KR20190026769A - 유전자 발현 프로파일을 사용하여 폐암을 진단하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
질환에 특징적인 대상체의 혈액으로부터 선택된 10개 이상의 유전자, 예를 들어, 유전자 발현 프로파일을 사용하여 포유동물 대상체에서 폐암을 진단하는 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 유전자 발현 프로파일은 본 명세서의 표 I 또는 표 II의 10개 이상의 유전자를 포함한다.
Description
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원이 수여한 과제 번호 CA010815에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리가 있다.
폐암은 암 사망률의 가장 흔한 전세계적인 원인이다. 미국에서는, 폐암이 남녀 모두에서 두 번째로 가장 널리 퍼진 암이며, 연간 174,000건이 넘는 신규 사례가 발생하고 162,000건이 넘는 암 사망에 이른다. 사실상, 폐암은 유방암, 전립선암 및 결장직장암을 합한 것보다 매년 더 많은 사망을 일으킨다.
지난 30년간 거의 또는 전혀 개선을 나타내지 않았던 높은 사망률 (5년 내 80-85%)은 국소 결절로 또는 폐를 넘어 전이되기 전에 조기 진단을 용이하게 하는 새롭고 효과적인 도구가 필요하다는 사실을 강조한다.
고위험 모집단은 흡연자, 과거의 흡연자, 및 유전적 소인과 관련된 마커를 지닌 개체를 포함한다. 초기 단계 종양의 외과적 제거가 여전히 폐암의 가장 효과적인 치료이기 때문에, 저용량 나선형 CT (LDCT)로 고위험 환자를 선별하는 것은 대단히 관심이 많았다. 이러한 전략으로 고위험 개체의 대략 30-70%에서 비-석회화 폐 결절이 식별되지만 검출된 결절의 적은 비율만이 궁극적으로 폐암으로 진단된다 (0.4 내지 2.7%). 현재, 악성 결절을 지닌 대상체로부터 양성 병인의 폐 결절을 지닌 대상체를 구별하는 유일한 방법은 침습성 생검, 수술, 또는 반복된 스캐닝을 통한 지속적 관찰이다. 최상의 임상 알고리즘을 사용하더라도, 불확실한 폐 결절에 대한 외과적 폐 생검을 받도록 선택된 환자의 20-55%는 양성 질환을 갖는 것으로 밝혀지며, 즉각적인 생검 또는 절제를 받지 않은 환자는 순차적인 영상 연구가 필요하다. 이 그룹의 환자에서 연속 CT를 사용하면 반복 스캔 비용, 무의미하지 않은 방사선량 및 환자의 불안과 함께 잠재적인 치료 가능 요법을 지연시킬 위험이 있다.
이상적으로, 진단 검사는 쉽게 접근 가능하고, 저렴하고, 높은 감도 및 특이도를 보이며, 개선된 환자 결과 (의료적으로 및 재정적으로)를 초래할 것이다. 다른 것은 상피 세포를 이용하는 분류기(classifier)가 높은 정확도를 갖는다는 것을 보여주었다. 그러나, 이러한 세포의 수거는 침습성 기관지 내시경 검사를 필요로 한다. 하기를 참조한다: Silvestri 등, N Engl J Med. 2015 July 16; 373(3): 243-251 (이는 본 명세서에 참고로 편입됨).
가래, 혈액 또는 혈청을 사용하는 비-침습성 진단법을 개발하고, 종양 세포 산물, 메틸화된 종양 DNA, 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNPs) 발현된 메신저 RNA 또는 단백질을 분석하려는 노력이 진행되고 있다. 폐암의 조기 진단을 위한 잠재적인 유용성을 가진 이러한 광범위한 분자 시험이 문헌에서 논의되었다. 각각의 이러한 접근법은 고유의 장점이 있지만, 고위험군 또는 방사선학 및 기타 임상적 요인에 기초한 예비 진단을 받은 환자조차도 초기 단계의 폐암 환자를 찾으려는 노력에서 아직 탐색 단계를 통과하지 못했다. 정기적인 임상 연구실 방문과 관련된 일상적인 사건인, 단순 혈액 검사는 이상적 진단 검사일 것이다.
일 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암을 진단 또는 평가하기 위한 조성물 및 키트는 열 (10) 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 환자 샘플에서 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 각각의 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물은 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 검출가능한 표지에 부착된다. 일 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 표 I의 559개 유전자 각각의 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물을 검출하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 표 II의 100개 유전자 각각의 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물을 검출하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암을 진단 또는 평가하기 위한 조성물 및 키트는 열 (10) 개 이상의 리간드를 포함하며, 상기 각각의 리간드는 환자 샘플에서 상이한 유전자 발현 산물에 혼성화된다. 각각의 유전자 발현 산물은 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 검출가능한 표지에 부착된다. 일 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 표 I의 559개 유전자 각각의 발현 산물을 검출하는 리간드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 표 II의 100개 유전자 각각의 발현 산물을 검출하는 리간드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물은 기준 유전자 발현 프로파일의 것으로부터 대상체의 유전자 발현 프로파일의 유전자의 발현 변화를 검출할 수 있게 한다. 다양한 기준 유전자 발현 프로파일은 아래에 기재되어 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 비-암성 결절로부터 암성 종양을 구별하는 능력을 제공한다.
또 다른 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암을 진단 또는 평가하는 방법은 대상체의 샘플에서 3개 이상의 유전자의 발현의 변화를 식별하는 단계 (상기 유전자는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택됨), 대상체의 유전자 발현 수준을 기준 또는 대조군의 동일한 유전자의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 발현의 발현 변화는 폐암의 진단 또는 평가와 관련이 있다. 일 구현예에서, 상기 유전자 발현의 발현 변화는 비-암성 결절로부터 암성 종양을 구별하는 능력을 제공한다.
또 다른 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암을 진단 또는 평가하는 방법은 대상체의 혈액에서 유전자 발현 프로파일을 식별하는 단계를 포함하며, 상기 유전자 발현 프로파일은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 10개 이상의 유익한 유전자(informative gene)의 10개 이상의 유전자 발현 산물을 포함한다. 10개 이상의 유익한 유전자는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 559개 유전자 모두를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 II의 100개 유전자 모두를 함유한다. 상기 대상체의 유전자 발현 프로파일은 아래 기재된 다양한 공급원으로부터의 기준 유전자 발현 프로파일과 비교된다. 유익한 유전자의 발현 변화는 폐암의 진단 또는 평가와 관련이 있다. 일 구현예에서, 상기 유전자 발현의 발현 변화는 비-암성 결절로부터 암성 종양을 구별하는 능력을 제공한다.
또 다른 양태에서, 환자에서 폐암을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자로부터 샘플을 수득하는 단계; 및 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 폐암을 진단하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계; 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물 각각에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계; 및 기준의 것으로부터 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 대상체를 진단하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 신생물 성장을 갖는 대상체에서 폐암을 진단 및 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계; 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물 각각에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계; 기준의 것으로부터 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 대상체를 진단하는 단계; 및 신생물 성장을 제거하는 단계를 포함한다. 다른 적절한 치료법이 또한 제공될 수 있다.
이러한 조성물 및 방법의 다른 양태 및 이점은 하기 바람직한 구현예의 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
도 1은 실시예 1에 사용된 샘플에 대한 환자 특징을 나타내는 표이다.
도 2a 및 2b는 559개의 분류기를 사용하여, 모든 610개 샘플의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM) (도 2a, 정확도 = 0.75, ROC 면적 = 0.81. 곡선에 따르면, 감도가 0.91일 때, 특이도는 0.46이며; 감도가 0.72일 때, 특이도는 0.77임) 및 556개 샘플의 균형을 이룬 세트 (도 2b, 정확도 = 0.76, ROC 면적 = 0.81, 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.48이며; 감도가 0.76일 때, 특이도는 0.77임)를 나타내는 그래프이다. 전체 및 균형을 이룬 세트는 유사한 성능을 나타낸다.
도 3은 결절 크기 그룹 (x-축) 별로 분류기의 감도를 나타내는 막대그래프이다. 데이터는 결절이 클수록 잘못 분류될 가능성이 높다는 것을 보여준다 (p=1.54*10-4).
도 4a 내지 4c는 병변 크기별로 계층화된 샘플 그룹의 분류 (암, 도 4b, n=204; 및 결절, 도 4c, n=331)를 나타낸다. >5mm 이상의 암에 대해, r=0.95이다. 모든 크기의 결절에 대해, r=0.97이다. 차트 (도 4a)는 병변 크기에 기초한 암 및 결절 분류의 감도 및 특이도를 나타낸다. 이들 숫자는 아래에서 막대그래프 형태로 보여준다.
도 5a 및 5b는 모든 암 샘플 (n=278) 대 작은 결절 (<10mm) (n=244)의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM) (도 5a, 정확도 = 0.79, ROC 면적 = 0.85. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.54이고; 감도가 0.77일 때, 특이도는 0.82임) 및 모든 암 샘플 (n=278) 대 큰 결절 (≥10mm) (n=88)을 사용한 10-배 CV SVM (도 5b, 정확도 = 0.76, ROC 면적 = 0.71. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.24이고; 감도가 0.87일 때, 특이도는 0.42임)을 나타내는 그래프이다.
도 6은 100개 분류기에 대한 시험 세트로서 사용된, 559개 분류기에 대해 사용된 데이터 세트의 25%의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM)를 나타내는 그래프이다. ROC 면적 = 0.82. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.62이며; 감도가 0.79일 때, 특이도는 0.68이고; 감도가 0.71일 때, 특이도는 0.75이다.
도 2a 및 2b는 559개의 분류기를 사용하여, 모든 610개 샘플의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM) (도 2a, 정확도 = 0.75, ROC 면적 = 0.81. 곡선에 따르면, 감도가 0.91일 때, 특이도는 0.46이며; 감도가 0.72일 때, 특이도는 0.77임) 및 556개 샘플의 균형을 이룬 세트 (도 2b, 정확도 = 0.76, ROC 면적 = 0.81, 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.48이며; 감도가 0.76일 때, 특이도는 0.77임)를 나타내는 그래프이다. 전체 및 균형을 이룬 세트는 유사한 성능을 나타낸다.
도 3은 결절 크기 그룹 (x-축) 별로 분류기의 감도를 나타내는 막대그래프이다. 데이터는 결절이 클수록 잘못 분류될 가능성이 높다는 것을 보여준다 (p=1.54*10-4).
도 4a 내지 4c는 병변 크기별로 계층화된 샘플 그룹의 분류 (암, 도 4b, n=204; 및 결절, 도 4c, n=331)를 나타낸다. >5mm 이상의 암에 대해, r=0.95이다. 모든 크기의 결절에 대해, r=0.97이다. 차트 (도 4a)는 병변 크기에 기초한 암 및 결절 분류의 감도 및 특이도를 나타낸다. 이들 숫자는 아래에서 막대그래프 형태로 보여준다.
도 5a 및 5b는 모든 암 샘플 (n=278) 대 작은 결절 (<10mm) (n=244)의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM) (도 5a, 정확도 = 0.79, ROC 면적 = 0.85. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.54이고; 감도가 0.77일 때, 특이도는 0.82임) 및 모든 암 샘플 (n=278) 대 큰 결절 (≥10mm) (n=88)을 사용한 10-배 CV SVM (도 5b, 정확도 = 0.76, ROC 면적 = 0.71. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.24이고; 감도가 0.87일 때, 특이도는 0.42임)을 나타내는 그래프이다.
