a DMFS

<table>table see original document page 44</column></row><table>

modelo multivariada inclui 101 pacientes, devido aos valores inexistentes em 9pacientes

2Razao de Risco

3Sexo: Masculino vs. Feminino

4Grau: Moderado e Satisfatório vs. Insatisfatório

5Tamanho do tumor: >=5 mm vs. <5 mm

Entre as amostras comuns dos 54 pacientes usadas tanto para oensaio à base de microarranjo quanto o ensaio de RTQ-PCR, os resultadosdo arranjo classificaram 15 pacientes como recorrentes e 39 pacientes comonão recorrentes, enquanto os resultados de RTQ-PCR prognosticaram 9pacientes como recorrentes e 45 pacientes como não recorrentes. Quarentados 54 pacientes (74%) foram prognosticados consistentemente por ambosos métodos e 14 pacientes foram prognosticados inconsistentemente entreos métodos (26%). Dado que tipos diferentes de amostras de tecidos foramusados para os dois ensaios (congelados vs FPE), a concordância naclassificação resulta em alta entre os dois métodos. Entre as 14 amostrasdiscordantes, 4 paciente tiveram escores muito próximos aos cortes (dentrode 5% dos cortes), enquanto os 10 pacientes restantes tiveram escoresmuito insatisfatoriamente correlacionados entre os dois métodos (coeficientede correlação: 0,15). Foi repetido o ensaio de RTQ-PCR sobre as 10amostras discordantes usando as mesmas amostras de RNA e os escoresdos 2 ensaios de RTQ-PCR deu um coeficiente de correlação de 0,998. Osdados sugeriram que os escores discordantes destes pacientes poderiamser devidos a diferenças na amostragem do mesmo tumor. Um testeadicional é requerido para avaliar a variabilidade da amostragem nosmateriais FPE clínicos.

DISCUSSÃO

Foi proporcionados os resultados de um estudo de validaçãosobre a marca de 23 genes estabelecida anteriormente. Exemplos acimadescritos e Wang e outros (2005). No estudo acima, a sensibilidade e aespecificidade da marca foi 72% e 83%, respectivamente. Esta marca deprognóstico foi usada para prognosticar a recorrência remota em uma sérieindependente de 123 pacientes com câncer do cólon Dukes B, de acordocom os critérios pré-especificados. Além disso, foi descrita a validação bem-sucedida da recorrência remota em um conjunto independente de 110pacientes Dukes B usando uma marca de 7 genes, utilizando um ensaio deRTQ-PCR das amostras FPE. Este estudo nos traz uma etapa mais próximaao pedido clínico de tal teste prognóstico molecular para pacientes comcâncer do cólon. Isto realça a eficácia dos regimes de tratamento atuais parapacientes com câncer do cólon Dukes B.

No conjunto de amostras de pacientes desse estudo inicial(Wang e outros (2005)), o conglomerado hierárquico não supervisionadocom mais de 17.000 genes informativos detectou 2 subgrupos de tumoresrepresentando tumores bem diferenciados e menos diferenciados, respecti-vamente. Foi usada a expressão do gene de Caderina 17 como um indicadorpara estratificar os tumores Dukes B nos dois subgrupos e projetada amarca de gene de prognóstico para incluir classificadores para o subgrupo I(7 genes) e o subgrupo Il (15 genes). O conjunto de pacientes inicial podenão ter representado uma formação típica dos tumores Dukes B, especial-mente a razão dos pacientes entre o subgrupo I e o subgrupo II. No presenteestudo de validação, foram examinados os conjuntos de amostras indepen-dentes de 2 fontes e verificamos que o subgrupo Il somente era responsávelpor uma pequena parte de uma formação típica de tumores Dukes B (2%)nas amostras de ambos os locais. Portanto, foi simplificada a marca de genede prognóstico por remoção dos 15 genes que foram selecionados para osubgrupo II.

Os estudos que têm o propósito de desenvolver marcas degenes moleculares devem ser rigorosamente validados e não podem serconsiderados para aplicação clínica até os resultados serem adequada-mente confirmados e serem demonstrados serem altamente reproduzíveiscom relação aos aspectos metodológicos, estatísticos e clínicos. Comrelação a isto, diversas críticas têm sido levantadas em relação aos estudosde perfis de expressão de genes publicados sobre questões que se referemà omissão de conjuntos de validação independentes, aos tamanhos dosconjuntos de treinamento e de teste, ou possíveis efeitos desconcertantes dotratamento para a população de pacientes estudada. Ransohoff (2005); eSimon e outros (2003). Esse estudo presente representa a primeiravalidação bem-sucedida de um perfil de prognóstico pré-especificado paraos pacientes com câncer do cólon. A força do estudo vale-se dos conjuntosdiversos de pacientes a partir de múltiplas instituições e do uso dos materiaisFPE clínicos padrões. As amostras de tumor foram coletadas e arma-zenadas de acordo com protocolos institucionais, e as amostras de RNAforam preparadas usando procedimentos facilmente aplicáveis. Apesar dasdiferenças no manuseio do tecido em diferentes instituições, a marca degene provou ser forte e produziu resultados que estavam consistentes comaqueles da análise inicial.

Em resumo, os resultados do presente estudo de validaçãoconfirmam os resultados do relatório inicial. A reprodutibilidade provada dosresultados indica que a marca de gene de prognóstico pode serrecomendada para estudos clínicos futuros e potencialmente para uso naprática clínica. Como aproximadamente 20-30% dos pacientes com câncerdo cólon Dukes B têm recorrência, a marca de prognóstico proporciona umaferramenta poderosa para selecionar pacientes em alto risco por recorrênciae um possível tratamento adjuvante adicional. Liefers e outros (1998); eMarkowitz e outros (2002). Esta capacidade de identificar os pacientes queprecisam de intervenção clínica intensiva pode resultar em um aperfeiçoa-mento na sobrevivência da doença.

Exemplo 7

Reações PCR da Cepheid

Materiais e Métodos

Isolamento do RNA a partir de amostras em FFPE. O isolamentodo RNA de seções de tecido em parafina foi baseado nos métodos e nosreagentes descritos no manual do Kit de Alto Teor de RNA Puro em Parafina(Roche) com as seguintes modificações. As secções de 12 X 10 μm foramretiradas de cada amostra de tecido incrustada em parafina. As secçõesforam desparafinizadas conforme descrito pelo manual do Kit, o precipitadodo tecido foi secado em um forno a 55°C , por 5-10 minutos, e suspensonovamente em 100 μl de tampão de lise de tecido, 16 μl de SDS a 10% e 80μl de Proteinase K. As amostras foram redemoinhadas e incubadas em umtermomisturador ajustado a 400 rpm por 3 horas, a 55°C. O processamentosubseqüente da amostra foi efetuado de acordo com o manual do Kit de AltoTeor de RNA Puro em Parafina. As amostras foram quantificadas por leiturasem DO de 260/280 obtidas por um espectrofotômetro e o RNA isolado foiarmazenado em água sem RNase a 80°C , até o uso.

Reação em Cadeia por Polimerase em Tempo Real Quantitativade Uma Etapa. Os números de acesso das seqüências de referência demRNA apropriados em conjunção com o Iniciador Express 2.0 foram usadospara desenvolver nossos ensaios de prognóstico de Cólon com as sondasde hidrólise proteína de transcrito 5 similar à imunoglobulina (LILRB3),proteína de ativação de tirosina 3-monoxigenasetriptofano 5-monoxigenase(YWHAH), gene do ciclocelular RCC1 (CHC1), fator de transcrição BTEB2(KLF5), proteína de capeamento (filamento de actina), similar à gelsolina(CAPG), Iigador para a ativação das células T (LAT)1 doença de Iafora(EP2MA), proteína ribossômica L13a (RPL13A), actina, beta actina (ACTB) ehidroximetilbilano sintase (PBGD). Os iniciadores específicos para genes eas sondas de hidrólise para o ensaio de qRT-PCR de uma etapa otimizadosão listados na Tabela 8. A amplificação do DNA genômico foi excluída porprojeção desses ensaios em torno dos sítios de remoção de exon-intron. Assondas de hidrólise foram marcadas no nucleotídeo em 5' com qualquerFAM, Quasar 570, Texas Red ou Quasar 670 como o corante relator e nonucleotídeo em 3' com BHQ como o corante de finalização interno.

A quantificação do RNA específico para o gene foi realizada emum tubo de reação de 25 μΙ no sistema de detecção de seqüênciaSmartcycler Il (Cepheid). Para cada ensaio, as curvas padrões de genesforam amplificadas antes dos genes serem multiplexados para provar aeficiência da PCR. As curvas padrões para os nossos marcadoresconsistiam no gene-alvo em amostras de RNA total que estavam em umaconcentração de 2X102, 1X103 e 5X10 ng por reação. Nenhum controle-alvofoi também incluído em cada corrida de ensaio para assegurar uma ausênciade contaminação ambiental. Todas as amostras e controles foram corridosem duplicata. A PCR em Tempo Real Quantitativa foi realizada em umamistura de reação de 25 μΙ contendo: 100 ng de RNA de molde, Tampão deRT-PCR (125 mM de Bicina, 48 mM de KOH, 287,5 nM de KAc, 15% deglicerol, 3,125 mM de MgCI, 7,5 mM de MnSO4, 0,5 mM cada de dCTP,dATP, dGTP e dTTP), Aditivos (125 mM de Tris-Cl pH 8, 0,5 mg/ml AlbuminaBovina, 374,5 mM de Trealose, 0,5% de Tween 20), Mistura de Enzimas(0,65 U de Tth (Roche), 0,13 mg/ml de Ab TP6-25, Tris-Cl a 9 mM, Glicerol a3,5%), as concentrações de iniciadores e sondas foram variadas e estãolocalizadas na Tabela 9. As reações foram corridas em um Sistema deDetecção de Seqüência Smartcycler Il (Cepheid, Synnyvale, CA). Osseguintes parâmetros de ciclo foram seguidos: 1 ciclo a 95°C por 15segundos; 1 ciclo a 55°C por 6 minutos; 1 ciclo a 59°C por 6 minutos; 1 cicloa 64°C por 10 minutos e 40 ciclos a 95°C por 20 segundos, 58°C por 30segundos. Após a reação PCR estar completada, o software da Cepheid eos valores de Ct calculados foram exportados para o Microsoft Excel.

Tabela 8. Seqüências de Iniciadores e sondas de Prognóstico do Cólon paraas reações de Cepheid

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>Tabela 9. Concentrações dos Iniciadores e das Sondas de Prognóstico deCólon

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table>PBGD LAT

ID da Ct de Pt Final de Ct de Pt Final de Ct de Pt Final de

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table>Configuração da Reação de 25 ul Cepheid

<table>table see original document page 69</column></row><table>

1. Combinar todos os reagentes em um Tubo de 25 ul Cepheid

2. Antes do uso, dar uma girada rápida nos tubos em uma microcentrífuga detopo de bancada.

3. Colocar os tubos no Smartcycler e selecionar IVD Cólon 7a como oprotocolo

Configuração no Smartcycler Cepheid como se segue:

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Repetir 40 ciclos<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>

PrirreraZPriabes 655

BbnkMM 434.5

Total 500

<table>table see original document page 83</column></row><table>

PrirreraZProbes 86.75

Blank MM 413.25

Total 500

<table>table see original document page 83</column></row><table>

PrirreraZProbes 45.5

Blank MM 454.5

Total 500

Cephaeid 25 ul Reaction Set-up

1, Combine ett tr>e raagents Into β 25ul CepHeId Tube

2. Before use, Ihs tobee si quick spin in a bôfvchtop mlaocenlrifuge.

3. Place the tubas into lhe Smartcycter and setect Cotoo (VD 7a as lhe pfotoed

Setup in Cepheid SmBrteyclcr as follows:

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>Referências

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WANG, YIXINMAZUMDER, ABHIJITJIANG, YUQIUBRIGGS, THOMAS

<120> ENSAIO MOLECUAR PARA PROGNOSTICAR A RECORRÊNCIA DE CÂNCER

CÓLON DUKES B<130> VDX5033WOPCT

<140> 11/714,755

<141> 2007-03-05

<150> 60/779,170

<151> 2006-03-03

<160> 97

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 1

cattattcaa ggccgagtac agatg 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 2

cacgtacacg atgtgtcccc tct 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 3caggcggtgt gcctgctgca ttt 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 4

gtcccggcgg gattctgatg tt 22

<210> 5

<211> 112

<212> DNA

<213> humano

<400> 5

gaattcgccc ttgagaaaac gacgcatcca ctactgcgat taccctggtt gcacaaaagt 60

ttacaccaag tcttctcatt taaaagctca cctgaggact aagggcgaat tc 112

<210> 6<211> 60<212> DNA

<213> humano

<400> 6

aaacgacgca tccactactg cgattaccct ggttgcacaa aagtttacac caagtcttct 60

<210> 7

<211> 1924

<212> DNA

<213> humano

<400> 7

ccatgacgcc cgccctcaca gccctgctct gccttgggct gagtctgggc cccaggaccc 60

gcatgcaggc agggcccttc cccaaaccca ccctctgggc tgagccaggc tctgtgatca 120gctgggggag ccccgtgacc atctggtgtc aggggagcct ggaggcccag gagtaccaac 180tggataaaga gggaagccca gagccctggg acagaaataa cccactggaa cccaagaaca 240aggccagatt ctccatccca tccatgacac agcaccatgc agggagatac cgctgccact 300attacagctc tgcaggctgg tcagagccca gcgaccccct ggagctggtg atgacaggat 360tctacaacaa acccaccctc tcagccctgc ccagccctgt ggtggcctca ggggggaata 420tgaccctccg atgtggctca cagaagggat atcaccattt tgttctgatg aaggaaggag 480

aacaccagct cccccggacc ctggactcac agcagctcca cagtgggggg ttccaggccc 540

tgttccctgt gggccccgtg acccccagcc acaggcgtgt ctaggaagcc ctccctcctg 600

accctgcagg gccctgtcct ggcccctggg cagagcctga ccctccagtg tggctctgat 660

gtcggctacg acagatttgt tctgtataag gagggggaac gtgacttcct ccagcgccct 720

ggccagcagc cccaggctgg gctctcccag gccaacttca ccctgggccc tgtgagccgc 780

tcctacgggg gccagtacag gtgctatggt gcacacaacc tctcctccga gtggtcggcc 840

cccagtgacc ccctggacat cctgatcaca ggacagatct atgacaccgt ctccctgtca 900

gcacagccgg gccccacagt ggcctcagga gagaacatga ccctgctgtg tcagtcacgg 960

gggtattttg acactttcct tctgaccaaa gaaggggcag cccatccccc actgcgtctg 1020

agatcaatgt acggagctca taagtaccag gctgaattcc ccatgagtcc tgtgacctca 1080

gcccacgcgg ggacctacag gtgctacggc tcacgcagct ccaaccccca cctgctgtct 1140

ttccccagtg agcccctgga actcatggtc tcaggacact ctggaggctc cagcctccca 12 00

cccacagggc cgccctccac acctggtctg ggaagatacc tggaggtttt gattggggtc 1260

tcggtggcct tcgtcctgct gctcttcctc ctcctcttcc tcctcctccg acgtcagcgt 1320

cacagcaaac acaggacatc tgaccagaga aagactgatt tccagcgtcc tgcaggggct 1380

gcggagacag agcccaagga caggggcctg ctgaggaggt ccagcccagc tgctgacgtc 1440

caggaagaaa acctctagcc cacacgatga agacccccag gcagtgacgt atgccccggt 1500

gaaacactcc agtcctagga gagaaatggc ctctcctccc tcctcactgt ctggggaatt 1560

cctggacaca aaggacagac aggtggaaga ggacaggcag atggacactg aggctgctgc 1620

atctgaagcc tcccaggatg tgacctacgc ccagctgcac agcttgaccc ttagacggaa 1680

ggcaactgag cctcctccat cccaggaagg ggaacctcca gctgagccca gcatctacgc 1740

cactctggcc atccactagc ccggggggta cgcagacccc acactcagca gaaggagact 1800

caggactgct gaaggcacgg gagctgcccc cagtggacac cagtgaaccc cagtcagcct 1860

ggacccctaa cacagaccat gaggagacgc tgggaacttg tgggactcac ctgactcaaa 1920

gatg 1924<210> 8<211> 1398<212> DNA<213> humano<400> 8

gcgcgcgagc cacagcgccg gggcgagcca gcgagagggc cgagcggcgg cgctgcctgc 60agcctgcacg ctcggccggc cggcgagcca gtggccgtgc gcggcggcgg cctccgcagc 120

gaccggggag cggactgacc ggcgggaggg ctagcgagcc agcggtgtga ggcgcgaggc 180

gaggccgagc cgcgagcgac atgggggacc gggagcagct gctgcagcgg gcgcggctgg 240

ccgagcaggc ggagcgctac gacgacatgg cctccgctat gaaggcggtg acagagctga 300

atgaacctct ctccaatgaa gatcgaaatc tcctctctgt ggcctacaag aatgtggttg 360

gtgccaggcg atcttcctgg agggtcatta gcagcattga gcagaaaacc atggctgatg 420

gaaacgaaaa gaaattggag aaagttaaag cttaccggga gaagattgag aaggagctgg 480

agacagtttg caatgatgtc ctgtctctgc ttgacaagtt cctgatcaag aactgcaatg 540

atttccagta tgagagcaag gtgttttacc tgaaaatgaa gggtgattac taccgctact 600

tagcagaggt cgcttctggg gagaagaaaa acagtgtggt cgaagcttct gaagctgcct 660

acaaggaagc ctttgaaatc agcaaagagc agatgcaacc cacgcatccc atccggcttg 720

gcctggccct caacttctcc gtgttctact atgagatcca gaatgcacct gagcaagcct 7 80

gcctcttagc caaacaagcc ttcgatgatg ccatagctga gctggacaca ctaaacgagg 840

attcctataa ggactccacg ctgatcatgc agttgctgcg agacaacctc accctctgga 900

cgagcgacca gcaggatgaa gaagcaggag aaggcaactg aagatccttc agatcccctg 960

gcccttcctt cacccaccac ccccatcatc accgattctt ccttgccaca atcactaaat 1020

atctagtgct aaacctatct gtattggcag cacagctact cagatctgca ctcctgtctc 1080

ttgggaagca gtttcagata aatcatgggc attgctggac tgatggttgc tttgagccca 1140

caggagctcc ctttttgaat tgtgtggaga agtgtgttct gatgaggcat tttactatgc 1200

ctgttgatct atgggaaatc taggcgaaag taatggggaa gattagaaag aattagccaa 1260

ccaggctaca gttgatattt aaaagatcca tttaaaacaa gctgatagtg tttcgttaag 1320

cagtacatct tgtgcatgca aaaatgaatt cacccctccc acctctttct tcaattaatg 1380

gaaaagcgtt aagggaag 1398<210> 9<211> 1724<212> DNA<213> humano<400> 9

ctttttggag acagattcgc agtggtcgct tcttctcctt ggatttgtta aggattccaa 60

gtaactctta tttggagaga agacgatctg cacttcgcat tttggcattg acatttaatt 120

ttagggtcct ttatatagaa gggagagtag ctacatgaat gtgtaagatc ttggaggaag 180

acagcagaga gagagagaga gatcagagat cccagggtta aaagttggag aaatttcaca 240gtacatcatc caaaagagga gtccatgatg gaggcagagg taaacttgga gaggacagga 300

agatgtcacc caagcgcata gctaaaagaa ggtccccccc agcagatgcc atccccaaaa 360

gcaagaaggt gaaggtctca cacaggtccc acagcacaga acccggcttg gtgctgacac 420

taggccaggg cgacgtgggc cagctggggc tgggtgagaa tgtgatggag aggaagaagc 480

cggccctggt atccattccg gaggatgttg tgcaggctga ggctgggggc atgcacaccg 540

tgtgtctaag caaaagtggc caggtctatt ccttcggctg caatgatgag ggtgccctgg 600

gaagggacac atcagtggag ggctcggaga tggtccctgg gaaagtggag ctgcaagaga 660

aggtggtaca ggtgtcagca ggagacagtc acacagcagc cctcaccgat gatggccgtg 720

tcttcctctg gggctccttc cgggacaata acggtgtgat tggactgttg gagcccatga 780

agaagagcat ggtgcctgtg caggtgcagc tggatgtgcc tgtggtaaag gtggcctcag 840

gaaacgacca cttggtgatg ctgacagctg atggtgacct ctacaccttg ggctgcgggg 900

aacagggcca gctaggccgt gtgcctgagt tatttgccaa ccgtggtggc cggcaaggcc 960

tcgaacgact cctggtcccc aagtgtgtga tgctgaaatc caggggaagc cggggccacg 1020

tgagattcca ggatgccttt tgtggtgcct atttcacctt tgccatctcc catgagggcc 1080

acgtgtacgg cttcggcctc tccaactacc atcagcttgg aactccgggc acagaatctt 1140

gcttcatacc ccagaaccta acatccttca agaattccac caagtcctgg gtgggcttct 1200

ctggtggcca gcaccataca gtctgcatgg attcggaagg aaaagcatac agcctgggcc 1260

gggctgagta tgggcggctg ggccttggag agggtgctga ggagaagagc atacccaccc 1320

tcatctccag gctgcctgct gtctcctcgg tggcttgtgg ggcctctgtg gggtatgctg 1380

tgaccaagga tggtcgtgtt ttcgcctggg gcatgggcac caactaccag ctgggcacag 1440

ggcaggatga ggacgcctgg agccctgtgg agatgatggg caaacagctg gagaaccgtg 1500

tggtcttatc tgtgtccagc gggggccagc atacagtctt attagtcaag gacaaagaac 1560

agagctgatg aagcctctga gggcctggct tctgtcctgc acaacctccc tcacagaaca 1620

gggaagcagt gacagctgca gatggcagcg ggcctctccc cagccctgag cactgtgtca 1680

gttcctgcct tttctcatca gcagaacaga atccttttcc tctt 1724

<210> 10<211> 1622<212> DNA<213> humano<400> 10

cgttggcgtt tacgtgtgga agagcggaag agttttgctt ttcgtgcgcg ccttcgaaaa 60

ctgcctgccg ctgtctgagg agtccacccg aaacctcccc tcctccgccg gcagccccgc 120gctgagctcg ccgacccaag ccagcgtggg cgaggtggga agtgcgcccg acccgcgcct 180

ggagctgcgc ccccgagtgc ccatggctac aagggtgctg agcatgagcg cccgcctggg 240

acccgtgccc cagccgccgg cgccgcagga cgagccggtg ttcgcgcagc tcaagccggt 300

gctgggcgcc gcgaatccgg cccgcgacgc ggcgctcttc cccggcgagg agctgaagca 360

cgcgcaccac cgcccgcagg cgcagcccgc gcccgcgcag gccccgcagc cggcccagcc

gcccgccacc ggcccgcggc tgcctccaga ggacctggtc cagacaagat gtgaaatgga

gaagtatctg acacctcagc ttcctccagt tcctataatt ccagagcata aaaagtatag 540

acgagacagt gcctcagtcg tagaccagtt cttcactgac actgaagggt taccttacag 600

tatcaacatg aacgtcttcc tccctgacat cactcacctg agaactggcc tctacaaatc 660

ccagagaccg tgcgtaacac acatcaagac agaacctgtt gccattttca gccaccagag 720

tgaaacgact gcccctcctc cggccccgac ccaggccctc cctgagttca ccagtatatt 780

cagctcacac cagaccgcag ctccagaggt gaacaatatt ttcatcaaac aagaacttcc 840

tacaccagat cttcatcttt ctgtccctac ccagcagggc cacctgtacc agctactgaa 900

tacaccggat ctagatatgc ccagttctac aaatcagaca gcagcaatgg acactcttaa 960

tgtttctatg tcagctgcca tggcaggcct taacacacac acctctgctg ttccgcagac 1020

tgcagtgaaa caattccagg gcatgccccc ttgcacatac acaatgccaa gtcagtttct 1080

tccacaacag gccacttact ttcccccgtc accaccaagc tcagagcctg gaagtccaga 1140

12001260

tagacaagca gagatgctcc agaatttaac cccacctcca tcctatgctg ctacaattgcttctaaactg gcaattcaca atccaaattt acccaccacc ctgccagtta actcacaaaacatccaacct gtcagataca atagaaggag taaccccgat ttggagaaac gacgcatcca 1320ctactgcgat taccctggtt gcacaaaagt ttataccaag tcttctcatt taaaagctca 1380cctgaggact cacactggtg aaaagccata caagtgtacc tgggaaggct gcgactggag 1440gttcgcgcga tcggatgagc tgacccgcca ctaccggaag cacacaggcg ccaagccctt 1500ccagtgcggg gtgtgcaacc gcagcttctc gcgctctgac cacctggccc tgcatatgaa 1560gaggcaccag aactgagcac tgcccgtgtg acccgttcca ggtcccctgg gctccctcaa 1620at 1622