도 6은 100개 분류기에 대한 시험 세트로서 사용된, 559개 분류기에 대해 사용된 데이터 세트의 25%의 교차 검증된 서포트 벡터 머신 분류기 (CV SVM)를 나타내는 그래프이다. ROC 면적 = 0.82. 곡선에 따르면, 감도가 0.90일 때, 특이도는 0.62이며; 감도가 0.79일 때, 특이도는 0.68이고; 감도가 0.71일 때, 특이도는 0.75이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 폐암의 검출 및 진단을 위한 혈액 선별에 유전자 발현 기술을 적용한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 포유동물, 바람직하게는 인간, 대상체의 혈액 유전자의 특징적인 RNA 발현 프로파일을 결정함으로써 비-암성 결절로부터 암성 종양을 구별하는 능력을 제공한다. 상기 프로파일을 동일한 부류의 하나 이상의 대상체 (예를 들어, 폐암 또는 비-암성 결절을 갖는 환자) 또는 대조군의 프로파일과 비교하여 유용한 진단을 제공한다.
이러한 폐암 선별 방법은 전립선 특이적 항원이 전립선암의 진단을 돕고, 전립선암의 진행을 추적하는 방식과 같이 흉부 방사선 사진 또는 CT 스캔과 같은 추가의 연구를 얻기 위해 환자 및 의사에게 경보를 발할 수 있는 유전자 발현 프로파일링을 사용하는 단순하고 비용-효율적이며, 비-침습성 혈액 검사를 수행하기에 적합한 조성물을 이용한다. 이러한 프로파일의 적용은 악성 대 비-악성 질환에 대한 초기 검사로 시작하여, 폐 질환 유형의 중복적 및 확증적 진단을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "환자" 또는 "대상체"는 인간, 수의과 또는 농장 동물, 가축 또는 애완동물, 및 임상 연구에 일반적으로 사용되는 동물을 포함하는 포유동물을 의미한다. 일 구현예에서, 이러한 방법 및 조성물의 대상은 인간이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "대조군" 또는 "대조 대상체"는 기준 유전자 발현 프로파일의 공급원, 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 특정한 대조 대상체 패널을 지칭한다. 일 구현예에서, 대조 또는 기준 수준은 단일 대상체로부터 유래한다. 또 다른 구현예에서, 상기 대조 또는 기준 수준은 특정한 특징을 공유하는 개체의 집단으로부터 유래한다. 또 다른 구현예에서, 상기 대조 또는 참조 수준은 시험 대상체의 샘플을 분석할 때 반드시 측정되는 것은 아니지만, 특정 대조 개체 또는 집단의 수준과 관련이 있는 할당된 값이다. 일 구현예에서, 상기 대조 대상체 또는 기준은 비-암성 결절을 갖는 환자 (또는 집단)로부터 유래한다. 또 다른 구현예에서, 상기 대조 대상체 또는 기준은 암성 종양을 갖는 환자 (또는 집단)로부터 유래한다. 다른 구현예에서, 상기 대조 대상체는 폐암을 갖는 대상체 또는 집단, 예컨대 악성 질환을 갖는 현재 또는 과거 흡연자인 대상체, 고체 폐 종양의 제거 수술 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; 고체 폐 종양의 외과적 제거 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체; 고체 폐 종양을 위한 요법 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; 및 고체 폐 종양을 위한 요법 중 또는 요법 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 목적을 위한 대조군은 폐암이 없는 임의의 하기 부류의 기준 인간 대상체를 포함한다. 그와 같은 비-건강 대조군 (NHC)은 비-악성 질환을 갖는 흡연자, 비-악성 질환을 갖는 과거 흡연자 (폐 결절을 갖는 환자 포함), 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 갖는 비-흡연자, 및 COPD를 갖는 과거 흡연자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 대조 대상체는 질환이 없는 건강한 비-흡연자 또는 질환이 없는 건강한 흡연자이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "샘플"은 면역 세포 및/또는 암 세포를 함유하는 임의의 생체액 또는 생체 조직을 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 가장 적합한 샘플은 전혈을 포함한다. 다른 유용한 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 말초혈 단핵 세포, 혈장, 타액, 소변, 활막 유체, 골수, 뇌척수액, 질 점액, 자궁경부 점액, 비강 분비물, 가래, 정액, 양수, 기관지내시경 샘플, 기관지폐포 세척액, 및 암 환자로부터의 기타 세포 삼출물을 포함한다. 그와 같은 샘플은 염수, 완충액 또는 생리적으로 허용가능한 희석제로 추가로 희석될 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 샘플은 종래의 수단에 의해 농축된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 설명한다. 더 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 임의의 폐암을 의미한다. 일 구현예에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암 (NSCLC)이다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 폐암은 폐 선암종 (AC 또는 LAC)이다. 또 다른 더 구체적인 구현예에서, 상기 폐암은 폐 편평상피 세포 암종 (SCC 또는 LSCC)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 폐암은 I기 또는 II기 NSCLC이다. 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 폐암은 NSCLC의 초기 및 후기 단계 및 유형의 혼합물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 악성 또는 양성의 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "결절"은 양성인 조직의 비정상적인 발생을 지칭한다. 용어 "암성 종양"은 악성 종양을 지칭한다.
"진단" 또는 "평가"는 폐암의 진단, 폐암의 단계 진단, 폐암의 유형 또는 분류의 진단, 폐암 재발의 진단 또는 검출, 폐암 퇴행의 진단 또는 검출, 폐암의 예후, 또는 외과적 또는 비-외과적 요법에 대한 폐암의 반응 평가를 의미한다. 일 구현예에서, "진단" 또는 "평가"는 암성 종양과 양성 폐 결절 사이를 구별하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감도" (또한 소위 진양성률(true positive rate))는 그와 같이 정확하게 식별된 양성의 비율 (예를 들어, 병태를 갖는 것으로 정확하게 식별된 병자의 백분율)을 측정한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "특이도" (또한 소위 진음성률(true negative rate))은 그와 같이 정확하게 식별된 음성의 비율 (예를 들어, 병태를 갖지 않는 것으로 정확하게 식별된 건강한 사람의 백분율)을 측정한다.
"발현 변화"는 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 상향조절; 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 하향조절; 또는 특정 상향조절된 유전자 및 하향 조절된 유전자의 조합을 의미한다.
"치료 시약" 또는 "레지멘"은, 비제한적으로, 화학요법 의약품, 생물학적 반응 조절제, 방사선, 다이어트, 비타민 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 외과적 절제, 등을 포함하는 고형 종양이 있거나 없는 암의 치료에 이용된 임의의 유형의 치료를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유익한 유전자"는 폐암의 존재 하에 발현이 특징적으로 (상향조절된 또는 하향조절된 방식으로) 변화하는 유전자를 의미한다. 따라서 통계적으로 유효한 수의 그와 같은 유익한 유전자는 본 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 유전자 발현 프로파일을 형성한다. 그와 같은 유전자는 아래 표 I 및 표 II에서 보여준다. 그와 같은 유전자는 "발현 프로파일"을 구성한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "통계적으로 유효한 수의 유전자"는 관측된 유전자 발현의 변화 정도에 따라 달라진다. 유전자 발현의 변화 정도는 암의 유형 및 암 또는 고형 종양의 크기 또는 확산에 따라 달라진다. 상기 변화 정도는 또한 개체의 면역 반응에 따라 달라지며, 각 개체마다 다르다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 소수의 유전자, 예를 들어, 약 10 내지 20개 유전자에서 큰 변화, 예를 들어, 2-3배 증가 또는 감소가 통계적으로 유효하다. 또 다른 구현예에서, 15개 이상의 유전자에서 더 작은 상대적 변화가 통계적으로 유효하다.
따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 단일 프로파일에서 5 내지 약 559개 유전자 범위의 "통계적으로 유효한 수의 유전자"의 발현 프로파일의 검사를 고려한다. 일 구현예에서, 상기 유전자는 표 I로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자는 표 II로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 5개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 일 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 10개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 15개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 20개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 25개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 30개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 35개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 40개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 45개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 50개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 60개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 65개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 70개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 75개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 80개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 85개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 90개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 95개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 100개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 200개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 300개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 통계적으로 유효한 350개 이상의 유전자 수에 의해 형성된다. 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 400개 이상의 유전자에 의해 형성된다. 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 539개의 유전자에 의해 형성된다. 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 559개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 이들 방법의 일부로서 검사된 상기 유전자 프로파일은, 통계적으로 유효한 수의 유전자로서, 10 내지 559개의 유전자, 및 이들 사이의 임의의 수를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 표 I의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558개, 또는 모든 559개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 프로파일은 표 II의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99개, 또는 모든 100개의 유전자에 의해 형성된다.
아래 표 I 및 표 II는 폐암, 예를 들어, NSCLC를 갖는 대상체와 양성 (비-악성) 폐 결절을 갖는 대상체를 식별하는데 유용한 공지된 유전자의 집합체를 지칭한다. 표 I 및 표 II에서 식별된 유전자 서열은 공개적으로 이용가능하다. 당해 분야의 숙련가는, 모두 유전자은행(GenBank)과 같은 종래의 공급원으로부터 공개적으로 이용가능한 유전자 서열을 사용하여 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 쉽게 재현할 수 있다. 각각의 유전자에 대한 유전자은행 수탁 번호가 제공된다.
용어 "마이크로어레이"는 기재(substrate) 상에 혼성화가능한 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 정렬된 배열을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는, 단수 또는 복수 형태로 사용될 때, 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 폴리뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일가닥 또는, 더욱 전형적으로, 이중-가닥일 수 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 그와 같은 영역의 가닥은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터 유래할 수 있다. 상기 영역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 더욱 전형적으로 일부 분자의 영역만을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 하나는 종종 올리고뉴클레오타이드이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 구체적으로 cDNA를 포함한다. 상기 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA (cDNA 포함) 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 백본이 변형된 DNA 또는 RNA는 그 용어가 본 명세서에서 의도된 바와 같이 "폴리뉴클레오타이드"이다. 또한, 드문 염기, 예컨대 이노신, 또는 변형된 염기, 예컨대 삼중화 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA도 본 명세서에서 정의된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 내에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 비변형된 폴리뉴클레오타이드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 단순 및 복합 세포를 포함하여, 바이러스 및 세포에 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 비제한적으로, 단일가닥 데옥시리보뉴클레오타이드, 단일- 또는 이중-가닥 리보뉴클레오타이드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중-가닥 DNA를 포함하는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 단일가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오타이드는 종종 예를 들어 상업적으로 입수가능한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 화학적 방법에 의해 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드는 시험관내 재조합 DNA-매개된 기술 및 세포 및 유기체에서 DNA의 발현을 포함하는 다양한 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
상호교환적으로 사용되는, 용어들 "차별적으로 발현된 유전자", "차별적인 유전자 발현" 및 그것의 동의어는 대조 대상체, 예컨대 양성 결절을 갖는 대상체에서 그것의 발현에 비해, 질환, 구체적으로 폐암과 같은 암을 앓고 있는 대상체에서 더 높거나 더 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 지칭한다. 상기 용어는 또한 동일한 질환의 상이한 단계에서 더 높거나 더 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 포함한다. 또한, 차별적으로 발현된 유전자가 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화 또는 억제될 수 있거나, 또는 대안적인 스플라이싱을 거쳐 상이한 폴리펩타이드 산물을 생성할 수 있음이 이해된다. 그와 같은 차이는 예를 들어, mRNA 수준 변화, 표면 발현, 분비 또는 폴리펩타이드의 다른 분할(partitioning)에 의해 입증될 수 있다. 차별적인 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 또는 그것의 유전자 산물 간의 발현 비교, 또는 2개 이상의 유전자 또는 그것의 유전자 산물 간의 발현 비율의 비교, 또는 심지어 정상 대상체, 비-건강 대조군 및 질환, 구체적으로 암을 앓고 있는 대상체 간에, 또는 동일한 질환의 다양한 단계 간에 상이한, 동일한 유전자의 2가지 상이하게 처리된 산물의 비교를 포함할 수 있다. 차별적인 발현은 예를 들어, 정상 및 이환 세포 사이에, 또는 상이한 질환 사건 또는 질환 단계를 겪은 세포 사이에서 유전자 또는 그것의 발현 산물의 일시적 또는 세포 발현 패턴의 정량적, 뿐만 아니라 정성적 차이 모두를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "차별적인 유전자 발현"은 대상체 및 대조군 샘플 간의 유전자 발현의 통계적으로 유효한 (p<0.05) 차이가 있을 때 존재하는 것으로 간주된다.