<210> 11<211> 1221<212> DNA

<213> humano

<400> 11

cgcaggctgg aaggaagacg aacctacgaa gcagagatct gaagacagca tgtacacagc

60cattccccag agtggctctc cattcccagg ctcagtgcag gatccaggcc tgcatgtgtg 120

gcgggtggag aagctgaagc cggtgcctgt ggcgcaagag aaccagggcg tcttcttctc 180

gggggactcc tacctagtgc tgcacaatgg cccagaagag gtttcccatc tgcacctgtg 240

gataggccag cagtcatccc gggatgagca gggggcctgt gccgtgctgg ctgtgcacct 300

caacacgctg ctgggagagc ggcctgtgca gcaccgcgag gtgcagggca atgagtctga 360

cctcttcatg agctacttcc cacggggcct caagtaccag gaaggtggtg tggagtcagc 420

atttcacaag acctccacag gagccccagc tgccatcaag aaactctacc aggtgaaggg 480

gaagaagaac atccgtgcca ccgagcgggc actgaactgg gacagcttca acactgggga 540

ctgcttcatc ctggacctgg gccagaacat cttcgcctgg tgtggtggaa agtccaacat 600

cctggaacgc aacaaggcga gggacctggc cctggccatc cgggacagtg agcgacaggg 660

caaggcccag gtggagattg tcactgatgg ggaggagcct gctgagatga tccaggtcct 720

gggccccaag cctgctctga aggagggcaa ccctgaggaa gacctcacag ctgacaaggc 780

aaatgcccag gccgcagctc tgtataaggt ctctgatgcc actggacaga tgaacctgac 840

caaggtggct gactccagcc cctttgccct tgaactgctg atatctgatg actgctttgt 900

gctggacaac gggctctgtg gcaagatcta tatctggaag gggcgaaaag cgaatgagaa 960

ggagcggcag gcagccctgc aggtggccga gggcttcatc tcgcgcatgc agtacgcccc 1020

gaacactcag gtggagattc tgcctcaggg ccgtgagagt cccatcttca agcaattttt 1080

caaggactgg aaatgagggt gggcgtcttc ctgccccatg ctcccctgcc ccccaccacc 1140

tgcctgcttg cttctctggc tgcctggtca gtgcagaggt gccccctgca gatgttcaat 1200

aaaggagaca agtgctttcc c 1221<210> 12<211> 1460<212> DNA<213> humano<400> 12

accccatctt catctggcct tgactctgcc cttgaggggc ctaggggtgc agccagcctg 60

ctccgagctc ccctgcagat ggaggaggcc atcctggtcc cctgcgtgct ggggctcctg 120

ctgctgccca tcctggccat gttgatggca ctgtgtgtgc actgccacag actgccaggc 180

tcctacgaca gcacatcctc agatagtttg tatccaaggg gcatccagtt caaacggcct 240

cacacggttg ccccctggcc acctgcctac ccacctgtca cctcctaccc acccctgagc 300

cagccagacc tgctccccat cccaagatcc ccgcagcccc ttgggggctc ccaccggacg 360

ccatcttccc ggcgggattc tgatggtgcc aacagtgtgg cgagctacga gaacgagggt 420gcgtctggga tccgaggtgc ccaggctggg tggggagtct ggggtccgtc ctggactagg 480

ctgacccctg tgtcgttacc cccagaacca gcctgtgagg atgcagatga ggatgaggac 540

gactatcaca acccaggcta cctggtggtg cttcctgaca gcaccccggc cactagcact 600

gctgccccat cagctcctgc actcagcacc cctggcatcc gagacagtgc cttctccatg 660

gagtccattg atgattacgt gaacgttccg gagagcgggg agagcgcaga agcgtctctg 720

gatggcagcc gggagtatgt gaatgtgtcc caggaactgc atcctggagc ggctaagact 780

gagcctgccg ccctgagttc ccaggaggca gaggaagtgg aggaagaggg ggctccagat 840

tacgagaatc tgcaggagct gaactgaggg cctgtggagg ccgagtctgt cctggaacca 900

ggcttgcctg ggacggctga gctgggcagc tggaagtggc tctggggtcc tcacatggcg 960

tcctgccctt gctccagcct gacaacagcc tgagaaatcc ccccgtaact tattatcact 1020

ttggggttcg gcctgtgtcc cccgaacgct ctgcaccttc tgacgcagcc tgagaatgac 1080

ctgccctggc cccagcccta ctctgtgtaa tagaataaag gcctgcgtgt gtctgtgttg 1140

agcgtgcgtc tgtgtgtgcc tgtgtgcgag tctgagtcag agatttggag atgtctctgt 1200

gtgtttgtgt gtatctgtgg gtctccatcc tccatggggg ctcagccagg tgctgtgaca 12 60

ccccccttct gaatgaagcc ttctgacctg ggctggcact gctgggggtg aggacacatt 1320

gccccatgag acagtcccag aacacggcag ctgctggctg tgacaatggt ttcaccatcc 13 80

ttagaccaag ggatgggacc tgatgacctg ggaggactct tttagttctt acctcttgtg 1440

gttctcaata aaacagaacg 1460<210> 13<211> 1403<212> DNA<213> humano<400> 13

gcttccgctt tggggtggtg gtgccacccg ccgtggccgg cgcccggccg gagctgctgg 60

tggtggggtc gcggcccgag ctggggcgtt gggagccgcg cggtgccgtc cgcctgaggc 120

cggccggcac cgcggcgggc gacggggccc tggcgctgca ggagccgggc ctgtggctcg 180

gggaggtgga gctggcggcc gaggaggcgg cgcaggacgg ggcggagccg ggccgcgtgg 240

acacgttctg gtacaagttc ctgaagcggg agccgggagg agagctctcc tgggaaggca 300

atggacctca tcatgaccgt tgctgtactt acaatgaaaa caacttggtg gatggtgtgt 360

attgtctccc aataggacac tggattgagg ccactgggca caccaatgaa atgaagcaca 420

caacagactt ctattttaat attgcaggcc accaagccat gcattattca aggccgagta 480

cagatgctgc cccaggcggt gtgcctgctg catgcgctgc tggagaaggg acacatcgtg 540tacgtgcact gcaacgctgg ggtgggccgc tccaccgcgg ctgtctgcgg ctggctccag 600

tatgtgatgg gctggaatct gaggaaggtg cagtatttcc tcatggccaa gaggccggct 660

gtctacattg acgaagaggc cttggcccgg gcacaagaag attttttcca gaaatttggg 720

aaggttcgtt cttctgtgtg tagcctgtag ctggtcagcc tgcttctgcc ccctcctgat 780

ttccctaagg agcctgggat gatgttggtc aaatgaccta gaaacaagga ttctacctga 840

actgaaagga ctgtgtgacc tcccccaagc caaccacttt cacctgggat gactttcgat 900

tatgctttgt tttggggctg tatttttgaa atactctaca agaaagctgt ggctcaacac 960

atgagaagaa gcacgaagca gttaggctgt acatcagaca gaagggtaat gcgtgcagtt 1020

cctgctgcct gcaggcagac gaggcctttg ctttacagca ctgtatgtgt tgcacgatgg 1080

atccgtgaca gcactttcct gttgcactga aactcttggc catgtagagg aaaagatatg 1140

gagttatgtg gatttcatca ctagtatgtg tgcgtgagct ggtcagttgc caaaggagga 1200

aataaggtta gaagcctgaa ccgttacaaa agaagagctc actatggtca aaaagtgatg 1260

gctttcagga cttgtttttt atcctgcctc acagttgtta aagtctgttc caaggcatca 1320

ccttccttct ctacccaaca accctgtgta acaactaaag tagaattatc tccaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1403<210> 14<211> 3463<212> DNA<213> humano<400> 14

atggctgagc cgactagtga tttcgagact cctatcgggt ggcatgcgtc tcccgagctg 60

actcccacgt tagggcccct gagcgacact gccccgccgc gggacaggtg gatgttctgg 120

gcaatgctgc cgccaccgcc accaccactt acgtcctcgc ttcccgcagc cgggtcaaag 180

ccttcctctg agtcgcagcc ccccatggag gcccagtctc tccccggggc tccgcccccc 240

ttcgacgccc agattcttcc cggggcgcaa ccccccttcg acgcccagtc tccccttgat 300

tctcagcctc aacccagcgg ccagccttgg aatttccatg cttccacatc gtggtattgg 360

agacagtctt ctgataggtt tcctcggcat cagaagtcct tcaaccctgc agttaaaaat 420

tcttattatc cacgaaagta tgatgcaaaa ttcacagact tcagcttacc tcccagtaga 480

aaacagaaaa aaaagaaaag aaaggaacca gtttttcact ttttttgtga tacctgtgat 540

cgtggtttta aaaatcaaga aaagtatgac aaacacatgt ctgaacatac aaaatgccct 600

gaattagatt gctcttttac tgcacacgag aagattgtcc agttccattg gagaaatatg 660

catgctcctg gcatgaagaa gatcaagtta gacactccag aggaaattgc acggtggagg 720gaagaaagaa ggaaaaacta tccaactctgcttgaaaagg agaagagagg agcagtattgatgtccagac attcacaaat ggcaaagatcaacgacaatt ctagacagag agcagtcactctagaaggtc caccggaggc aaatgcagatgagtctgata aggaggagaa accacaacatctatgctcac taatgagtag ctatggcagtactcccatca agactgaagc agacgttttgcctaagagtc caagtcaaga tgttaaagcagagaaccgaa agaaaagctt tgaaaaaacatatcaaacgt tattcgaacc aagaacacacccggacattc gacatgaaag aaatgtgattgacttttttg gactggatac taattctgcgtcagcataca taactgaagc atgtgaaacaaacccttttt tccgtcaaaa ttggatttgtttggaatttt aagtctttcc tttggttctaactgtgtctg tattgttggg attgaatctattattttaat gtattgttct catgtaagaagataggttta gcagtaaaga agaaagctttggcagagaaa tacagccatt ttgtttttaagggaatattt taaaaataaa ccagatcaaaatattcctta tttaagacat gtttaaattcattgaatgtt taaaatatta atacagatggacttaattga agctttttaa aaattgtaaatcctataata ccagggaatt tgagcttgtggtctgtcctt ttgacataca gctaaaaggggttgaagatt aacttttcct aacattgtgagaagaaaggt aagaaagctg atagctcctcgaacacctgg catgtgaccc tagtgacgtccagtgttttc cagccttgta cccaccatactccagtgagc cccatatttt gggaaattatgtaacactgt tgagtgctta ctctttgtac

gccaatattg aaaggaagaa gaagttaaaa 780

acaacaacac aatatggcaa gatgaagggg 840

agaagtcctg gcaagaatca caaatggaaa 900

ggatcaggca gtcacttgtg tgatttgaag 960

cctcttggtg ttttgataaa cagtgattct 1020

tctgtgatac ccaaggaagt gacaccagcc 1080

ctttcagggt cagagagtga gccagaagaa 1140

gcagaaaacc aggttcttga tagcagtgct 1200

actgttagaa atttttcaga agccaagagt 1260

aaccctaaga ggaaaaaaga ttatcacaac 1320

catccatatc tcttggaaat gcttctagct 1380

ttgcagtgtg ttcggtacat cattaaaaaa 1440

aaaagtaaag atgtataggc atctggtgtt 1500

gtatcatcct cgttagtaga ggaaaaccaa 1560

aattaaattg taagcctcgt aggatgtatg 1620

tgcaaataaa aaaataactg attttttaag 1680

gtatttgctg ggagaatttt ttctttgtat 1740

tgactgatgt tgtgttagtt aagaattgaa 1800

taaaaggatt gattcagcta agcaaagttg 1860

tgcagaaaag gaagatgttc tgtagcaagg 1920

ttaatacaat cagaaggttt cgaaatgtaa 1980

acctactagc acgacttaca tagctcaaat 2040

ggcctcttta tgtttagata aaattgaagt 2100

gtaaatgaaa gctattgaga tctttttgtc 2160

ttctagtcat tgtactagct gtagctattg 2220

actaaatttg taaaaaatta gtttgttata 2280

ttattgaagt tcatgaatct tgctgtcaag 2340

catgttggta aaatcctctc cagaatcttg 2400

acagacctga gatgaagatt catgtttagc 2460

agatctgttt attctgtttc accctactcc 2520

ctgccttata cattaactaa ttcaattcat 2580

ctctattgtg cctatattaa aggtatacaa 2640ataaataagg ccatgtctga cttcaaggaa ctcagtttaa ttttgatata ttcaaagatg 2700