RNA 전사체와 관련하여 용어 "과발현"은 시료에서 측정된 모든 전사체 또는 mRNA의 특정 기준 세트일 수 있는, 기준 mRNA의 수준에 대한 정규화에 의해 결정된 전사체의 수준을 지칭하는데 사용된다.
어구 "유전자 증폭"은 유전자 또는 유전자 분절의 다중 복제물이 특정 세포 또는 세포주에서 형성되는 과정을 지칭한다. 복제된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치)은 종종 "앰플리콘"으로 지칭된다. 일반적으로, 생성된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉, 유전자 발현 수준은 또한 발현된 특정 유전자로 제조된 복제물의 수의 비율로 증가한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 맥락에서, 표 I 또는 표 II에 열거된 유전자의 "10개 이상", "적어도 10개" 등에 대한 언급은 열거된 유전자의 어느 하나 또는 임의의 및 모든 조합을 의미한다. 예를 들어, 적합한 유전자 발현 프로파일은 표 I의 적어도 5 내지 559개 유전자 사이의 임의의 수를 함유하는 프로파일을 포함한다. 또 다른 예로, 적합한 유전자 발현 프로파일은 표 II의 적어도 5 내지 100개 유전자 사이의 임의의 수를 함유하는 프로파일을 포함한다. 일 구현예에서, 표로부터 선택된 유전자에 의해 형성된 유전자 프로파일은 순위 순서로 사용되며, 예를 들어, 목록의 상단에 순위가 매겨진 유전자는 검사에서 더 상당히 차별적인 결과를 나타내므로 더 낮은 순위의 유전자보다 프로파일에서 더 유의미할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서는 유용한 유전자 프로파일을 형성하는 유전자가 순위 순서일 필요는 없으며, 표로부터의 임의의 유전자일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "100개 분류기" 또는 "100개 마이오마커 분류기"는 표 II의 100개 유전자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "559개 분류기" 또는 "559개 마이오마커 분류기"는 표 I의 559개 분류기를 지칭한다. 그러나, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 표 I 또는 표 II의 유전자의 서브셋도 유용하며, 또 다른 구현예에서, 상기 용어는 이들 서브셋을 지칭할도 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표지" 또는 "리포터 분자"는 핵산 (단일 뉴클레오타이드 포함), 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 또는 단백질 리간드, 예를 들어, 아미노산 또는 항체를 표지하는데 유용한 화학적 또는 생화학적 모이어티이다. "표지" 및 "리포터 분자"는 형광 제제, 화학발광 제제, 발색 제제, 켄칭제, 방사선뉴클레오타이드, 효소, 기재, 보조인자, 억제제, 자분(magnetic particle), 및 당업계에 공지된 다른 모이어티를 포함한다. "표지" 또는 "리포터 분자"는 측정가능한 신호를 생성할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 (예를 들어, 비-천연 뉴클레오타이드) 또는 리간드에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결 또는 결합될 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 공개된 텍스트를 참조하여, 당해 분야의 숙련가에게 본원에 사용되는 많은 용어들에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.
I. 유전자 발현 프로파일
본 발명자들은 폐암 환자의 전혈의 유전자 발현 프로파일이 비-암성 폐 결절을 갖는 환자에서 관찰되는 것과 상당히 다르다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 표 I 및/또는 표 II의 유전자의 유전자 발현 산물의 변화는 초기 단계 고체 폐 종양을 갖는 환자의 정상 순환 혈액에서 본 발명의 방법에 의해 관측되고 검출될 수 있다.
본 명세서에 기재된 유전자 발현 프로파일은 폐암의 조기 검출을 위한 신규한 진단 마커를 제공하며, 환자가 양성 결절에 대한 수술 또는 생검과 관련된 불필요한 절차를 겪는 것을 막을 수 있다. 위험이 매우 낮기 때문에, 위험 대비 이익 비가 매우 높다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 의사가 폐 결절이 있는 환자를 관리하는 방법에 관해 보다 정확한 결정을 내리는 것을 돕기 위해 임상 위험 인자와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 이점은 진단이 초기 단계 폐암에서 단지 소멸하는 작은 수로 존재하는 순환 종양 세포를 검출하는 것에 의존적이지 않으므로 조기에 진단될 수 있다는 것이다.
일 양태에서, 포유동물 대상체에서 결절을 암성 또는 양성으로 분류하기 위한 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 10개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 mRNA에 혼성화된다.
[표 I]
[표 II]
일 구현예에서, 신규한 유전자 발현 프로파일 또는 시그니처(signature)는 암성 종양을 갖는 환자를 양성 결절을 갖는 환자로부터 식별하고 구별할 수 있다. 예를 들어 적합한 유전자 발현 프로파일을 형성할 수 있는 표 I 및 표 II에 식별된 유전자를 참조한다. 또 다른 구현예에서, 표 I의 유전자의 일부는 적합한 프로파일을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 표 II의 유전자의 일부는 적합한 프로파일을 형성한다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 이들 프로파일은 아래에 예시된 바와 같이 유전자 발현 프로파일의 차이에 기초한 판별 스코어를 생성함으로써 암성 및 비-암성 종양을 구별하는데 사용된다. 이러한 시그니처의 유효성은 폐 결절이 진단되지 않은 환자 집단에서 상이한 그룹에 의해 상이한 위치에서 수집된 샘플에서 확립되었다. 실시예 7 및 도 2a-2b 및 도 6을 참조한다. 본 명세서에서 식별된 폐암 시그니처 또는 유전자 발현 프로파일 (즉, 표 I 또는 표 II)은 필요한 유전자 발현 산물의 수를 감소시키고 진단의 정확도를 증가시키기 위해 추가로 최적화될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 10 내지 559개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 10 내지 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 10 내지 559개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 10 내지 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 또는 559개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 3개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 5개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 10개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 15개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 20개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 25개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 30개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 35개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 40개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 45개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 50개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 55개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 60개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 65개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 70 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 75개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 80개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 85개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 90개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 95개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I 또는 표 II의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 150개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 200개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 250개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 300개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 350개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 400개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 450개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 500개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택된 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 표 I에 열거된 각각의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 표 II에 열거된 각각의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 3개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 5개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 10개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 15개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 20개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 25개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 30개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 35개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 40개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 45개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 50개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 55개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 60개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 65개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 70개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 75개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 80개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 85개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 90개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 95개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 순위 순서로 처음 100개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 150개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 200개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 250개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 300개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 350개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 400개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 발현 프로파일은 표 I의 순위 순서로 처음 539개의 유전자에 의해 형성된다.
하기 논의된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물은 당업계에 공지되어 있는 유전자 발현 프로파일링 방법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 사용하고자 하는 방법에 적합하도록 그에 맞춰 조정될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 검출가능한 표지에 부착된다. 특정 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는, 각각 독립적으로 검출될 수 있는 상이한 검출가능한 표지에 부착된다. 그와 같은 시약은 아래에 기재된 바와 같은, nCounter와 같은 검정, 및 본 명세서에 기재된 진단 방법에 유용하다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드에 혼성화된 포획 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 그와 같은 포획 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 목적 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드의 일부에 특이적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 포획 리간드는 관심 유전자에 대한 리간드에 특이적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 포획 리간드는 샌드위치 ELISA에서와 같이 항체이다.
상기 포획 올리고뉴클레오타이드도 기재와의 결합을 허용하는 모이어티를 포함한다. 그와 같은 기재는, 비제한적으로, 플레이트, 비드, 슬라이드, 웰, 칩 또는 챔버를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 관심 유전자에 특이적인 각각의 상이한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 대한 포획 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 각각의 포획 올리고뉴클레오타이드는 동일한 기재와의 결합을 허용하는 동일한 모이어티를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 결합 모이어티는 바이오틴이다.
따라서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 포유동물 대상체에서 그와 같은 진단 또는 평가를 위한 조성물은 키트 또는 시약일 수 있다. 예를 들어, 조성물의 일 구현예는 mRNA를 검출 및 정량화하기 위해 사용된 리간드가 고정되는 기재를 포함한다. 일 구현예에서, 시약은 mRNA의 핵산 서열을 증폭 및 검출하는 증폭 핵산 프라이머 (예컨대 RNA 프라이머) 또는 프라이머 쌍이다. 또 다른 구현예에서, 상기 시약은 표적 서열에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드 프로브이다. 또 다른 구현예에서, 상기 표적 서열은 표 III에 예시되어 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 시약은 항체 또는 항체의 단편이다. 상기 시약은 표 I 또는 표 II의 적어도 하나의 유전자, 유전자 분절 또는 발현 산물에 각각 특이적인 다수의 상기 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 시약은 종래의 검출가능한 표지와 결합될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 관련된 다중 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 리간드, 상기 물질에 대한 선택적인 검출가능한 표지, 고정화 기재, 효소적 표지를 위한 선택적인 기재, 뿐만 아니라 다른 실험실 아이템을 함유하는 키트이다. 여전히 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 검출가능한 표지와 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 시약은 기재상에 고정된다. 예시적인 기재는 마이크로어레이, 칩, 미세유체역학 카드(microfluidics card), 또는 챔버를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 아래 추가로 논의된 바와 같이, nCounter Nanostring 시스템과 함께 사용하도록 설계된 키트이다.
II. 유전자 발현 프로파일링 방법
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 프로파일을 생성하거나, 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 진단 단계를 수행하는데 사용된 유전자 발현 프로파일링 방법은 미국 특허 번호 7,081,340에 공지되고 잘 요약되어 있다. 그와 같은 유전자 발현 프로파일링 방법은 폴리뉴클레오타이드의 혼성화 분석에 기초한 방법, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 기초한 방법, 및 프로테오믹스-기반 방법을 포함한다. 샘플에서 mRNA 발현의 정량화를 위해 당업계에 공지된 가장 통상적으로 사용되는 방법은 노던 블랏팅 및 원위치 혼성화; RNAse 보호 검정; nCounter® 분석; 및 PCR-기반 방법, 예컨대 RT-PCR을 포함한다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하여, 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체가 이용될 수 있다. 서열분석-기반 유전자 발현 분석을 위한 대표적인 방법은 일련 분석 유전자 발현 (Serial Analysis of Gene Expression; SAGE), 및 대량 병렬 시그니처 서열분석 (massively parallel signature sequencing; MPSS)에 의한 유전자 발현 분석을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 본 명세서에 기재된 유전자 발현 프로파일링 방법 및/또는 진단, 및 당업계에 공지된 것에 사용하기에 적합하다.
A. 환자 샘플
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 면역 세포 및/또는 암 세포를 함유하는 임의의 생체액 또는 생체 조직을 의미한다. 일 구현예에서, 적합한 샘플은 전혈이다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 정맥혈일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 동맥혈일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 샘플은 말초혈, 더 구체적으로 말초혈 단핵 세포를 포함한다. 다른 유용한 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 혈장 또는 혈청을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 타액, 소변, 활막 유체, 골수, 뇌척수액, 질 점액, 자궁경부 점액, 비강 분비물, 가래, 정액, 양수, 기관지폐포 세척액, 및 폐 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 기타 세포 삼출물이다. 그와 같은 샘플은 염수, 완충액 또는 생리적으로 허용가능한 희석제로 추가로 희석될 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 샘플은 종래의 수단에 의해 농축된다. 임의의 하나의 생물학적 샘플에 대한 본 명세서를 통한 사용 또는 참조는 단지 예시적인 것임을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 명세서에서 샘플이 전혈로 지칭되는 경우, 다른 샘플, 예를 들어, 혈청, 혈장, 등도 또 다른 구현예에서 이용될 수 있음이 이해된다.
일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 전혈이고, 상기 방법은 PaxGene Blood RNA Workflow 시스템 (Qiagen)을 이용한다. 그 시스템은 혈액 수집 (예를 들어, 단일 채혈) 및 RNA 안정화, 이어서 수송 및 저장, 이어서 총 RNA 정제 및 분자 RNA 시험을 포함한다. 이 시스템은 즉각적인 RNA 안정화 및 일관된 채혈 용적을 제공한다. 혈액은 의사의 진료실 또는 클리닉에서 채혈될 수 있으며, 시료를 동일한 튜브에서 수송하고 저장할 수 있다. 단기간 RNA 안정성은 18-25℃에서 3일 또는 2-8℃에서 5일이다. 장기간 RNA 안정성은 -20 내지 -70℃에서 4년이다. 이러한 샘플 수집 시스템은 사용자가 전혈에서 유전자 발현에 관한 데이터를 확실하게 얻을 수 있도록 한다. 일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 전혈이다. PAXgene 시스템이 생물학적 샘플 공급원으로서 PBMC를 사용하는 것보다 더 많은 소음을 갖지만, PAXgene 샘플 수집의 이점은 그 문제를 능가한다. 소음은 당해 분야의 숙련가에 의해 생물 정보학적으로 차감될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 전매(proprietary) PaxGene Blood RNA 시스템 (PreAnalytiX, a Qiagen, BD company)을 사용하여 수집할 수 있다. PAXgene Blood RNA 시스템은 2가지 통합된 구성요소를 포함한다: PAXgene Blood RNA 튜브 및 PAXgene Blood RNA 키트. 혈액 샘플은 표준 정맥절개 기술을 통해 PAXgene Blood RNA 튜브 내로 직접 추출된다. 이들 튜브는 세포내 RNA를 즉시 안정화시켜 생체외 분해 또는 RNA 전사체의 상향조절을 최소화시키는 전매 시약을 함유한다. 냉동, 배치 샘플을 제거하고 수집 후 샘플을 처리하는 긴급도를 최소화하는 능력은 실험실 효율을 크게 향상시키고 비용을 절감시킨다. 그 후에, 다양한 검정을 사용하여 miRNA를 검출 및/또는 측정한다.
B. 나노스트링 분석
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 민감하고 유연한 정량적 방법은 nCounter® 분석 시스템 (NanoString Technologies, Inc., Seattle WA)이다. 상기 nCounter 분석 시스템은 유전자 발현의 직접적인 다중화 측정에 기초한 디지털 색-코드 바코드 기술을 이용하며, 높은 수준의 정밀도 및 감도 (세포당 1 카피 미만)를 제공한다. 상기 기술은 분자 "바코드" 및 단일 분자 이미징을 사용하여 단일 반응으로 수백 개의 고유한 전사체를 검출 및 카운트한다. 각각의 색-코드 바코드는 관심 유전자, 즉, 표 I의 유전자에 상응하는 단일 표적-특이적 프로브 (즉, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드)에 부착된다. 대조군과 함께 혼합되어 다중화 CodeSet을 형성한다. 일 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 모든 559개 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 II의 모든 100개 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 3개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 5개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 15개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 20개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 25개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 30개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 40개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 50개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 60개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 70개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 80개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I 또는 표 II의 적어도 90개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 적어도 100개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 적어도 200개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 적어도 300개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 적어도 400개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 적어도 500개의 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 표 I의 순위 순서로 처음 539개의 유전자에 의해 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 표 I의 유전자의 임의의 서브셋을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CodeSet은 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 표 II의 유전자의 임의의 서브셋을 포함한다.
NanoString 플랫폼은 용액에서 혼성화되는 mRNA당 2개의 약 50개 염기 프로브를 이용한다. 리포터 프로브는 신호를 전달하며; 캡처 프로브는 데이터 수집을 위해 복합체가 고정되도록 한다. 상기 프로브를 환자 샘플과 혼합한다. 혼성화 후, 과잉의 프로브를 제거하고, 프로브/표적 복합체를 정렬하고, 기재에, 예를 들어, nCounter 카트리지에 고정시킨다.
표 I 및 표 II의 각각의 유전자에 대해 아래 실시예에 이용된 표적 서열은 아래 표 III에서 보여주며, 서열 목록으로 재현된다. 이러한 서열은 이들 유전자의 공개된 서열의 일부이다. 적합한 대안은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 설계될 수 있다.
데이터 수집을 위해 샘플 카트리지를 디지털 분석기에 배치한다. 카트리지의 표면에서 색 코드가 카운트되고, 각각의 표적 분자에 대해 표로 작성된다.
NanoString nCounter 시스템을 사용하는 이점은 검출 및 정량화를 수행하기 위해 mRNA의 증폭이 필요하지 않다는 점이다. 그러나, 대안적인 구현예에서는, 다른 적합한 정량적 방법이 사용된다. 예를 들어, 하기를 참조한다: Geiss 등, Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs, Nat Biotechnol. 2008 Mar;26(3):317-25. doi: 10.1038/nbt1385. Epub 2008 Feb 17 (이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨).
[표 III]
C. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술
또 다른 적합한 정량적 방법은 RT-PCR로, 정상 및 종양 조직의 상이한 샘플 집단에서 mRNA 수준을 비교하고, 유전자 발현 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA들을 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 제1 단계는 표적 샘플로부터 mRNA의 단리 (예를 들어, 전형적으로 인간 PBMC로부터 단리된 총 RNA)이다. mRNA는, 예를 들어, 냉동된 또는 보관된 파라핀-포매되고 고정된 (예를 들어 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
mRNA의 추출을 위한 일반적인 방법은 분자 생물학의 표준 교과서와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 특히, RNA 단리는 상업적 제조자로부터의 정제 키트, 완충액 세트 및 프로테아제를 사용하여 제조자의 지침에 따라 수행될 수 있다. 예시적인 제품은 TRI-REAGENT, Qiagen RNeasy 미니-칼럼, MasterPure Complete DNA 및 RNA 정제 키트 (EPICENTRE®, Madison, Wis.), 파라핀 블록 RNA 단리 키트 (Ambion, Inc.) 및 RNA Stat-60 (Tel-Test)을 포함한다. 종래의 기술 예컨대 염화세슘 밀도 구배 원심분리가 또한 이용될 수 있다.
RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 RNA 템플레이트를 cDNA로 역전사시키고, 이어서 PCR 반응에서 그것을 지수 증폭시키는 것이다. 가장 통상적으로 사용되는 2가지 역전사효소는 아빌로 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (avilo myeloblastosis virus reverse transcriptase; AMV-RT) 및 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 역전사효소 (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase; MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 전형적으로, 발현 프로파일링의 상황 및 목표에 따라, 특정 프라이머, 랜덤 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 예를 들어, 제품 GeneAmp RNA PCR 키트 (Perkin Elmer, Calif., USA)에 첨부된 제조자의 지침을 참조한다. 이후 유도된 cDNA를 후속적인 RT-PCR 반응에서 템플레이트로서 사용할 수 있다.
PCR 단계는 일반적으로 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 프루프리딩(proofreading) 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 내열성 DNA-의존적 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제를 사용한다. 따라서, TAQMAN® PCR은 전형적으로 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하는 Taq 또는 Tth 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생성한다. 일 구현예에서, 상기 표적 서열은 표 III에서 보여준다. 제3 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위해 설계된다. 상기 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 확장 가능하지 않으며, 리포터 형광 염료 및 켄처 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료의 임의의 레이저-유도된 방출은 2개의 염료가 프로브 상에 있는 것처럼 가까이에 위치할 때 켄칭 염료로 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라제 효소는 템플레이트-의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광단의 켄칭 효과에서 벗어난다. 합성된 각각의 신규한 분자에 대해 리포터 염료의 한 분자가 유리되며, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TaqMan® RT-PCR은 상업적으로 입수가능한 설비를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 5' 뉴클레아제 절차는 ABI PRISM 7900® Sequence Detection System®과 같은 실시간 정량적 PCR 디바이스에서 실행된다. 상기 시스템은 서모사이클러(thermocycler)에서 96-웰 포맷으로 샘플을 증폭시킨다. 증폭 동안, 모든 96개 웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 레이저-유도된 형광 신호를 실시간으로 수집하고, CCD에서 검출한다. 상기 시스템은 기기를 실행하고, 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다. 5'-뉴클레아제 검정 데이터는 초기에 Ct, 또는 역치 사이클로 표현된다. 상기에 논의된 바와 같이, 형광 값은 모든 사이클 동안 기록되고 증폭 반응에서 그 지점까지 증폭된 산물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 통계적으로 유의한 것으로 처음 기록되는 시점은 역치 사이클 (Ct)이다.
오차 및 샘플간 편차의 영향을 최소화하기 위해, RT-PCR은 일반적으로 내부 표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준은 상이한 조직 간에 일정한 수준으로 발현되고, 실험적 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 유전자 발현 패턴을 정규화하는데 가장 빈번하게 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자 글리세르알데하이드-3-포스페이트-탈수소효소 (GAPDH) 및 β-액틴에 대한 mRNA이다.
실시간 PCR은 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 정규화를 위해 사용되는 정량적 경쟁적 PCR, 및 샘플 내에 포함된 정규화 유전자, 또는 RT-PCR용 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 비교 PCR 둘 모두와 비교할 만하다.