tgattcccaa ccaactcagg atgaagtaac tagtgttaca actgagttga tattctaaaa 2760

tataacccag tttgtacttt tattactagt tagcatacac attttatggc ttatgggtta 2820

ataaatgaat tcatggactc ctggactact ttcattgatg accatatctc cagggatgtt 2880

gttgatcccc acactgcctt aaggtatatt atagaaacag ttttattttc catttttctt 2940

gtttcctgat aataaatgta tttaggactg aaaatactcc tgagtactcc cctggctgta 3000

tgtctgacag tctttagcta tggtgactat tgtttatttt taatgggtat ttcagattcc 3060

aagtgtattt aaaatttcta aggagatata atatagcctg tatggtttct actttatgga 3120

attatatggt caatatttgt aaatattcta tgagttttgg gtgggtagag gggtgctttg 3180

cctgttttgg gtacaggttt ttttggattt agcttgttaa ttgttcaaac tttctgcctt 3240

ctacattcct atcttattgt tcgtttaatc agtttctgaa atgtaagcat tacatgacta 3300

ttggtgagtt gtgcctttta taactgaaat actttacttt ttctcatatc ctctataatt 3360

gacttctatt ttccttaatc aaaccagctc tgggaaattt aatacattta tattaattga 3420

gattattaaa acatttggac tattaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3463<210> 15<211> 5115<212> DNA<213> humano<400> 15

gaattccggg agcgggcggg ctgcgaggcc gcggggcatg cgggaggcgg aggggtggga 60

ccgggtggct gcgcccattc cacacccgcc gaaagcggac actgtcagct gaatcactcc 120

ccttttagga ggagggaggg ggaaaaggtg tctagctaat ttctgcttaa aaaagcacag 180

gagatcgcgg gtcagctttg cagtcgctgc cttctcgcgc ctgaccatgc acccctgcat 240

cttcctgctg ggcacaggcg agcgctttat ttctggagct gagggctaaa acttttttca 300

cttttcttct cctcaacatc tgaatcatgc catgtgccca gaggagctgg cttgcaaacc 360

tttccgtggt ggctcagctc cttaactttg gggcgctttg ctatgggaga cagcctcagc 420

caggcccggt tcgcttcccg gacaggaggc aagagcattt tatcaagggc ctgccagaat 480

accacgtggt gggtccagtc cgagtagatg ccagtgggca ttttttgtca tatggcttgc 540

actatcccat cacgagcagc aggaggaaga gagatttgga tggctcagag gactgggtgt 600

actacagaat ttctcacgag gagaaggacc tgttttttaa cttgacggtc aatcaaggat 660

ttctttccaa tagctacatc atggagaaga gatatgggaa cctctcccat gttaagatga 720

tggcttcctc tgcccccctc tgccatctca gtggcacggt tctacagcag ggcaccagag 780ttgggacggc agccctcagt gcctgccatg gactgactgg atttttccaa ctaccacatg 840

gagacttttt cattgaaccc gtgaagaagc atccactggt tgagggaggg taccacccgc 900

acatcgttta caggaggcag aaagttccag aaaccaagga gccaacctgt ggattaaagg 960

acagtgttaa catctcccag aagcaagagc tatggcggga gaagtgggag aggcacaact 1020

tgccaagcag aagcctctct cggcgttcca tcagcaagga gagatgggtg gagacactgg 1080

tggtggccga cacaaagatg attgaatacc atgggagtga gaatgtggag tcctacatcc 1140

tcaccatcat gaacatggtc actgggttgt tccataaccc aagcattggc aatgcaattc 1200

acattgttgt ggttcggctc attctactcg aagaagaaga gcaaggactg aaaatagttc 1260

accatgcaga aaagacactg tctagcttct gcaagtggca gaagagtatc aatcccaaga 1320

gtgacctcaa tcctgttcat cacgacgtgg ctgtccttct caccagaaag gacatctgtg 1380

ctggtttcaa tcgcccctgc gagaccctgg gcctgtctca cctttcagga atgtgtcagc 1440

ctcaccgcag ttgtaacatc aatgaagatt cgggactccc tctggctttc acaattgccc 1500

atgagctagg acacagcttc ggcatccagc atgatgggaa agaaaatgac tgtgagcctg 1560

tgggcagaca tccgtacatc atgtcccgcc agctccagta cgatcccact ccgctgacat 1620

ggtccaagtg cagcgaggag tacatcaccc gcttcttgga ccgaggctgg gggttctgtc 1680

ttgatgacat acctaaaaag aaaggcttga agtccaaggt cattgccccc ggagtgatct 1740

atgatgttca ccaccagtgc cagctacaat atggacccaa tgctaccttc tgccaggaag 1800

tagaaaacgt ctgccagaca ctgtggtgct ccgtgaaggg cttttgtcgc tctaagctgg 1860

acgctgctgc agatggaact caatgtggtg agaagaagtg gtgtatggca ggcaagtgca 1920

tcacagtggg gaagaaacca gagagcattc ctggaggctg gggccgctgg tcaccctggt 1980

cccactgttc caggacctgt ggggctggag tccagagcgc agagaggctc tgcaacaacc 2040

ccgagccaaa gtttggaggg aaatattgca ctggagaaag aaaacgctat cgcttgtgca 2100

acgtccaccc ctgtcgctca gaggcaccaa catttcggca gatgcagtgc agtgaatttg 2160

acactgttcc ctacaagaat gaactctacc actggtttcc catttttaac ccagcacatc 2220

cttgtgagct ctactgccga cccatagatg gccagttttc tgagaaaatg ctggatgctg 2280

tcattgatgg taccccttgc tttgaaggcg gcaacagcag aaatgtctgt attaatggca 2340

tatgtaagat ggttggctgt gactatgaga tcgattccaa tgccaccgag gatcgctgcg 2400

gtgtgtgcct gggagatggc tcttcctgcc agactgtgag aaagatgttt aagcagaagg 2460

aaggatctgg ttatgttgac attgggctca ttccaaaagg agcaagggac ataagagtga 2520

tggaaattga gggagctgga aacttcctgg ccatcaggag tgaagatcct gaaaaatatt 2580

acctgaatgg agggtttatt atccagtgga acgggaacta taagctggca gggactgtct 2640

ttcagtatga caggaaagga gacctggaaa agctgatggc cacaggtccc accaatgagt 2700ctgtgtggat ccagcttcta ttccaggtga ctaaccctgg catcaagtat gagtacacaa 2760

tccagaaaga tggccttgac aatgatgttg agcagatgta cttctggcag tacggccact 2820

ggacagagtg cagtgtgacc tgcgggacag gtatccgccg ccaaactgcc cattgcataa 2880

agaagggccg cgggatggtg aaagctacat tctgtgaccc agaaacacag cccaatggga 2940

gacagaagaa gtgccatgaa aaggcttgtc cacccaggtg gtgggcaggg gagtgggaag 3000

catgctcggc gacatgcggg ccccacgggg agaagaagcg aaccgtgctg tgcatccaga 3060

ccatggtctc tgacgagcag gctctcccgc ccacagactg ccagcacctg ctgaagccca 3120

agaccctcct ttcctgcaac agagacatcc tgtgcccctc ggactggaca gtgggcaact 3180

ggagtgagtg ttctgtttcc tgtggtggtg gagtgcggat tcgcagtgtc acatgtgcca 3240

agaaccatga tgaaccttgc gatgtgacaa ggaaacccaa cagccgagct ctgtgtggcc 3300

tccagcaatg cccttctagc cggagagttc tgaaaccaaa caaaggcact atttccaatg 3360

gaaaaaaccc accaacacta aagcccgtcc ctccacctac atccaggccc agaatgctga 3420

ccacacccac agggcctgag tctatgagca caagcactcc agcaatcagc agccctagtc 3480

ctaccacagc ctccaaagaa ggagacctgg gtgggaaaca gtggcaagat agctcaaccc 3540

aacctgagct gagctctcgc tatctcattt ccactggaag cacttcccag cccatcctca 3600

cttcccaatc cttgagcatt cagccaagtg aggaaaatgt ttccagttca gatactggtc 3660

ctacctcgga gggaggcctt gtagctacaa caacaagtgg ttctggcttg tcatcttccc 3720

gcaaccctat cacttggcct gtgactccat tttacaatac cttgaccaaa ggtccagaaa 3780

tggagattca cagtggctca ggggaagaaa gagaacagcc tgaggacaaa gatgaaagca 3840

atcctgtaat atggaccaag atcagagtac ctggaaatga cgctccagtg gaaagtacag 3900

aaatgccact tgcacctcca ctaacaccag atctcagcag ggagtcctgg tggccaccct 3960

tcagcacagt aatggaagga ctgctcccca gccaaaggcc cactacttcc gaaactggga 4020

cacccagagt tgaggggatg gttactgaaa agccagccaa cactctgctc cctctgggag 4080

gagaccacca gccagaaccc tcaggaaaga cggcaaaccg taaccacctg aaacttccaa 4140

acaacatgaa ccaaacaaaa agttctgaac cagtcctgac tgaggaggat gcaacaagtc 4200

tgattactga gggctttttg ctaaatgcct ccaattacaa gcagctcaca aacggccacg 4260

gctctgcaca ctggatcgtc ggaaactgga gcgagtgctc caccacatgt ggcctggggg 4320

cctactggaa aagggtggag tgcaccaccc agatggattc tgactgtgcg gccatccaga 4380

gacctgaccc tgcaaaaaga tgccacctcc gtccctgtgc tggctggaaa gtgggaaact 4440

ggagcaagtg ctccagaaac tgcagtgggg gcttcaagat acgcgagatt cagtgcgtgg 4500

acagccggga ccaccggaac ctgaggccat ttcactgcca gttcctggcc ggcattcctc 4560

ccccattgag catgagctgt aacccggagc cctgtgaggc gtggcaggtg gagccttgga 4620gccagtgctc caggtcctgt ggaggtggag ttcaggagag aggagtgttc tgtccaggag 4680

gcctctgtga ttggacaaaa agacccacat ccaccatgtc ttgcaatgag cacctgtgct 4740

gtcactgggc cactgggaac tgggacctgt gttccacttc ctgtggaggt ggctttcaga 4800

agaggattgt ccaatgtgtg ccctcagagg gcaataaaac tgaagaccaa gaccaatgtc 4860

tatgtgatca caaacccaga cctccagaat tcaaaaaatg caaccagcag gcctgcaaga 4920

aaagtgccga tttactttgc actaaggaca aactgtcagc cagtttctgc cagacactga 4980

aagccatgaa gaaatgttct gtgcccaccg tgagggctga gtgctgcttc tcgtgtcccc 5040

agacacacat cacacacacc caaaggcaaa gaaggcaacg gttgctccaa aagtcaaaag 5100

aactctaagc ccaaa 5115<210> 16<211> 528<212> DNA<213> humano<400> 16

cgccagggag ctgtgaggca gtgctgtgtg gttcctgccg tccggactct ttttcctcta 60

ctgagattca tctgtgtgaa atatgagttg gcgaggaaga tcgacctatt attggcctag 120

accaaggcgc tatgtacagc ctcctgaaat gattgggcct atgcggcccg agcagttcag 180

tgatgaagtg gaaccagcaa cacctgaaga aggggaacca gcaactcaac gtcaggatcc 240

tgcagctgct caggagggag aggatgaggg agcatctgca ggtcaagggc cgaagcctga 3 00

agctgatagc caggaacagg gtcacccaca gactgggtgt gagtgtgaag atggtcctga 3 60

tgggcaggag atggacccgc caaatccaga ggaggtgaaa acgcctgaag aaggtgaaaa 420

gcaatcacag tgttaaaaga aggcacgttg aaatgatgca ggctgctcct atgttggaaa 480

tttgttcatt aaaattctcc caataaagct ttacagcctt ctgcaaaa 528<210> 17<211> 2247<212> DNA<213> humano<400> 17

tttcttgagc taggaaaggt ggttggctta cggcacagta gagagcttcc agggctggct 60

ggcgtgggat acccgtacca cagaaatgca gggaccattg cttcttccag gcctctgctt 120

tctgctgagc ctctttggag ctgtgactca gaaaaccaaa acttcctgtg ctaagtgccc 180

cccaaatgct tcctgtgtca ataacactca ctgcacctgc aaccatggat atacttctgg 240atctgggcag aaactattca cattcccctt ggagacatgt aacgacatta atgaatgtac 300

accaccctat agtgtatatt gtggatttaa cgctgtgtgt tacaatgtcg aaggaagttt 360

ctactgtcaa tgtgtcccag gatatagact gcattctggg aatgaacaat tcagtaattc 420

caatgagaac acctgtcagg acaccacctc ctcaaagaca accgagggca ggaaagagct 480

gcaaaagatt gtggacaaat ttgagtcact tctcaccaat cagactttat ggagaacaga 540

agggagacaa gaaatctcat ccacagctac cactattctc cgggatgtgg aatcgaaagt 600

tctagaaact gccttgaaag atccagaaca aaaagtcctg aaaatccaaa acgatagtgt 660

agctattgaa actcaagcga ttacagacaa ttgctctgaa gaaagaaaga cattcaactt 720

gaacgtccaa atgaactcaa tggacatccg ttgcagtgac atcatccagg gagacacaca 780

aggtcccagt gccattgcct ttatctcata ttcttctctt ggaaacatca taaatgcaac 840

tttttttgaa gagatggata agaaagatca agtgtatctg aactctcagg ttgtgagtgc 900

tgctattgga cccaaaagga acgtgtctct ctccaagtct gtgacgctga ctttccagca 960

cgtgaagatg acccccagta ccaaaaaggt cttctgtgtc tactggaaga gcacagggca 1020

gggcagccag tggtccaggg atggctgctt cctgatacac gtgaacaaga gtcacaccat 1080

gtgtaattgc agtcacctgt ccagcttcgc tgtcctgatg gccctgacca gccaggagga 1140

ggatcccgtg ctgactgtca tcacctacgt ggggctgagc gtctctctgc tgtgcctcct 1200

cctggcggcc ctcacttttc tcctgtgtaa agccatccag aacaccagca cctcactgca 1260

tctgcagctc tcgctctgcc tcttcctggc ccacctcctc ttcctcgtgg ggattgatcg 1320

aactgaaccc aaggtgctgt gctccatcat cgccggtgct ttgcactatc tctacctggc 1380

cgccttcacc tggatgctgc tggagggtgt gcacctcttc ctcactgcac ggaacctgac 1440

agtggtcaac tactcaagca tcaatagact catgaagtgg atcatgttcc cagtcggcta 1500

tggcgttccc gctgtgactg tggccatttc tgcagcctcc tggcctcacc tttatggaac 1560

tgctgatcga tgctggctcc acctggacca gggattcatg tggagtttcc ttggcccagt 1620

ctgtgccatt ttctctgcga atttagtatt gtttatcttg gtcttttgga ttttgaaaag 1680

aaaactttcc tccctcaata gtgaagtgtc aaccatccag aacacaagga tgctggcttt 1740

caaagcaaca gctcagctct tcatcctggg ctgcacatgg tgtctgggct tgctacaggt 1800

gggtccagct gcccaggtca tggcctacct cttcaccatc atcaacagcc tccaaggctt 1860

cttcatcttc ttggtctact gcctcctcag ccagcaggtc cagaaacaat atcaaaagtg 1920

gtttagagag atcgtaaaat caaaatctga gtctgagaca tacacacttt ccagcaagat 1980

gggtcctgac tcaaaaccca gtgaggggga tgtttttcca ggacaagtga agagaaaata 2040

ttaaaactag aatattcaac tccatatgga aaatcatatc catggatctc tttggcatta 2100

tgaagaatga agctaaggaa aagggaattc attaaacata tcatccttgg agaggaagta 2160atcaaccttt acttcccaag ctgtttgttc tccacaatag gctctcaaca aatgtgtggt 2220aaattgcatt tctcttcaaa aaaaaaa 2247

<210> 18<211> 1325

<212> DNA

<213> humano

<400> 18

accaatcctc acctctcacc tctgtgtccg ccctgctggg aaatattcca ggctttggcc

aagctgctgg tgaccccccc caaggccctg ctcaagcccc tctccatccc caaccagctc

ctgctggggc ctggtccttc caacctgcct cctcgcatca tggcagccgg ggggctgcag

atgatcgggt ccatgagcaa ggatatgtac cagatcatgg acgagatcaa ggaaggcatc

cagtacgtgt tccagaccag gaacccactc acactggtca tctctggctc gggacactgt

gccctggagg ccgccctggt caatgtgctg gagcctgggg actccttcct ggttggggcc

aatggcattt gggggcagcg agccgtggac atcggggagc gcataggagc ccgagtgcac

cagcacaagc cagtgctgct gttcttaacc cacggggagt cgtccaccgg cgtgctgcagccccttgatg gcttcgggga actctgccac aggtacaagt gcctgctcct ggtggattcg

60

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tcgggctccc agaaggccct gaacgcccct ccagggacct cgctcatctc cttcagtgac

aaggccaaaa agaagatgta ctcccgcaag acgaagccct tctccttcta cctggacatc

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cccgtcatca gcctgtacag cctgagagag agcctggccc tcattgcgga acagggcctg

gagaacagct ggcgccagca ccgcgaggcc gcggcgtatc tgcatgggcg cctgcaggca 1020

ctggggctgc agctcttcgt gaaggacccg gcgctccggc ttcccacagt caccactgtg 1080

gctgtacccg ctggctatga ctggagagac atcgtcagct acgtcataga ccacttcgac 1140

attgagatca tgggtggcct tgggccctcc acggggaagg tgctgcggat cggcctgctg 1200

ggctgcaatg ccacccgcga gaatgtggac cgcgtgacgg aggccctgag ggcggccctg 1260

cagcactgcc ccaagaagaa gctgtgacct gcccactggc acacagctgg cactggcaca 1320cacct 1325<210> 19<211> 2263<212> DNA

<213> humano

<400> 19

agccagaggg acgagctagc ccgacgatggagcagcccac ccatgccgtg tgtgtgctggctgcccctga ggactgcacg tccttcagcattgcccacag ccctccagcc aagaagaaatctggggtaga ggtgaccctg acgatgaaagttcagatttc atactacgga cccaagactccggtggaaat ctccctgtgc gcagacatcactgtgaaaga tcagaggacc tggacctgggtgaactgtga cagagacaat ctcgaatcttttgacagcga agacctgcag gacatgtcgcacttcttcac aaaccataca ctggtgctccgggtgtttca ggccacacgg ggcaaactgtagtggccctc tcactacctg atggtccccgaggccctcgc tttcccggac accgacttcctggacacgtc caacctggag ctccccgagggcgtggcgcc ctggatcatg acccccaacagtatttttga aaatgaggac ttcctgaagtgcaagctgac catctgccct gaggaggagatggagatcgg ctacatccaa gccccacacaggaacagagg cctgaaggag tttcccatcataactcgagg gccccaaaca gggggtatcatgagcccccc agtcacagtc aggggcaaggacagctgtta tcccagcaat gacagccggcgtgcccagca ggtgcaggcc cctgtgaagctggacgagtt cctgagcttt gtgccagcacccagccccag gtcctgctac aaactgttccccctgctgtt cgaagggatc aagaaaaaaaacaagacatt gagagaacat aattcatttgtgctgaagcg ggagctgggc ctggccgaga

cccaggggac attgatccgt gtgaccccag 60

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tcaacgcctc cccaggggtg gtcgtggata 180

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aacgagtgat gggtccagat tttggctatg 1200

gtggactgga ctcctttggg aacctggaag 1260

aatacccgct gggcaggatt ctcttcgggg 1320

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aacagcagaa aataaagaac attctgtcaa 1620

tggagagatg catcgactgg aaccgcgagc 1680

gtgacatcat tgacatcccg cagctcttca 1740agctcaaaga gttctctaag gcggaagctt ttttccccaa catggtgaac atgctggtgc 1800

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tggaggagaa ggtgtgttcc ctgctggagc cactgggcct ccagtgcacc ttcatcaacg 1920

acttcttcac ctaccacatc aggcatgggg aggtgcactg cggcaccaac gtgcgcagaa 1980

agcccttctc cttcaagtgg tggaacatgg tgccctgagc ccatcttccc tggcgtcctc 2040

tccctcctgg ccagatgtcg ctgggtcctc tgcagtgtgg caagcaagag ctcttgtgaa 2100

tattgtggct ccctgggggc ggccagccct cccagcagtg gcttgctttc ttctcctgtg 2160

atgtcccagt ttcccactct gaagatccca acatggtcct agcactgcac actcagttct 2220

gctctaagaa gctgcaataa agttttttta agtcactttg tac 22 63

<210> 20<211> 2772

<212> DNA

<213> humano

<400> 20

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60

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180240

ggcccggcgc ctgggcgcgc catgcgcagc accacgctcc tggccctgct ggcgctggtc

ttgctttact tggtgtctgg tgccctggtg ttccgggccc tggagcagcc ccacgagcag

caggcccaga gggagctggg ggaggtccga gagaagttcc tgagggccca tccgtgtgtg 300

agcgaccagg agctgggcct cctcatcaag gaggtggctg atgccctggg agggggtgcg 360

gacccagaaa ccaactcgac cagcaacagc agccactcag cctgggacct gggcagcgcc

ttctttttct cagggaccat catcaccacc atcggctatg gcaatgtggc cctgcgcaca

gatgccgggc gcctcttctg catcttctat gcgctggtgg ggattccgct gtttgggatc

ctactggcag gggtcgggga ccggctgggc tcctccctgc gccatggcat cggtcacatt

gaagccatct tcttgaagtg gcacgtgcca ccggagctag taagagtgct gtcggcgatg

420480540600660

cttttcctgc tgatcggctg cctgctcttt gtcctcacgc ccacgttcgt gttctgctat 720

atggaggact ggagcaagct ggaggccatc tactttgtca tagtgacgct taccaccgtg

ggctttggcg actatgtggc cggcgcggac cccaggcagg actccccggc ctatcagccg

ctggtgtggt tctggatcct gctcggcctg gcttacttcg cctcagtgct caccaccatc

gggaactggc tgcgagtagt gtcccgccgc actcgggcag agatgggcgg cctcacggct

caggctgcca gctggactgg cacagtgaca gcgcgcgtga cccagcgagc cgggcccgcc 1020

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780840900960ctgggcaggc cccgatcccc ttcgcccccc gagaaggctc agctgccttc cccgcccacg 1140

gcctcggccc tggattatcc cagcgagaac ctggccttca tcgacgagtc ctcggatacg 1200

cagagcgagc gcggctgccc gctgccccgc gcgccgagag gtcgccgccg cccaaatccc 1260

cccaggaagc ccgtgcggcc ccgcggcccc gggcgtcccc gagacaaagg cgtgccggtg 1320

taggggcagg atccctggcc gggcctctca agggcttcgt ttctgctctc cccggcatgc 1380

ctggcttgtt tgaccaaaga gccctctttc cacgagactg aagtctgggg aggaggctac 1440

agttgcctct ccgcctcctc cctggccccg gcccttccct cacttccatc catctctaga 1500

cccccccaag gctttctgtg tcgctgcccc gggcgggtgt atccctcaca gcacctcacg 1560

actgtgcctc aaagcctgca tcaataaatg aaaacggtct gcaccgctgc gggcgtgacg 1620

ctcccggacg cgagtgggtg tggaattgct ttcctcgggc caccgtgggg gcacctctgg 1680

cctcccgtga cccccaggcc gagggtcccc gggcacccag gtcggtcaag tctcggccct 1740

ctcaggcccg cgtctctgcc tggaggagac tgtgtagggt ccggcgtggg gatcagccgg 1800

gatgggctgc gcgtctccag cctctgcaca cacattggcg ggtggggtgc agggagggag 1860

aggcagggga gagagaatgg catctcgcgt ggagggctgt cgtttgaact ctcccagcgc 1920

gagagaccct gccccgcccc cttcctggag cgttgactcc cttctcgtct cgaggcctgt 1980

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tcttccgacc gccaaggctc ggacgaggag agcgtgcata gcgacactcg ggacctgtgg 2100

accacgacca cgctgtccca ggcacagctg aacatgccgc tgtccgaggt ctgcgagggc 2160

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tcgttggacg aggggtacaa ggccagccac aagccggagg aactggacga gcacgcgctg 2280

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atcggcaggg accacttcct gactaaggag ctgcagcgat acatcgaagg gctcaagaag 2580

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<400> 21

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gtggggaaat gtggtgacac ccatttcaca 60

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cagccacaga ggggcccatg gaggtgacag 900

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gagcccatgc tgggacatgc ctcctccaaa 1080

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tcaggctgta tccttctacc tcctgagccc 1800aggggtccca ggcgccctgc agctgtctcc tcggccatcc tgtggggccc cgaggccttg 1860

ccctcacttc agtgcctggg tgctcaggct ttgcccaggt gccaggagaa ggtgtgagca 1920

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cctcccgata cggcaaccac cacggacctg tggggaccaa tgaggaaaga gagaggcagg 2040