또 다른 PCR 방법, 즉, the MassARRAY-기반 유전자 발현 프로파일링 방법 (Sequenom, Inc., San Diego, CA)에서, RNA의 단리 및 역전사 후, 수득된 cDNA는 단일 염기를 제외한 모든 위치에서 표적화된 cDNA 영역과 일치하고, 내부 표준으로 작용하는 합성 DNA 분자 (경쟁자)로 스파이킹된다. cDNA/경쟁자 혼합물은 PCR 증폭되고, 잔여 뉴클레오타이드의 탈인산화를 초래하는 후-PCR 새우 알칼리성 포스파타제 (SAP) 효소 처리를 받는다. 알칼리성 포스파타제의 불활성화 후, 경쟁자 및 cDNA로부터의 PCR 산물은 경쟁자- 및 cDNA-유래된 PCR 산물에 대한 뚜렷이 다른 질량 신호를 생성하는 프라이머 신장을 겪는다. 정제 후, 이들 산물을 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비과시간 질량 분광분석법 (MALDI-TOF MS) 분석으로의 분석에 필요한 구성요소로 미리 로딩된 칩 어레이 상에 분배한다. 이후 상기 반응에 존재하는 cDNA는 생성된 질량 스펙트럼에서 피크 면적의 비를 분석함으로써 정량화된다.
당업계에 공지되고, 유전자 발현 프로파일링을 위해 사용될 수 있는 PCR-기반 기술의 또 다른 구현예는, 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 Luminex100 LabMAP 시스템 및 유전자 발현을 위한 신속 검정에서 다중 색-코드 마이크로구형체 (Luminex Corp., Austin, Tex.)를 사용하는 차별적 디스플레이(differential display), 증폭된 단편 길이 다형성 (amplified fragment length polymorphism; iAFLP), 및 BeadArray™ 기술 (Illumina, San Diego, CA); 및 높은 적용범위 발현 프로파일링 (high coverage expression profiling; HiCEP) 분석을 포함한다.
D. 마이크로어레이
차별적인 유전자 발현은 또한 마이크로어레이 기술을 사용하여 식별 또는 확인될 수 있다. 따라서, 폐암-관련된 유전자의 발현 프로파일은 신선한 또는 파라핀-포매된 조직에서 마이크로어레이 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 이 방법에서, 관심 폴리뉴클레오타이드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오타이드 포함)은 마이크로칩 기재 상에 플레이팅되거나 어레이된다. 이후 어레이된 서열을 관심 세포 또는 조직으로부터의 특정 DNA 프로브와 혼성화한다. 본 명세서의 다른 방법 및 조성물에서와 마찬가지로, mRNA의 공급원은 대조군 및 환자 대상체의 전혈로부터 단리된 전체 RNA이다.
마이크로어레이 기술의 일 구현예에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 조밀한 어레이로 기재에 적용된다. 일 구현예에서, 표 III의 모든 559개 뉴클레오타이드 서열이 상기 기재에 적용된다. 마이크로칩 상에 고정된 마이크로어레이된 유전자는 엄격한 조건 하에서의 혼성화에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 프로브는 관심 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오타이드의 혼입을 통해 생성될 수 있다. 상기 칩에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 상기 어레이 상의 각각의 DNA 스팟에 특이적으로 혼성화된다. 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위한 엄격한 세정 후, 상기 칩은 공초점 레이저 현미경검사 또는 또 다른 검출 방법, 예컨대 CCD 카메라에 의해 스캐닝된다. 각각의 어레이된 요소의 혼성화의 정량화는 상응하는 mRNA 존재량의 평가를 가능하게 한다. 이중 색상 형광으로, 2개의 RNA 공급원으로부터 생성된 별도로 표지된 cDNA 프로브는 상기 어레이에 쌍으로 혼성화된다. 따라서 각각의 명시된 유전자에 상응하는 2개의 공급원으로부터의 전사체의 상대적 존재량은 동시에 결정된다. 혼성화의 소형화된 규모는 다수의 유전자에 대한 발현 패턴의 편리하고 신속한 평가를 제공한다. 그와 같은 방법은 세포당 소수의 복제물로 발현되는 드문 전사체를 검출하고, 발현 수준에서 적어도 대략 2배 차이를 재현 가능하게 검출하는데 요구되는 감도를 갖는 것으로 나타났다. 마이크로어레이 분석은 제조자의 프로토콜에 따라서 상업적으로 입수가능한 설비에 의해 수행될 수 있다.
미국 특허 번호 7,081,340에 의해 요약되고, 본 명세서에 참고로 편입된 다른 유용한 방법은 일련 분석 유전자 발현 (SAGE) 및 대량 병렬 시그니처 서열분석 (MPSS)을 포함한다. 간단히, 일련 분석 유전자 발현 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개별 혼성화 프로브를 제공할 필요 없이 다수의 유전자 전사체의 동시 및 정량적 분석을 가능하게 하는 방법이다. 우선, 태그가 각각의 전사체 내의 고유한 위치로부터 얻어지는 경우 전사체를 고유하게 식별하기 위한 충분한 정보를 포함하는 짧은 서열 태그 (약 10 내지 14 bp)가 생성된다. 이후, 많은 전사체를 서로 연결하여 긴 일련의 분자를 형성하고, 서열분석하여 다중 태그의 동일성을 동시에 나타낼 수 있다. 전사체의 임의의 집단의 발현 패턴은 개별 태그의 존재량을 결정하고, 각각의 태그에 상응하는 유전자를 식별함으로써 정량적으로 평가될 수 있다. 더 자세한 사항에 대해서는, 예를 들어 하기를 참조한다: Velculescu 등, Science 270:484 487 (1995); 및 Velculescu 등, Cell 88:243 51 (1997) (이 둘 모두는 본 명세서에 참고로 편입됨).
Brenner 등, Nature Biotechnology 18:630 634 (2000) (본 명세서에 참고로 편입됨)에 의해 기재된, 대량 병렬 시그니처 서열분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석은 비-겔-기반 시그니처 서열분석을 별도의 5μm 직경 마이크로비드 상의 수백만 개의 템플레이트의 시험관내 클로닝과 결합시킨 서열분석 접근법이다. 우선, DNA 템플레이트의 마이크로비드 라이브러리를 시험관내 클로닝으로 제작한다. 다음으로, 고밀도 (전형적으로 3x106 마이크로비드/cm2 초과)의 흐름 셀에서 템플레이트-함유 마이크로비드의 평면 어레이의 조립이 이어진다. DNA 단편 분리가 요구되지 않는 형광-기반 시그니처 서열분석 방법을 사용하여 각각의 마이크로비드 상의 클로닝된 템플레이트의 유리 단부를 동시에 분석한다. 이 방법은 단일 조작으로 효모 cDNA 라이브러리로부터의 수십만 개의 유전자 시그니처 서열을 동시에 그리고 정확하게 제공하는 것으로 나타났다.
E. 면역조직화학
면역조직화학 방법은 또한 본 명세서의 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 기재된 유익한 유전자의 유전자 발현 산물의 발현 수준을 검출하는데 적합하다. 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 다클론성 항혈청, 및 가장 바람직하게는 단클론성 항체, 또는 각각의 마커에 특이적인 다른 단백질-결합 리간드가 발현을 검출하는데 사용된다. 항체는 항체 자체를, 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지 예컨대, 바이오틴, 또는 효소 예컨대 호스 래디시 페록시다아제(horse radish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제로 직접 표지함으로써 검출될 수 있다. 대안적으로, 표지되지 않은 1차 항체는 항혈청, 다클론성 항혈청 또는 1차 항체에 특이적인 단클론성 항체를 포함하는 표지된 2차 항체와 함께 사용된다. 면역조직화학 분석을 위한 프로토콜 및 키트는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 입수가능하다.
III. 본 발명의 조성물
정의된 유전자 발현 프로파일을 이용하는 본원에 기재된 폐암 진단 방법은 폐암, 예를 들어, NSCLC 대 비-암성 결절을 진단하기 위한 간소화된 진단 도구의 개발을 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 포유동물 대상체에서 폐암을 진단하기 위한 조성물은 키트 또는 시약일 수 있다. 예를 들어, 조성물의 일 구현예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드 또는 리간드가 고정되는 기재를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 관련된 5개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드, 상기 물질에 대한 선택적인 검출가능한 표지, 고정화 기재, 효소적 표지를 위한 선택적인 기재, 뿐만 아니라 다른 실험실 아이템을 함유하는 키트이다. 여전히 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 검출가능한 표지와 결합된다.
일 구현예에서, 포유동물 대상체에서 폐암 진단을 위한 조성물은 5개 이상의 PCR 프라이머-프로브 세트를 포함한다. 각각의 프라이머-프로브 세트는 대상체의 혈액에서 발견된 5개 이상의 유익한 유전자의 유전자 발현 산물로부터 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킨다. 이러한 유익한 유전자는 폐암을 갖는 대상체와 비-암성 결절을 갖는 대상체를 구별할 수 있는 유전자 발현 프로파일 또는 시그니처를 형성하도록 선택된다. 기준 유전자 발현 프로파일로부터 유전자 발현 프로파일에서의 유전자 발현 변화는 폐암, 예컨대 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 관련된다.
이 조성물의 일 구현예에서, 상기 유익한 유전자는 표 I에서 식별된 유전자 중에서 선택된다. 이 조성물의 또 다른 구현예에서, 상기 유익한 유전자는 표 II에서 식별된 유전자 중에서 선택된다. 이러한 유전자의 집합체는 기준 대조군 (즉, 비-암성 결절을 갖는 환자)의 혈액에서의 동일한 유전자 산물 발현에 비해 변경된 (즉, 증가된 또는 감소된) 것이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드, 즉, 프로브는 조성물 (CodeSet)에 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 5개 이상의 유익한 유전자에 대해 생성된다. 그와 같은 조성물의 예는 표 I의 559개 유전자의 표적화된 부분에 대한 프로브를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I의 559개 유전자 모두에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I의 처음 539개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 3개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 5개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 10개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 15개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 20개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 25개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 30개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 35개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 40개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 45개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 50개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 60개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 65개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 70개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 75개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 80개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 85개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 90개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 95개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I 또는 표 II의 처음 100개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I의 처음 200개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 프로브는 상기 조성물에서 사용하기 위해 표 I의 300개 유전자에 대해 생성된다. 또 다른 구현예는 표 I 또는 표 II의 유전자의 다른 조합의 표적화된 부분에 대한 프로브를 이용한다. 표로부터 선택된 유전자는 순위 순서일 필요는 없으며; 오히려 이환 환자에 대한 기준 대조군 간의 발현 차이를 분명히 보여주는 임의의 조합이 그와 같은 조성물에 유용하다.
상기 기재된 조성물의 일 구현예에서, 기준 대조군은 상기에 기재된 바와 같은 비-건강한 대조군 (NHC)이다. 다른 구현예에서, 기준 대조군은 상기 "정의"에 기재된 바와 같은 임의의 부류의 대조군일 수 있다.
검출가능한 표지와 선택적으로 결합된, 본 명세서에 기재된 표 I 또는 표 II로부터 선택된 유전자에 기초한 조성물은 미세유체역학 카드, 칩 또는 챔버, 또는 상기 기재된 Nanostring, PCR, RT-PCR 또는 Q PCR 기술과 함께 사용하기에 적합한 키트의 포맷으로 제공될 수 있다. 일 양태에서, 그와 같은 포맷은 TaqMan® Quantitative PCR 저밀도 어레이를 사용한 진단 검정이다. 또 다른 양태에서, 그와 같은 포맷은 Nanostring nCounter 플랫폼을 사용한 진단 검정이다.
상기 언급된 조성물에 사용하기 위해, PCR 프라이머 및 프로브는 유전자 발현 프로파일로부터 선택된 증폭될 유전자(들)에 존재하는 인트론 서열에 기초하여 바람직하게 설계된다. 예시적인 표적 서열은 표 III에 나타냈다. 상기 프라이머 및 프로브 서열의 설계는 특정한 유전자 표적이 선택되면 당업계의 기술 범위 내에 있다. 상기 프라이머 및 프로브 설계를 위해 선택된 특정한 방법 및 특정한 프라이머 및 프로브 서열은 이러한 조성물의 특징을 제한하지 않는다. 당해 분야의 숙련가에게 이용가능한 프라이머 및 프로브 설계 기술에 대한 준비된 설명은 DNA BLAST 소프트웨어, Repeat Masker 프로그램 (Baylor College of Medicine), Primer Express (Applied Biosystems); MGB 어세이-바이-디자인(assay-by-design) (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) 일반 사용자 및 생물학자 프로그래머를 위한 WWW 상의 Primer3 (Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers)과 같은 공개적으로 이용가능한 도구를 참조하여, 미국 특허 번호 7,081,340에 요약된다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 조성물에 사용된 최적의 PCR 프라이머 및 프로브는 일반적으로 길이가 17-30개 염기이고, 약 20-80%, 예를 들어, 약 50-60% G+C 염기를 함유한다. 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 용융 온도가 전형적으로 바람직하다.
또 다른 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암 진단을 위한 조성물은 기재 상에 고정된 복수의 폴리뉴클레오타이드를 함유하며, 여기서 복수의 게놈 프로브는 대상체의 혈액의 유전자 발현 프로파일로부터 선택된 100개 이상의 유익한 유전자의 100개 이상의 유전자 발현 산물에 혼성화되며, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I로부터 선택된 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 포유동물 대상체에서 폐암 진단을 위한 조성물은 기재 상에 고정된 복수의 폴리뉴클레오타이드를 함유하며, 여기서 복수의 게놈 프로브는 대상체의 혈액의 유전자 발현 프로파일로부터 선택된 10개 이상의 유익한 유전자의 10개 이상의 유전자 발현 산물에 혼성화되며, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II로부터 선택된 유전자를 포함한다. 이러한 유형의 조성물은 Nanostring 조성물에 대해 상기 기재된 바와 동일한 유전자 프로파일의 인식에 의존하지만, cDNA 어레이 기술을 이용한다. 환자 대상체의 혈액에 존재하는 유전자 발현 산물에 대한 조성물 중 고정된 폴리뉴클레오타이드의 혼성화는 표 I 또는 표 II에서 식별된 유전자 중에서 선택된 유익한 유전자의 발현을 정량화하여 환자에 대한 유전자 발현 프로파일을 생성하고, 이어서 기준 샘플의 것과 비교하기 위해 이용된다. 상기에 기재된 바와 같이, 프로파일 (즉, 표 I의 유전자 또는 그것의 서브셋의 프로파일, 표 II의 유전자 또는 그것의 서브셋의 프로파일)의 식별에 따라, 이 조성물은 NSCLC 폐암의 진단 및 예후를 가능하게 한다. 다시, 조성물에 사용되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 그것의 길이 및 표지의 선택은 어떤 유전자가 폐암의 진단 및 예후에 적합한 유전자 발현 프로파일을 형성할 수 있는지에 대한 교시를 고려하여 당해 분야의 숙련가에 의해 일상적으로 결정된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 조성물 또는 키트는 대상체의 혈액의 유전자 발현 프로파일로부터 선택된 100개 이상의 유익한 유전자의 100개 이상의 유전자 발현 산물에 결합하는 복수의 리간드를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 조성물 또는 키트는 대상체의 혈액의 유전자 발현 프로파일로부터 선택된 10개 이상의 유익한 유전자의 10개 이상의 유전자 발현 산물에 결합하는 복수의 리간드를 함유한다. 상기 유전자 발현 프로파일은, 다른 조성물에 대해 상기 기재된 바와 같이, 표 I 또는 표 II의 유전자를 함유한다. 이 조성물은 지시된 표의 유전자에 의해 발현된 단백질을 검출할 수 있게 한다. 바람직하게는 상기 리간드는 상기 프로파일의 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 항체이지만, 다양한 형태의 항체, 예를 들어, 다클론성, 단클론성, 재조합, 키메라성, 뿐만 아니라 단편 및 구성요소 (예를 들어, CDR, 단일 사슬 가변 영역, 등)가 항체 대신에 사용될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 그와 같은 리간드는 대상체의 혈액과 접촉시키기 위해 적합한 기재 상에 고정되고 종래의 방식으로 분석될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 리간드는 검출가능한 표지와 결합된다. 이러한 조성물은 또한, 기준 유전자 발현 프로파일의 것으로부터 유전자 발현 프로파일의 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 변화를 검출할 수 있게 한다. 그와 같은 변화는 상기 기재된 PCR 및 폴리뉴클레오타이드-함유 조성물에 대한 것과 유사한 방식으로 폐암과 관련된다.
상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대해, 상기 유전자 발현 프로파일은, 일 구현예에서, 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 적어도 처음 25개를 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 10개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 15개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 20개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 30개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 40개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 50개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 60개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 70개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 80개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I 또는 표 II의 유익한 유전자 중 90개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 II의 유익한 유전자 중 100개 모두를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대해, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 적어도 처음 100개를 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 200개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 300개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 400개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 500개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 539개 이상을 포함할 수 있다. 상기 형태의 진단/예후 조성물 모두에 대한 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유익한 유전자 중 559개 모두를 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 폐암, 예컨대 I기 또는 II기 NSCLC를 진단하는데 사용될 수 있다. 추가로 이러한 조성물은 병인이 알려지지 않은 폐 결절을 갖는 대상체에서 보조적 또는 최초 진단을 제공하는데 유용한다.
IV. 본 발명의 진단 방법
상기-기재된 조성물 모두는 대상체에서 질환 상태의 혈액-기반, 비-침습성 평가를 가능하게 하는 다양한 진단 도구를 제공한다. 다른 선별 검사, 예컨대 흉부 X-선 또는 CT 스캔과 결합될 수 있는 진단 검사에서 이러한 조성물의 사용은 진단 정확도를 증가시키고/시키거나 추가 검사를 지시한다.
따라서, 일 양태에서, 포유동물 대상체에서 폐암을 진단하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 포유동물, 바람직하게는 인간, 대상체의 혈액에서 유전자 발현 프로파일을 식별하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 폐암에서 발현이 증가 또는 감소된 100개 이상의 유익한 유전자의 100개 이상의 유전자 발현 산물을 포함한다. 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유전자로부터 100개 이상의 유익한 유전자를 선택함으로써 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 폐암에서 발현이 증가 또는 감소된 10개 이상의 유익한 유전자의 10개 이상의 유전자 발현 산물을 포함한다. 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유전자로부터 10개 이상의 유익한 유전자를 선택함으로써 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 II의 유전자로부터 10개 이상의 유익한 유전자를 선택함으로써 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 폐암에서 발현이 증가 또는 감소된 5개 이상의 유익한 유전자의 10개 이상의 유전자 발현 산물을 포함한다. 상기 유전자 발현 프로파일은 표 I의 유전자로부터 5개 이상의 유익한 유전자를 선택함으로써 형성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 프로파일은 표 II의 유전자로부터 5개 이상의 유익한 유전자를 선택함으로써 형성된다. 대상체의 유전자 발현 프로파일을 기준 유전자 발현 프로파일과 비교하여 폐암 (예를 들어, NSCLC)과 관련된 유익한 유전자의 발현 변화를 식별할 수 있다. 이 방법은 상기 기재된 임의의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 양성 결절로부터 암성 종양의 진단을 가능하게 한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 용도는 대상체에서 폐암을 진단하기 위해 제공된다.
본 명세서에 기재된 진단 조성물 및 방법은 현재 진단 방법에 비해 다양한 이점을 제공한다. 그와 같은 이점 중에는 다음과 같은 것이 있다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 암성 종양을 갖는 대상체는 양성 결절을 갖는 대상체와 구별된다. 이러한 방법 및 조성물은 작은 결절을 갖는 폐 클리닉에 참여한 환자가 악성 질환을 갖는지 여부에 대한 실제적인 진단 문제에 대한 해결책을 제공한다. 중간-위험 결절을 갖는 환자는, 환자를 매우 낮은-가능성 또는 매우 높은-가능성의 질환 위험 카테고리로 이동시킬 수 있는 비-침습적 검사로부터 분명히 이익을 얻을 것이다. 게놈 프로파일에 기초한 악성종양의 정확한 추정 (즉 환자를 추정하여 암을 가질 가능성이 단지 5%인 것에 비해 주어진 환자를 추정하여 암을 가질 확률이 90%임)은 양성 질환의 수술 횟수를 줄이고, 치료 가능한 단계에서 초기 단계 종양의 제거 횟수를 증가시키고, 결절을 걱정하는 상당한 심리적 비용을 감소시킬 것이다. 폐암에 대한 CT 선별과 관련한 추가 건강관리를 위한 현재 추정되는 비용, 즉, 얻어진 질 보정 생존 년수(quality adjusted life-year)당 $116,000를 감축하는 것과 같은 경제적 영향도 중요할 것이다. 충분한 감도 및 특이도를 갖는 비-침습성 혈액 유전체학 검사는 악성종양의 후-검사 확률 및 따라서 후속 임상 진료를 현저히 바꿀 것이다.
현존하는 방법에 비해 이러한 방법의 바람직한 이점은 최소-침습 과정으로부터, 즉, 혈액 샘플을 채취함으로써 질환 상태를 특성화할 수 있다는 것이다. 그에 반해서, 유전자 발현 프로파일로부터 암 종양을 분류하기 위한 현재의 실행은 조직 샘플, 일반적으로 종양으로부터의 샘플에 의존한다. 매우 작은 종양의 경우에 생검은 문제가 있으며, 명백히 종양이 알려지지 않거나 가시적이지 않다면, 이로부터의 샘플은 불가능하다. 종양 샘플을 분석하는 경우와 같이 종양의 정제는 필요하지 않다. 최근에 발표된 방법은 기관지 내시경 검사 중 폐로부터 상피 세포의 브러싱에 의존하며, 이 방법 또한 혈액 샘플을 채취하는 것보다 훨씬 더 침습적이다. 혈액 샘플은, 메신저 RNA가 분석되는 경우 중요한, 물질이 이후 분석을 위해 쉽게 준비되고 안정화된다는 추가 이점을 갖는다.