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gcttctcagt gggctctatg cttgcctcgt cggagtcacc cctcaggcag tcctgggatc 2220

ctctccttta gacccactgt gccttcccgg cctcccgggc ttctgctggg ggcagaagaa 2280

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ccgcccatcc tgcacacggg gccgctgggc aggtgcccct cacaccccca ggatgtcagt 2640

gctcacctcg agcaaagcgc cccagctcgg ccttgggagg tggtcatgtc cagggggatg 2700

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aacttccctg cctcctccag tctctccatc cctgagctct cggctcctcc tccgtcttca 3120

gggccagggc gtagcgtctg ctctctcggc ctctgcctcc gcttcccacc tcacctggct 3180

tctgtctatg tcagtctccc tctgccaacc tcctagaagg acacttgtga ttacattagg 3240

gctcacccct ttaatccagg ggagcctctc cacttcatga ttttcagcta acttgcttct 3300

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gcagaccctg cgttgccatg tgaggcaggg gtggggtggg gctgagggcg tggctttggt 3720ccctggctgt ccggatgaag taccagagtgcccccaaccc ccgtgtccgg gaccccggtcccttaagata catccagaaa gtcctggccatctgggctgg gctggtgccc ccaggagatgagctggggca gctgcctccc aggggtgggacagctcaggg ggatgcgagg cttcgtggacccacctccaa ggagaggctc ctcagtgtgccccgggcgtc tgagcagtca ttccatgccactctgtgagg gacctccccg gccttcggcggcttcgtccc ttcctgtgag tgacaccagttcagggcaca gggccctggg ggcaccttcccattgcgctc acaccaggat gctggagcagactgggggtg ggaaggtcat ccagtccagactcaaagtgc tggtgccagg cctgaggcctcctgcctgag acctgcccca ggcacccatacctgaggaaa tggctcccca ggtctgtctcctctaggaag aggcagggac tccagggtgtgtggagtaac aaactgtggg tggcgtttgggtgctggcgc tgctgggtca gggctgcccgggctcccgtc tgggcatgtc ctgggtggatcaggggctcc tggatccaaa gcaaatgacaggcagccagt gttggtggag ctgcctctagcctctcacga gaaaagaacc tggggatacccagtggagtt aatctgcaac gtgcacgagggagtgagcaa gagcaagagc gcatggctccgctgctcagt gttcccaggg gtgagaggcctgtgctgatc gcatcctcag tttcttgtccaaggacaccc tccctgcaca tgattgggtgggggatgagg gttgggtgtc catggtgccccgggcctcca cgatgccctg ggctgtgtgcatgccctggg ctgtgtcctt ccctggggatgtgtactccc ctaggaatga gggctgggtg

acgccacagc ccatcccggt gacatgctca 3780

ttgtgtggtc cctgatgtgg agtcctcagt 3840

tgaattggag gtgcagagtc ctgcagagcc 3900

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gatgaaatgg acccctccac acaggcatcc 4320

tcctttcgta tttgttgaga aaaaaagtgg 4380

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cacatggagg agagtgaaag tcagcctgcc 5040

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accgcttcac tggcaagagt cccaggctcc 5340

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tccaagatac cctgggctgt gtcctcccct 5640ggggatgagg gttgggtgtc catggtgccctgggtgtcca tggtgccctg ggctgtgttttcctgggcag gtgcttcctt tctgcacaagcttccctggg ttgcctcttt tctgccatgtagcacatcat tctctcagga taagtagaagctttggaatt gtcttcccca ccctcacctccagcagcgag gtgggtgttg gctgttctctggagagatgc tggtcaaagg gcatgaagtttctgttgcac agcatggtga ctatagttaaatgagatttt aaatgttctc accacaaaatttaccttgtt ttaatcatcc cacaatatagggaatcttca catttgcttt tttgtcaattgagcaataga ctcttcacgg aaccgtgggcaggattccca ggaaaccgtt ccctctttcaaatctgcctg gatgacattc acatgaacggagaatagtca gagaaaagta gccagaaatgaaacacggta acgtaattag aatagtcagaacgggcacat ataggagaaa ccatggtaacgaaatgacat tcacatgaac gggcacataccagagaaaag tagccagaaa tgacattcactaacgtaatt agaatagtca gagaaaagtaatacaggaga aaacacggta acgtaattagtgcaacgtgc ccttgtaaca ccaaatttgagtgattgaga agtaaatgta ttcttttttacccccctctg tgctcttcaa atcaacatcagagccagcac aggctgaggc tgtcagaatgtttctggggt gaagctgcgt gattgagaactaaggactgt gaactctatc cacaagccattaacacactc ttactcccgt gatgtgtgttggatgtgaaa aggcaggaac agttctgaagtctgtgaccg actcccttcc cagtggtaacacgctgttgt ctgtgcactc gctcacactt

tgggctgtgt cctcccctgg ggatgacggt 5700

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atctgtaact tgcttttccc gtgtaagaac acttcttaga gtttgttcaa tgcatgtgtc 7680

tgtgtgaatg attgaaggca tttctaaccc attttaaaga tggctactta ggaccatatg 7740

gatgttgtac tgatgtcatt tgaccacgtc cattgtttcc atcttttggg ctgttcttgt 7800

gtattttact ttccatgtaa cactgtgaca ttgagaattg gtacctacaa cagtctattt 7860

gctttacatt aaatttgtag gct 7883

<210> 22<211> 1072<212> DNA<213> humano<400> 22

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caatgctgtg tggccacggc aaattaatga acatctctga gtttcggtct cctgtctaaa 900

atgaggtgat aatagcttct tgaaggttgt aaggccccaa acatgctgcc tggcacatag 960

atggctaatc aatattttcc tacccttccc ttccttccct tctctggagt tgctacctgt 1020

cttctcctgg ggccttgcaa ataaacttct gaattaaaaa aaaaaaaaaa aa 1072

<210> 23<211> 417<212> DNA<213> humano

<400> 23

acctcccaac caagccctcc agcaaggatt caggagtgcc cctcgggcct cgccatgagg 60

ctcttcctgt cgctcccggt cctggtggtg gttctgtcga tcgtcttgga aggcccagcc 120

ccagcccagg ggaccccaga cgtctccagt gccttggata agctgaagga gtttggaaac 180

acactggagg acaaggctcg ggaactcatc agccgcatca aacagagtga actttctgcc 240

aagatgcggg agtggttttc agagacattt cagaaagtga aggagaaact caagattgac 300

tcatgaggac ctgaagggtg acatccagga ggggcctctg aaatttccca caccccagcg 360

cctgtgctga ggactcccgc catgtggccc caggtgccac caataaaaat cctaccg 417<210> 24<211> 1004<212> DNA<213> humano<400> 24

ttcctcatta aagtttcaca aataaagcac agcaagactt gtctgcagac acacaggagg 60

cacacggaca gcccgtcaac cagagatgga gacgaaggcc agcatggctc tcacagggca 120

gcgcttctca gaacccctgg cccccctcgt gccaaggctg gcctgtgtca ggcctcgccc 180

acgccgcctt atgacaaata gagccggtgc caaggaggtg gctacagagc aggggcaagg 240

aagttatcct catgttctga taatgaccct gcaaatccca ccccaccctc aggcacctcc 300

gtctaaggtg tccggttact ccaggtaagg aggttcccag gagggccgtg ttttccctag 360

ggctgatgaa acttgctccg acaagccagg ccactgggag gcacctcagg atggaaaaga 420

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gcaaagagaa cagcatgatt ctgacagggt tggattttgt ttcaccctcg gaatgagcag 600

acattcaaac acttgcattt tcacggaaat caacaagaga gacagctagc aggacacgag 660

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agaaaatagc tggggttttt tggttcctgg gaggacaaca aagctagaag aaaagaggtg 780

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tcttcactct acccctcacg cttgaggcct cagtttcctc atctgtaaag tggtcataga 900

atatttccaa ataaatctag gtgtcaggtt tcacacattc ccaggaagta tggggaggcg 960

gggcgcagac actcaaacgg acacacagaa accagaggaa gagc 1004<210> 25<211>

2123

<212>

DNA

<213>

humano

<400>

25

tagctgatca tgtgacaatc caagatggcg gtgcccggcg aggcggagga ggaggcgacagtttacctgg tagtgagcgg tatcccctcc gtgttgcgct cggcccattt acggagctattttagccagt tccgagaaga gcgcggcggt ggcttcctct gtttccacta ccggcatcggcctgagcggg cccctccgca ggccgctcct aactctgccc taattcctac cgacccagccgctgagggcc agcttctctc tcagacttcg gccaccgatg tccggcctct ctccactcgagactctactc çaatccagac ccgcacctgc tgctgcgtca tctcggtaag ggggttggctcaagctcaga ggcttattcg catgtactcg ggccgccggt ggctggattc tcacgggacttggctaccgg gtcgctgtct catccgcaga cttcggctac ctacggaggc atcaggtctgggcccctttc ccttcaagac ccggaaggaa ctgcagagtt ggaaggcaga gaatgaagccttcaccctgg ctgacctgaa gcaactgccg gagctgaacc caccagtgct gatgcccagagggaatgtgg ggactcccct gcgggtcttt ttggagttga tccgggcctg ccgcctaccccctcggatca tcacccagct gcagctccag ttccccaaga caggttcctc ccggcgctacggcaatgtgc cttttgagta tgaggactca gagactgtgg agcaggaaga gcttgtgtgtacagcagagg gtgaagaaat accccaagga acctacctgg cagatatacc agccagcccctgtggagagc ctgaggaaga agtggggaag gaagaggaag aagagtctca ctcagatgaggacgatgacc ggggtgagga atgggaacgg catgaagcgc tgcatgagga cgtgaccgggcaggagcgga ccactgagca gctctttgag gaggagattg agctcaagtg ggagaagggtggctctggcc tggtgtttta tactgatgcc cagttctggc aggaggaaga aggagattttgatgaacaga cagccgatga ctgggatgtg gacatgagtg tgtactatga cagagatggtggagacaagg atgcccgaga ctctgtccaa atgcgtctag aacagagact ccgagatggacaggaagatg gctctgtgat cgaacgccag gtgggcacct ttgagcgcca caccaagggcattgggcgga aggtgatgga gcggcagggc tgggctgagg gccagggcct gggctgcaggtgctcagggg tgcctgaggc cctggatagt gatggccaac accccagatg caagcgtggattggggtacc atggagagaa gctacagcca tttgggcaac tgaagaggcc ccgtagaaatggcttggggc tcatctccac catctatgat gagcctctac cccaagacca gacggagtcactgctccgcc gccagccacc caccagcatg aagtttcgga cagacatggc ctttgtgaggggttccagtt gtgcttcaga cagcccctca ttgcctgact gaccgggttg ggggcttcctttcatagcta catgatgaaa accctctgcc ctggcctcat ctaccactga agcagaaagg

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tgccggttct atacctcagg ggcattttta caaaaagccc cctcccgtcc cctccccttg 1800

gatattaggg gtaacgaccg cttgtctttg gtctctaacc ctaatctctg ggcttgccct 1860

ttgcctcctg cagaactttg aaaagctggg ttgagtgagg ctatcagcac agccttcctt 1920

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aggatttgtg gtgcttggaa gagccggcct tgggtgggcc ctccaccgcc tctaccctca 2040

ctgggtggga ctgccagcgg agagtccgcg ggaggtggct tgggtgtgcg acgtcacgga 2100

agaataaaga cgtttactac tgg 2123<210> 26<211> 1276<212> DNA<213> humano<400> 26

ggaatccacc cggggtgtgt ggattcctgc cctgttccca caggacagcc ctcaaccaat 60

ggagacagga acctggagtt aaatgcttct ccctttttca ctgagagaga gacatgcaca 120

gtctgatgca ctttctttcc ttctttcttt ttctttcttt ttttttctta agacagagtc 180

tctctctgtc accaaggctg gagtgcaggg gcacgatctg ggctcactgc cacctccacc 240

tcccgggttc aagcaattct cccacctcag cctcccgagt agctgggatt acaggcacta 300

gttaccacgc ccagctaatt tttgtatttt tagtagagat gcggtttcac catattggtc 360

aggctggtct cagactcctg atctcaggta atctgtctgc ctcagcctcc caaggtgctg 420

gaattacagg catgagccac cacacctggc cgtgatgcac tttctagatg ctgtcctaga 480

gatcacactg tgttaagcct cagttgcctt caatgtggtc atctctacag tataccctta 540

gcttttttct cctccgttac tttcccagac cctcactctg ctccctggat tcacttttcg 600

aaatagtcct cctgctgcaa agtcctgggc acctgcccta ctttcagcat tggaaggggg 660

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cgtgagatcc caggggacgg agcagcccct tctctgcccc agtgcagggc ttggccttag 840

cacacggtca gtctgtgctg gggtgaagtg atgaatgagt gagtggttga gtgataatgc 900

atcatcagat ctgtcttttc cacatgtctc tatctccacc cagaaccagt tttctcatcc 960

acaaatgggc atttgaggct gggtgctcct aaaccctaca aaattcagag ctggcacagt 1020

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ctctaagagt aaaaaggagg cctggcatag ggaaagaaac tcagctcgag catccagaac 1140atccatcttg ctctcaaata cctaatacag gggaccatgt tttctgctat aattggtatt 1200

ggagctggta ccatttatta aaggtaattc agttacaaag cttcaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaa 1276