본 명세서에 기재된 559개 분류기는 모든 시험된 샘플에 대해 0.81의 ROC-AUC를 나타냈다. 일 구현예에서, 감도가 약 90%인 경우, 특이도는 약 46%이다. 결절 분류 정확도가 감도에 대한 특정 역치를 사용하지 않고 크기별로 평가되는 경우, 결절 크기 및 암 위험 인자가 증가함에 따라, 암으로 분류되는 양성 결절의 수도 증가한다. 일 구현예에서, 유전자 분류기의 정확도는 8mm 이하의 결절에 대해 약 89%이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 분류기의 정확도는 8mm보다 크고 약 12mm 이하인 결절에 대해 약 75%이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 분류기의 정확도는 12mm보다 크고 약 16mm 이하인 결절에 대해 약 68%이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 분류기의 정확도는 16mm가 넘는 경우 약 53%이다. 이하 실시예를 참조한다.
일 구현예에서, 결절이 약 10mm 미만인 경우, 특이도는 약 54%이고, ROC-AUC는 약 90% 감도에서 0.85이다. 또 다른 구현예에서, 약 10mm가 넘는 더 큰 결절의 경우, 특이도는 약 24%이고, ROC-AUC는 약 90% 감도에서 약 0.71이다.
본 명세서에 기재된 100개 분류기는 모든 시험된 샘플에 대해 0.82의 ROC-AUC를 나타냈다. 일 구현예에서, 감도가 약 90%인 경우, 특이도는 약 62%이다. 또 다른 구현예에서, 감도가 약 79%인 경우, 특이도는 약 68%이다. 일 구현예에서, 감도가 약 71%인 경우, 특이도는 약 75%이다. 이하 실시예를 참조한다.
이러한 조성물 및 방법은 폐암의 보다 정확한 진단 및 치료를 가능하게 한다. 따라서, 일 구현예에서, 기재된 방법은 폐암의 치료를 포함한다. 치료는 신생물 성장의 제거, 화학요법 및/또는 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 임의의 다른 치료일 수 있다.
일 구현예에서, 포유동물 대상체에서 폐암의 존재를 진단하거나 폐암을 평가하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체의 샘플에서 5, 10, 15개 이상의 유전자의 발현 변화를 식별하는 단계를 포함하며, 상기 유전자는 표 I의 유전자 또는 표 II의 유전자로부터 선택된다. 상기 대상체의 유전자 발현 수준은 기준 또는 대조군의 동일한 유전자의 수준과 비교되며, 여기서 기준의 것으로부터 대상체의 유전자의 발현 변화는 폐암의 진단 또는 평가와 관련이 있다.
일 구현예에서, 상기 진단 또는 평가는 폐암의 진단, 양성 결절의 진단, 폐암의 단계 진단, 폐암의 유형 또는 분류의 진단, 폐암 재발의 진단 또는 검출, 폐암 퇴행의 진단 또는 검출, 폐암의 예후, 또는 외과적 또는 비-외과적 요법에 대한 폐암의 반응 평가 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 변화는 상기 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 상향조절 또는 상기 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 하향조절을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 폐 결절의 크기를 포함한다. 특이도 및 감도는 결절의 크기에 기초하여 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 특이도는 약 90% 감도에서 약 46%이다. 또 다른 구현예에서, 특이도는 10mm 미만의 결절에 대해 약 90% 감도에서 약 54%이다. 또 다른 구현예에서, 정확도는 8mm 이하의 결절에 대해 약 88%, 8mm보다 크고 12mm 이하인 결절에 대해 약 75%, 12mm보다 크고 16mm 이하인 결절에 대해 약 68%, 16mm보다 큰 결절에 대해 약 53%이다.
또 다른 구현예에서, 기준 또는 대조군은 적어도 하나의 기준 대상체의 표 I 샘플의 3개 이상의 유전자를 포함한다. 기준 대상체는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: (a) 악성 질환을 갖는 흡연자, (b) 비-악성 질환을 갖는 흡연자, (c) 비-악성 질환을 갖는 과거 흡연자, (d) 질환이 없는 건강한 비-흡연자, (e) 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)이 있는 비-흡연자, (f) COPD가 있는 과거 흡연자, (g) 고체 폐 종양의 제거 수술 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; (h) 상기 종양의 외과적 제거 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체; (i) 고체 폐 종양을 위한 요법 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; 및 (j) 고체 폐 종양을 위한 요법 중 또는 요법 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체. 일 구현예에서, 기준 또는 대조 대상체 (a)-(j)는 시간적으로 더 이른 시점의 동일한 시험 대상체이다.
샘플은 본 명세서에서 기재된 것으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 샘플은 말초혈이다. 상기 샘플 내 핵산은, 일부 구현예에서, 유전자 발현 수준의 변화를 식별하기 전에 안정화된다. 그와 같은 안정화는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Pax Gene 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 환자에서 폐암을 검출하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 환자로부터 샘플을 수득하는 단계; 및
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 100개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 폐암을 진단하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계; 및
c. 기준의 것으로부터 상기 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 상기 대상체를 진단하는 단계.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계;
c. 기준의 것으로부터 상기 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 상기 대상체를 진단하는 단계; 및
d. 신생물 성장을 제거하는 단계.
V.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 설명된다. 이러한 실시예는 실례의 목적으로만 제공되며, 본 발명은 결코 이러한 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 환자 모집단 - 분석 A
본 명세서에 기재된 유전자 분류기의 개발을 위해, 폐암 진단된 73명의 대상체 및 양성 결절로 진단된 77명의 대상체를 포함하는 150명의 대상체로부터 혈액 샘플 및 임상 정보를 수집하였다. 환자의 특징은 도 1에 나타내었다.
폐암 환자는 초기 단계 폐암으로 새롭게 진단된 남녀 환자를 포함하였다. 이들은 의학적 질병에도 불구하고 건강이 적당히 좋았다 (통원). 이들은 이전에 암을 갖거나, 화학요법, 방사선, 또는 암 수술을 받았다면 배제되었다. 이들은 이전 6개월 내에 폐암 진단을 받고, 조직학적 확인을 받고, 마이오마커 수준이 요법에 따라 달라질 수 있으므로 전신 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 또는 암 수술을 받지 않아야 한다. 따라서 암 환자의 대다수는 초기 단계 (즉, I기 및 II기)였다.
"대조군" 집단은 양성 폐 결절 (예를 들어 젖빛 유리 혼탁(ground glass opacities), 단일 결절, 육아종 또는 과오종)을 갖는 환자로부터 유래되었다. 이들 환자는 폐 클리닉에서 평가받았고, 폐 결절에 대한 흉부 수술을 받았다. 모든 샘플은 수술 전 수집하였다.
실시예 2: 환자 모집단 - 분석 B
폐암 진단된 60명의 대상체 및 양성 결절로 진단된 60명의 대상체를 포함하는 120명의 대상체로부터 추가의 혈액 샘플 및 임상 정보를 수집하였다. 폐암 환자는 초기 단계 폐암으로 새롭게 진단된 남녀 환자를 포함하였다. 이들은 의학적 질병에도 불구하고 건강이 적당히 좋았다 (통원). 이들은 이전에 암을 갖거나, 화학요법, 방사선, 또는 암 수술을 받았다면 배제되었다. 이들은 이전 6개월 내에 폐암 진단을 받고, 조직학적 확인을 받고, 마이오마커 수준이 요법에 따라 달라질 수 있으므로 전신 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 또는 암 수술을 받지 않아야 한다. 따라서 암 환자의 대다수는 초기 단계 (즉, I기 및 II기)였다.
"대조군" 집단은 양성 폐 결절 (예를 들어 육아종 또는 과오종)을 갖는 환자로부터 유래되었다. 이들 환자는 폐 클리닉에서 평가받았고, 폐 결절에 대한 흉부 수술을 받았다. 모든 샘플은 수술 전 수집하였다.
실시예 3: 샘플 수집 프로토콜 및 처리
혈액 샘플은 조직 채취 기술자에 의해 클리닉에서 수집하였다. 혈액 샘플은 표준 정맥절개 기술을 통해 PAXgene Blood RNA 튜브 내로 직접 추출되었다. 이들 튜브는 세포내 RNA를 즉시 안정화시켜 생체외 분해 또는 RNA 전사체의 상향조절을 최소화시키는 전매 시약을 함유한다. 냉동, 배치 샘플을 제거하고 수집 후 샘플을 처리하는 긴급도를 최소화하는 능력은 실험실 효율을 크게 향상시키고 비용을 절감시킨다.
실시예 4 - RNA 정제 및 품질 평가
PAXgene RNA는 mRNA를 정제할 수 있는 Qiagen™의 표준 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 제조된다. 생성된 RNA는 mRNA 프로파일링에 사용된다. RNA 품질은 Bioanalyzer를 사용하여 결정된다. RNA 무결성 수(RNA Integrity number)가 3 초과인 샘플만이 사용되었다.
간단히, RNA는 아래와 같이 단리된다. 진탕기-인큐베이터를 켜고, 시작 전에 55℃로 설정한다. 달리 언급되지 않는 한, 원심분리 단계를 포함하는 이 프로토콜의 모든 단계는 실온 (15-25℃)에서 수행되어야 한다. 이 프로토콜은 샘플이 -80℃에서 저장된다고 가정한다. 최소 2시간의 Qiagen 프로토콜에 따라 RT에 남은 냉동되지 않은 샘플도 동일한 방식으로 처리되어야 한다.
Paxgene 튜브를 플라스틱 랙에서 수직으로 세워 해동시킨다. 단리 시작 전에 튜브를 적어도 10회 뒤집어 혼합한다. 모든 필요한 튜브를 준비한다. 각각의 샘플에 대해, 하기가 필요하다: 넘버링된 1.5ml 에펜도르프 튜브 2개; 샘플 정보가 있는 에펜도르프 튜브 1개 (이것은 최종 튜브임); Lilac Paxgene 스핀 칼럼 1개; Red Paxgene 스핀 칼럼 1개; 및 처리 튜브 5개.
PAXgene Blood RNA 튜브를 Qiagen 원심분리기에서 스윙-아웃(swing-out) 회전자를 사용하여 5000 x g에서 10분 동안 원심분리한다. (Sigma 4-15℃ 원심분리기, 회전자: Sigma Nr.11140, 7/01, 5500/min, 홀더: Sigma 13115,286g 14/D, 내부 튜브 홀더:18010, 125g). 주석: 해동 후, 혈액 샘플이 혈액 세포의 완전한 용해를 달성하기 위해 실온 (15-25℃)에서 최소 2시간 동안 PAXgene 혈액 RNA 튜브에서 인큐베이션되었는지 확인한다.
후드 하에서 - 상청액을 표백제 내로 경사분리하여 상청액을 제거한다. 상청액을 경사분리할 때, 펠릿을 흩뜨리지 않도록 주의하고, 튜브의 가장자리를 깨끗한 종이 타월로 건조시킨다. 응고된 혈액을 백에 넣고 이어서 감염성 폐기물에 넣어 경사분리된 상청액을 버리고, 싱크 아래의 유체 부분을 버리고 많은 물로 씻어낸다. 4 ml RNase-비함유 물을 상기 펠릿에 첨가하고, 새로운 보조 Hemogard 마개를 사용하여 튜브를 닫는다.