<210> 27

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<212> DNA

<213> humano

<400> 27

ccctgggatg gaggatctgt ctctctctct ctctctcctt tttttttttt tggtggagat 60

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gcgcgctctg ctccctgcct ttgcctcact ttacgcaact ttccctaact ttcgggcagc 240

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tttttttggg agaaaagcag cttttaggag ctttcttttc gtgccttgtt ggaaagaagc 3 60

agccgtactg agagcccagg tcgttgtttt ttccagctta gaagccatgg cgcacctcca 420

tttttgtgcg ctctcctaat gaggtttttt ttctttcgga cctgttttag tattaattat 480

tgctttattt ttttgaccag ttaacatatt tgagggttat tttatttatt tttcgttttt 540

taacggagga ttttgccttt atttttaatt atttgggatc tgatattttt ctactagtag 600

ataggactct tggtttggac atactacatg gatcagtaaa tacctgggca caggacttca 660

aagcaaacac agattccccc tcccccttaa tatttaagaa ttaaaagatg atgagaaata 720

aggacaaaag ccaagaggag gacagttcgc tacacagcaa tgcatcgagt cactcagcct 780

ctgaagaagc ttcgggttca gactcaggca gtcagtcgga aagtgagcag ggaagtgatc 840

caggaagtgg acatggcagc gagtcgaaca gcagctctga atcttctgag agtcagtcgg 900

aatctgagag cgaatcagca ggttccaaat cccagccagt cctcccagaa gccaaagaga 960

agccagcctc taagaaggaa cggatagctg atgtgaagaa gatgtgggaa gaatatcctg 1020

atgtttatgg ggtcaggcgg tcaaaccgaa gcagacaaga accatcgcga tttaatatta 1080

aggaagaggc aagtagcggg tctgagagtg ggagcccaaa aagaagaggc cagaggcagc 1140

tgaaaaaaca agaaaaatgg aaacaggaac cctcagaaga tgaacaggaa caaggcacca 1200

gtgcagagag tgagccagaa caaaaaaaag taaaagccag aagacctgtc cccagaagaa 1260

cagtgcccaa acctcgtgtt aaaaagcagc cgaagactca gcgtggaaag agaaaaaagc 1320

aagattcttc tgatgaggat gatgatgatg acgaagctcc caaaaggcag actcgtcgaa 1380

gagcggctaa aaacgttagt tacaaagaag atgatgactt tgagactgac tcagatgatc 1440tcattgaaat gactggagaa ggagttgatgaggtcttaga ttcaagactg ggaaagaaagcgattgaagc taatggcgac cctagtggtgtccagtacct catcaagtgg aagggttggtaatccttaca gcaacagaaa gtgaagggccaggacgaaat caaacaatgg ttagggaaaggccaacagga gctggcttca gagttgaatactgtgaagac aagtaaatct acattgggtccggcaccctc aaatgagccc gaatatctatgtagctggga agatgaagcc ctcattggaaacagtaggaa caactcaaaa accatcccaacacgatttgt agctttaaag aaacaacctggagattatca gctagaaggt ctaaactggctaatccttgc tgatgaaatg ggcctaggaaacctgttcca ccaacaccag ctgtatggcctcacctcatg gcagagagag tttgaaatcttaggtgacct gatgagcaga aatacgatacaaagattgaa gttcaacgca cttataacaatgctgggcag tattaactgg gcctttctggatgactcttt attgtataaa actctgattgcggggacccc tcttcagaat tccctcaaagcggagaagtt tgaattttgg gaagattttggctaccagag tcttcataag gtgctagagctggagaaatc ccttcctgct aaagtggaacagaaacagta ttacaagtgg attctgaccagaggcagcac atctggtttt cttaatattggctatctgat taaaccccct gaagaaaatgccctcataag gagcagtggg aagttgatttaaagggggaa tcgagtgctt atcttctctcaatacctaac tattaaacac tatcctttcctccgaaaaca ggcactggac cacttcaatgtctcgacaag ggctggtggc ctgggaatca

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tttcactgtg gatagtttct attgctacct 7200cttcaagttc actaatactt tccttttcaa tgtcaagact gctgtgaggc ccatccagtg 7260

tactttgcat tttatacatt gtagttctaa aagttcggaa agttgttttt gggtcttttt 7320

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tcttgctccc ctggtgcttt ctgtgcctag taatttttgt cagatgccag atgtaacatt 7500

taccttgttg ggtgctggat atttctgtat tcctgtaagt attctggagc tttgttatga 7560

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agaaccagag cagtgctcag tcaagggcta atgattgccc acccccaagg taaagagcct 7 680

cattgcactc tacccaattg cgttagtctg ttttgcagga atacctgagg ctgggtaatt 7740

tatagagaaa agagttttat ttgg 7764<210> 28<211> 3001<212> DNA<213> humano<400> 28

ggcagcgtcc gcgggaggtg aggtggctgt ggggacccag gtggcctctt ccctggggcc 60

ttgctaatga cggcaaaatc cgggttctgc caaaatatat ttaaaaaggt ttattcctag 120

tcagtatgag tgaçtgtggc ccaggttatt cagcctcaag aggtcctgtg aaagtgcccg 180

agatggtcag gcttgcaggt taattttata caattcaggg agacaggaat ttcaggtaaa 240

gtcataaatc aggctgagca gtgtggctca tgcctgtggt cccagcactt tgggaggcca 300

ggagttccag agcagcctgg gcagcacagc aagaccctgt ctctacatga aattagaaaa 360

ataaaaaaat tagcggggcg tggtgtccca tgcctgtggc ctcagctact tgggaggccc 420

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gcctgggtaa cacagcgaga tcctgcctcc aaaaagaaaa tcataaatca ataagagaaa 540

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gtgcagtggc gtgatctcag ctcactgcaa cctccacctc ccaggtttga gcggttctcc 900

tgcctcggcc tcctgggtag ctgggactac gggcgcccgc caccacgcct ggctaatttt 960

tgtattttta gtggagatgg ggtttcacca tgttgctgag gctggtcttg acttcctgac 1020ctcaggtgat ccgcccacct ctacctcccacgcgtcaggc tggctgtctc ttccagaccttacattaatg gagattcgct gcagatgcaatatccatttc aatctgttgc ccctgtggcatttggggtaa aataatttcc ttcagcatctttggaaagtg agcctcatta tataagagtatctcgggcag gattccccaa gcctcatacatttagtcctc accaggttgg tagggcttccattgggccca gcagtttttt taaatgtctcgattttaatc atttcattat ggaaaaattgcagtcaagat atacctcatg accttgcaagatctgtgcag attcattgag gaatgtcatatacagtgaga gttgaaaccc aagctctatccatttaaatg ttttgtgcct gtttcctcatggacagttgt gaagattgaa tgcagaaaaatatattaaat tctaaaaaag tgttaaatatgaagcaccga caggatatgc tgtgtttagtcgatgcccac actcaggatc tgttcccaggctttgggtcc ttttttttta acaagaagagccacctttga ggatcgcaga gctcattttaccactcccac gttacccgtg agaggactgtaggtggggac ttcttatgta ttgccttcctggtttccttt gctaatgtct gacatcttgtcctctcagcc ggttctcatg gggaacgttctccatcattg tccctacatt tcttctctcagcagaccagg tcttgtaaaa aattattcagagggacaggg ctttatagtc attgccctatattggaatcc ccatttcaca gactaagaagcggcttggcg tggtggccca tacctgtaatattacctgag gccaggggtt cgagaccagctgggaataca gaaattagcc aggcatggtggcctgaagca ggataatcgc ttgaatccag

aagtgctggg attacaggcg tgggccaccg 1080

aagaaaggct tagaacaaag gaggtctggc 1140

attttcccac taaagatagc tttgcggggc 1200

gccacttcaa aacatgtcaa agaagtatat 1260

gctgtcatgt gatgctgtac cagagtcagg 1320

ataaaactca tctgatgaga ttttatggtt 1380

taggcatttg ggcaagggaa aaaaggtgaa 1440

tcggttattg gagtgggagt aacagcaacc 1500

tggggctgtg gactgaccat ccaaataact 1560

tcagcagaac ccccaagtag agagacccat 1620

ctaatctagc ttgacccaga tcccctccta 1680

gccatgccta ctggttaaga catagtcctt 1740

actttcttgg ctgtgttgct ttgagaaagg 1800

ctgaaattgg tgggtaatag tcacttcata 1860

tttgtgccac gcctggaacc gtccctggca 1920

tataatgaat atcaacactt ccttattctg 1980

gttagcatca tgtcaggaca gggtctgttg 2040

aacctgcgta aagttttctt ctctggaaga 2100

gctctaccct gggactggga atttccaagg 2160

gagccatttt agtccccagc tcctcttcct 2220

ctgcagggta agggaggaca gcccaacccc 2280

gcagtgcctt ctctgcccta aaccatggtg 2340

gccctacact gtcccatctg aggctcagaa 2400

cccagatctg atgccctcat tcaggacact 2460

gtgctttatt caggctgctg cattcgtggt 2520

tcagcatgtg ctgagccatt gtcctgtccc 2580

tcatctcttc aaccaatgtg gaagttagga 2640

tggcgtgtta atcagttgaa ataattttta 2700

cccagcactt tgggaggccg gggcgggcgg 2760

ctggccaaca tggtgaaacc tcatctctgc 2820

gctcacgcct gtagtcccaa ctgctctgga 2880

gagatggagg ttgcagtgag cagagagcat 2940gccactgcac tacagcctga gcaagagtga gactccgtca caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000

c 3001

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 29

attattcaag gccgagtaca gatg 24

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 30

cacgtacacg atgtgtccct tct 23

<210> 31

<211> 21<212> DNA

<213> humano

<400> 31

caggcggtgt gcctgctgca t 21

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 32

tttgtggtgc ctatttcacc ttt 23

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 33

cggagttcca agctgatggt a 21<210> 34

<211> 22<212> DNA

<213> humano

<400> 34

ccacgtgtac ggcttcggcc tc 22

<210> 35

<211> 15

<212> DNA

<213> humano

<400> 35

ggcggagcgc tacga 15

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 36

ttcattcgag agaggttcat tcag 24

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 37

cctccgctat gaaggcggtg a 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 38

aagccacccc acttctctct aa 22

<210> 39

<211> 2222

26

<212> DNA

<213> humano

<400> 39

aatgctatca cctcccctgt gt<210> 40

<211> 26<212> DNA

<213> humano

<400> 40

agaatggccc agtcctctcc caagtc<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 41

cctgcccact gtgcttcct 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 42

ggttttcccg cttgcagat 19

<210> 43

<211> 15

<212> DNA

<213> humano

<400> 43

ctggcttcac catcg . 15

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> humano<400> 44

tggttggaga gctcatttgg a 21

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 45

actctcgtcg gtgactgttc ag 22

<210> 46

<211> 16

<212> DNA

<213> humano

<400> 46

ttttgccgat ttcatg 16

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 47

cggaagaaga aacagctcat ga 22

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> humano

<400> 48

cctctgtgta tttgtcaatt ttcttctc 28

<210> 49

<211> 17

<212> DNA

<213> humano

<400> 49

cggaaacagg ccgagaa 17<210> 50

<211> 18<212> DNA

<213> humano

<400> 50

cctggcaccc agcacaat 18

<210> 51

<211> 21<212> DNA

<213> humano

<400> 51

gccgatccac acggagtact t 21

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 52

atcaagatca ttgctcctcc tgagcgc 27

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 53

gcctactttc caagcggagc ca 22

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 54

ttgcgggtac ccacgcgaa 19

<210> 55

<211> 29<212> DNA

<213> humano

<400> 55

aacggcaatg cggctgcaac ggcggaatt 29

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> humano

<400> 56

caacctgtca gatacaatag aaggagtaa 29

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 57

gcaaccaggg taatcgcagt a 21

<210> 58

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 58

gcccgatttg gagaaacgac gcatctt 27

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 59

gcagtacgcc ccgaacact 19

<210> 60<211> 24

<212> DNA

<213> humano<400> 60

aaaattgctt gaagatggga ctct 24

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 61

tggagattct gcctcagggc cgt 23

<210> 62<211> 20<212> DNA

<213> humano

<400> 62

ccctggaact catggtctca 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 63

cgagacccca atcaaaacct 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 64

cagggccgcc ctccacacct gtt 23

<210> 65

<211> 15

<212> DNA

<213> humano

<400> 65

ccaccggacg ccatc 1520

<210> 66<211> 20<212> DNA

<213> humano

<400> 66

ttctcgtagc tcgccacact<210> 67

<211> 21<212> DNA

<213> humano

<400> 67

tcccggcggg attctgatgt t 21

<210> 68<211> 17

<212> DNA

<213> humano

<400> 68

gcctccgcta tgaaggc 17

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 69

atcaagatca ttgctcctcc 20

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> humano

<400> 70

tggagattct gcctcag 17

<210> 71

<211> 25<212> DNA

<213> humano

<400> 71

gcccgatttg gagaaacgac gcatc 25

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 72

tgaacagtca ccgacgagag tgctg 25

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 73

gtcccggcgg gattctgatg 20

<210> 74

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 74

aacggcaatg cggctgcaac ggcggaa 27

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 75

gcctccgcta tgaaggcggt ga 22

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> humano<400> 76

cggaaacagg ccgagaatt 19

<210> 77

<211> 18

<212> DNA

<213> humano

<400> 77

ttttgccgat ttcatgtt 18

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 78

caggcggtgt gcctgctgca ttt 23

<210> 79

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 79

gtcccggcgg gattctgatg tt 22

<210> 80<211> 60<212> DNA

<213> humano

<400> 80

aaacgacgca tccactactg cgattaccct ggttgcacaa aagtttatac caagtcttct 60

<210> 81<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 81

catttaaaag ctcacctgag gact 24<210> 82<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 82

catttaaaag ctcacctgag gact 24

<210> 83

<211> 103

<212> DNA

<213> humano

<400> 83

gaattcgccc ttgggctctg tggcaagatc tatatctgga aggggcgaaa agcgaatgag 60

aaggagcggc aagggcgaat tcgtttaaac ctgcaggact agt 103

<210> 84

<211> 59

<212> DNA

<213> humano

<400> 84

gggctctgtg gcaagatcta tatctggaag gggcgaaaag cgaatgagaa ggagcggca 59

<210> 85

<211> 59

<212> DNA

<213> humano

<400> 85

gggctctgtg gcaagatcta tatctggaag gggcgaaaag cgaatgagaa ggagcggca 59

<210> 86<211> 106<212> DNA

<213> humano

<400> 86

gaattcgccc ttccctggca tccgagacag tgccttctcc atggagtcca ttgatgatta 60

cgtgaacgtt ccgaagggcg aattcgttta aacctgcagg actagt 106<210> 87

<211> 60<212> DNA

<213> humano

<400> 87

ccctggcatc cgagacagtg ccttctccat ggagtccatt gatgattacg tgaacgttcc 60

<210> 88<211> 60<212> DNA

<213> humano

<400> 88

ccctggcatc cgagacagtg ccttctccat ggagtccatt gatgattacg tgaacgttcc 60

<210> 89

<211> 123

<212> DNA

<213> humano

<400> 89

gaattcgccc ttccaatcaa aacctccagg tatcttccca gactaggtgt ggagggcggc 60

cctgtgggtg ggaggctgga gcctccagag tgtcctgaga ccatgagttc caagggcgaa 120ttc 123

<210> 90

<211> 60<212> DNA

<213> humano

<400> 90

ccaatcaaaa cctccaggta tcttcccaga ctaggtgtgg agggcggccc tgtgggtggg 60

<210> 91

<211> 60

<212> DNA

<213> humano

<400> 91

ccaatcaaaa cctccaggta tcttcccaga ccaggtgtgg agggcggccc tgtgggtggg 60<210> 92

<211> 45

<212> DNA

<213> humano

<400> 92

aggctggagc ctccagagtg tcctgagacc atgagttcca agggc

<210> 93

<211> 45

<212> DNA

<213> humano

<400> 93

aggctggagc ctccagagtg tcctgagacc atgagttcca ggggc

<210> 94

<211> 17

<212> DNA

<213> humano

<400> 94

ccacgtgtac ggcttcg

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 95

ccacgtgtac ggcttcggcc tc

<210> 96

<211> 15

<212> DNA

<213> humano

<400> 96

ggcggagcgc tacga

<210> 97

<211> 26<212> DNA

<213> humano

<400> 97

ttcattcgag agaggttcat tcagvd

Claims (40)

1. Método de determinar o prognóstico de recorrência do câncerdo cólon Dukes B, compreendendo as etapas dea. obter uma amostra de tumor de um paciente; eb. medir os níveis de expressão na amostra dos genes selecio-nados a partir do conjunto que consiste naqueles codificando o mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 7-28; ouii. reconhecido pelo iniciador e/ou sonda correspondendo apelo menos uma de SEQ ID Nos 29-79 e 94-97; ouiii. identificado pela produção de pelo menos um dos ampli-cons selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93em que os níveis de expressão dos genes acima ou abaixo dosníveis predeterminados de corte são indicativos do prognóstico de recorrên-cia do câncer do cólon Dukes B.

2. Método de determinar o protocolo de tratamento de um paci-ente, compreendendo as etapas dea. obter uma amostra de tumor de um paciente; eb. medir os níveis de expressão na amostra dos genes selecio-nados a partir do conjunto que consiste naqueles codificando o mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 7-28; ouii. reconhecido pelo iniciador e/ou sonda correspondendo apelo menos uma de SEQ ID Nos 29-79 e 94-97; ouiii. identificado pela produção de pelo menos um dos ampli-cons selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93em que os níveis de expressão dos genes acima ou abaixo deníveis predeterminados de corte são suficientemente indicativos do risco derecorrência para capacitar um médico de determinar o grau e o tipo de tera-pia recomendada para prevenir a recorrência.

3. Método de determinar o protocolo de tratamento de um paci-ente, compreendendo as etapas dea. obter uma amostra de tumor de um paciente; eb. medir os níveis de expressão na amostra dos genes selecio-nados a partir do conjunto que consiste naqueles codificando o mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 7-28; ouii. reconhecido pelo iniciador e/ou sonda correspondendo apelo menos uma de SEQ ID Nos 29-79 e 94-97; ouiii. identificado pela produção de pelo menos um dos ampli-cons selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93em que os níveis de expressão dos genes acima ou abaixo deníveis predeterminados de corte são suficientemente indicativos do risco derecorrência para capacitar um médico de determinar o grau e o tipo de tera-pia recomendada para prevenir a recorrência.

4. Método de tratar um paciente, compreendendo as etapas de:a. obter uma amostra de tumor de um paciente; eb. medir os níveis de expressão na amostra dos genes selecio-nados a partir do conjunto que consiste naqueles codificando o mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 7-28; ouii. reconhecido pelo iniciador e/ou sonda correspondendo apelo menos uma de SEQ ID Nos 29-79 e 94-97; ouiii. identificado pela produção de pelo menos um dos ampli-cons selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93 e;c. tratar o paciente com terapia adjuvante se eles forem um pa-ciente de alto risco.

5. Método de tratar um paciente, compreendendo as etapas de:a. obter uma amostra de tumor de um paciente; eb. medir os níveis de expressão na amostra dos genes selecio-nados a partir do conjunto que consiste naqueles codificando o mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 7-28; ouii. reconhecido pelo iniciador e/ou sonda correspondendo apelo menos uma de SEQ ID Nos 29-79 e 94-97; ouiii. identificado pela produção de pelo menos um dos ampli-cons selecionados a partir de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93 e;c. tratar o paciente com terapia adjuvante se eles forem um pa-ciente de alto risco.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a amostra é obtida de um tumor primário.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 4, em que apreparação é obtida a partir de uma biopsia ou uma amostra cirúrgica.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,adicionalmente compreendendo medir o nível de expressão de pelo menosum gene constitutivamente expresso na amostra.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a especificidade é pelo menos cerca de 40%.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a sensibilidade é pelo menos cerca de 90%.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que o padrão de expressão dos genes é comparado a um padrão de ex-pressão indicativo de um paciente com recorrência.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a compa-ração dos padrões de expressão é conduzida com métodos de reconheci-mento de padrões.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os méto-dos de reconhecimento de padrões incluem o uso de uma análise de riscoproporcional de Cox.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que os níveis predeterminados de corte são pelo menos uma super- ousubexpressão de 1,5 vez na amostra em relação às células benignas ou aotecido normal.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5em que os níveis predeterminados de corte têm pelo menos uma super- ousubexpressão com p-valor estatisticamente significativo na amostra tendocélulas metastáticas em relação às células benignas ou ao tecido normal.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o valor ρé menor do que 0,05.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -5, emque a expressão do gene é medida em um microarranjo ou fragmento de gene.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o microar-ranjo é um arranjo de cDNA ou um arranjo de oligonucleotídeo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o microar-ranjo ou fragmento de gene adicionalmente compreende um ou mais rea-gentes de controle internos.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a expressão do gene é determinada por amplificação de ácido nu-cléico conduzida pela reação em cadeia por polimerase (PCR) do RNA ex-traído da amostra.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a ditaPCR é a transcrição reversa e reação em cadeia por polimerase (RT-PCR).

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a RT-PCR adicionalmente compreende um ou mais reagentes de controle internos.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a expressão do gene é detectada por medição ou detecção de umaproteína codificada pelo gene.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a proteínaé detectada por um anticorpo específico para a proteína.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a expressão do gene é detectada por medição de uma característicado gene.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a caracte-rística medida é selecionada a partir do conjunto que consiste em amplifica-ção de DNA, metilação, mutação e variação alélica.

27. Composição compreendendo pelo menos uma série de son-das selecionada a partir do conjunto consistindo nas SEQ ID NOs: 29-79.

28. Kit para conduzir um ensaio para determinar o prognósticode recorrência do câncer do cólon Dukes B em uma amostra biológica com-preendendo: materiais para detectar seqüências de ácidos nucléicos isola-das, seus complementos, ou suas porções de uma combinação de genesselecionados a partir do conjunto consistindo naqueles codificando o mRNAcorrespondendo às SEQ ID NOs: 7-28.

29. Kit de acordo com a reivindicação 28, adicionalmente com-preendendo reagentes para conduzir uma análise de um microarranjo.

30. Kit de acordo com a reivindicação 28, adicionalmente com-preendendo um meio através do qual são testadas as ditas seqüências deácidos nucléicos, os seus complementos, ou as suas porções.

31. Artigos para avaliar o status compreendendo: materiais para de-tectar seqüências de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos, ou suasporções de uma combinação de genes selecionados a partir do conjunto consis-tindo naqueles codificando o mRNA correspondendo às SEQ ID NOs: 7-28.

32. Artigos de acordo com a reivindicação 31, adicionalmentecompreendendo reagentes para conduzir uma análise de um microarranjo.

33. Artigos de acordo com a reivindicação 31, adicionalmentecompreendendo um meio através do qual são testadas as ditas seqüênciasde ácidos nucléicos, os seus complementos, ou as suas porções.

34. Microarranjo ou fragmento de gene para efetuar o método decomo definido em qualquer uma das reivindicações 1-5.

35. Microarranjo de acordo com a reivindicação 34, compreendendoseqüências de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos, ou suas porçõesde uma combinação de genes selecionados a partir do conjunto consistindonaqueles codificando o mRNA correspondendo às SEQ ID NOs: 7-28.

36. Microarranjo de acordo com a reivindicação 35, em que asseqüências são selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 29-79 e 94-97.

37. Microarranjo de acordo com a reivindicação 35, compreen-dendo um arranjo de cDNA ou um arranjo de oligonucleotídeo.

38. Microarranjo de acordo com a reivindicação 35, adicional-mente compreendendo ou mais reagentes de controle internos.

39. Portfólio diagnóstico/prognóstico compreendendo seqüên-cias de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos, ou suas porções deuma combinação de genes selecionados a partir do conjunto consistindonaqueles codificando o mRNA correspondendo às SEQ ID NOs: 7-28.

40. Portfólio de acordo com a reivindicação 39, em que as se-qüências são selecionadas a partir de SEQ ID NOs: 29-79 e 94-97.