상기 펠릿이 눈에 띄게 용해될 때까지 와동시킨다. 원심분리기 홀더에서 튜브를 다시 계량하여 그것이 균형을 이루었음을 확인하고, 스윙-아웃 회전자 Qiagen 원심분리기를 사용하여 5000 x g에서 10분 동안 원심분리한다. 와동 후 그러나 원심분리 전 상청액에 남아있는 작은 잔해는 상기 절차에 영향을 주지 않을 것이다.
전체 상청액을 제거하고 버린다. 튜브를 1분 동안 거꾸로 두어 모든 상청액을 배출시킨다. 상청액의 불완전한 제거는 용해를 억제하고 용해물을 희석하므로 PAXgene 막에 RNA를 결합시키는 조건에 영향을 줄 것이다.
350 μl 완충액 BM1을 첨가하고, 아래위로 피펫팅하여 펠릿을 용해시킨다.
재현탁된 샘플을 표지된 1.5 ml 마이크로원심관으로 피펫팅한다. 300 μl 완충액 BM2를 첨가한다. 이후 40 μl 프로테이나제 K를 첨가한다. 5초 동안 와동시켜 혼합하고, 에펜도르프 서모믹서(thermomixer)에서 최고 가능한 속도, 800 rpm의 진탕기-인큐베이터를 사용하여 55℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. (서모믹서 대신 진탕 수조를 사용하는 경우, 인큐베이션 동안 2-3분 마다 샘플을 빠르게 와동시킨다. 인큐베이터 옆에 볼텍서(vortexer)를 둔다).
2 ml 처리 튜브에 배치된 PAXgene Shredder 스핀 칼럼 (lilac 튜브) 내로 용해물을 직접 피펫팅하고, TOMY Microtwin 원심분리기에서 18,500 x g에서 24C에서 3분 동안 원심분리하다. 용해물을 스핀 칼럼 내로 주의하여 피펫팅하고, 용해물이 스핀 칼럼으로 완전히 전달되었는지 육안으로 확인한다. 칼럼 및 튜브의 손상을 방지하기 위해, 20,000 x g를 초과하지 않는다.
처리 튜브에서 통과액 분획의 전체 상청액을 펠릿을 흩뜨리지 않으면서 새로운 1.5 ml 마이크로원심관으로 주의하여 옮긴다. 처리 튜브에 있는 펠릿을 버린다.
700μl 이소프로판올 (100%)을 상청액에 첨가한다. 와동시켜 혼합한다.
690 μl 샘플을 2 ml 처리 튜브에 배치된 PAXgene RNA 스핀 칼럼 (적색) 내로 피펫팅하고, 10,000x g에서 1분 동안 원심분리한다. 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 처리 튜브에 넣고, 통과액을 포함하는 이전 처리 튜브를 폐기한다.
잔여 샘플을 PAXgene RNA 스핀 칼럼 (적색) 내로 피펫팅하고, 18,500 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 처리 튜브에 넣고, 통과액을 포함하는 이전 처리 튜브를 폐기한다. 샘플을 스핀 칼럼 내로 주의하여 피펫팅하고, 샘플이 스핀 칼럼으로 완전히 전달되었는지 육안으로 확인한다.
350 μl 완충액 BM3을 PAXgene RNA 스핀 칼럼 내로 피펫팅한다. 10,000x g에서 15초 동안 원심분리한다. 새로운 2 ml 처리 튜브에 스핀 컬럼을 넣고, 통과액을 포함하는 이전 처리 튜브를 폐기한다.
단계 13을 위한 DNase I 인큐베이션 혼합물을 준비한다. 1.5 ml 마이크로원심관에서 10 μl DNase I 모액을 70 μl 완충액 RDD에 첨가한다. 상기 튜브를 가볍게 플리킹(flicking)하여 혼합하고, 짧게 원심분리하여 튜브의 측면에서 잔여 액체를 수집한다.
DNase I 인큐베이션 혼합물 (80 μl)을 PAXgene RNA 스핀 칼럼 막 상에 직접 피펫팅하고, 벤치톱 (20-30℃)에 15분 동안 둔다. DNase I 인큐베이션 혼합물이 상기 막 위에 바로 놓여있는지 확인한다. 상기 혼합물의 일부가 스핀 칼럼의 벽 또는 O-링에 부착되어 남아있는 경우 DNase 소화는 불충분할 것이다.
350 μl 완충액 BM3을 PAXgene RNA 스핀 칼럼 내로 피펫팅하고, 18,500 x g에서 15초 동안 원심분리한다. 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 처리 튜브에 넣고, 통과액을 포함하는 이전 처리 튜브를 폐기한다.
500 μl 완충액 BM4를 PAXgene RNA 스핀 칼럼으로 피펫팅하고, 10,000 x g에서 15초 동안 원심분리한다. 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 처리 튜브에 넣고, 통과액을 포함하는 이전 처리 튜브를 폐기한다.
또 다른 500 μl 완충액 BM4를 PAXgene RNA 스핀 칼럼에 첨가한다. 18,500 x g에서 2분 동안 원심분리한다.
통과액을 포함하는 튜브를 버리고, PAXgene RNA 스핀 칼럼을 새로운 2 ml 처리 튜브에 넣는다. 18,500 x g에서 1분 동안 원심분리한다.
통과액을 포함하는 튜브를 버린다. PAXgene RNA 스핀 칼럼을 표지된 1.5 ml 마이크로원심관 (최종 튜브)에 넣고, 40 μl 완충액 BR5를 PAXgene RNA 스핀 칼럼 막 상에 직접 피펫팅한다. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시킨다. 최대 용출 효율을 달성하기 위해 전체 막을 완충액 BR5로 습윤시키는 것은 중요하다.
40 μl 완충액 BR5 및 동일한 마이크로원심관을 사용하여 기재된 대로 용출 단계를 반복한다. 20,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시킨다.
진탕 없이 진탕기-인큐베이터에서 65℃에서 5분 동안 용출액을 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 얼음 위에서 즉시 냉각시킨다. 65℃에서의 이러한 인큐베이션은 다운스트림 적용을 위해 RNA를 변성시킨다. 인큐베이션 시간 또는 온도를 초과하지 않는다.
RNA 샘플이 바로 사용되지 않을 경우, -20℃ 또는 -70℃에서 보관한다. RNA는 반복된 동결 및 해동 후 변성되기 때문에, 65℃에서 인큐베이션을 반복하는 것이 필요하지 않다.
실시예 5: RNA 수준 측정
폐암을 진단하기 위한 임상 실시에서 사용될 수 있는 마이오마커 시그니처를 제공하기 위해, 만족스러운 정확도를 유지하는 최소 수의 유전자를 갖는 유전자 발현 프로파일은 표 I에서 식별된 100개 이상의 유전자를 사용할 뿐만 아니라 표 II에서 식별된 10개 이상의 유전자를 사용함으로써 제공된다. 이러한 유전자 프로파일 또는 시그니처는 표준 임상 실험실에서 사용하기 용이한 더 간단하고 더 실용적인 검사를 가능하게 한다. 식별 유전자의 수가 충분히 작기 때문에, NanoString nCounter® 플랫폼은 이러한 유전자 발현 프로파일을 사용하여 개발된다.
A. NanoString nCounter® 플랫폼 유전자 발현 검정 프로토콜
상기에 기재된 바와 같이, Paxgene Blood miRNA 키를 사용하여 전혈로부터 총 RNA를 단리하고, 샘플을 RNA 품질에 대해 확인하였다. 샘플을 양호한 샘플 완전성에 대한 지표로서 RIN 스코어 및 전기영동도 사진을 사용하여, RNA 나노 칩 상에서 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석하였다. 샘플을 또한 260/280 및 260/230 판독 값이 기록되고, Nanostring-호환성에 대해 평가된 Nanodrop (ND-1000 분광측정기)에서 정량화하였다. Nanodrop에 의해 얻어진 농도로부터, 총 RNA 샘플은 뉴클레아제-비함유 물을 희석제로서 사용하여 Nanostring-제공된 튜브 스트립에 5μL 중 100ng를 포함하도록 정규화되었다. Nanostring nCounter Reporter CodeSet와 혼성화 완충액의 혼합물의 8μL 분취액 (12개의 검정당 70μL 혼성화 완충액, 42μL Reporter CodeSet) 및 2μL의 캡처 프로브셋을 5μL RNA 샘플 각각에 첨가하였다. 샘플을 테르모사이클러 (Eppendorf)에서 65℃에서 19시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 동안, 사용자에게 관심있는 각각의 mRNA에 특이적인 형광 바코드를 갖는 리포터 프로브 및 바이오티닐화된 캡처 프로브를 그것의 관련된 표적 mRNA에 결합시켜 표적-프로브 복합체를 생성하였다. 혼성화가 완료된 후, 이어서 샘플을 표준 프로토콜 세팅 (실행 시간: 2시간 35분)을 사용하는 처리를 위해 nCounter Prep Station으로 전달하였다. 표준 프로토콜 동안, Prep Station 로봇은 샘플을 세정하여 과잉의 리포터 및 캡처 프로브를 제거하였다. 샘플을 스트렙타비딘-코팅된 카트리지로 이동시켜 정제된 표적-프로브 복합체가 nCounter 디지털 분석기에 의한 이미징 준비를 위해 고정되었다. 완료되면, 상기 카트리지를 밀봉하고, 555에서의 관측 시야 (Field of View; FOV) 세팅을 사용하여 디지털 분석기에 배치하였다. 형광 현미경은 표적 mRNA와 관련된 각각의 고유한 바코드에 대한 원시(raw) 카운트를 표로 작성하였다. 수집된 데이터를 .csv 파일로 저장한 다음 제조자의 지침에 따른 분석을 위해 생물정보학 시설에 전송하였다.
실시예 6: 마이오마커 선택
서포트 백신 머신 (SVM)을 유전자 기능 발견 및 분류를 위한 유전자 발현 데이터세트에 적용할 수 있다. SVM은 마진(margin)에 있는 보다 밀접하게 관련된 사례 및 대조군을 구별하는데 가장 효율적인 것으로 밝혀졌다. 주로 SVM-RFE (48, 54)는 임상적으로 정의된 대조군 부류 (흡연자, 비-흡연자, COPD, 육아종, 등)로부터 임상적으로 정의된 환자 부류를 구별하는 유전자 발현 분류기를 개발하는데 사용되었다. SVM-RFE는 당업계에 이용되는 SVM 기반 모델로, 분석되는 2가지 부류 사이의 식별력에 대한 기여에 기반하여 유전자를 회귀적으로 제거한다. 계수 가중치에 의해 최저 평점 유전자를 제거하고 나머지 유전자를 다시 채점하고 소수의 유전자가 남아있을 때까지 상기 절차를 반복하였다. 이 방법은 분류 및 유전자 선택 작업을 수행하기 위해 몇몇 연구에서 사용되었다. 그러나, 적절한 값의 알고리즘 파라미터 (패널티 파라미터, 커넬-함수(kernel-function), 등)의 선택은 종종 성능에 영향을 줄 수 있다.
SVM-RCE는 SVM-RFE와 같이 분류기에 대한 유전자의 상대 기여도를 평가한다는 점에서 관련 SVM 기반 모델이다. SVM-RCE는 개별 유전자 대신에 상관된 유전자 그룹의 기여도를 평가한다. 추가로, 두 방법 모두 각각의 단계에서 가장 적게 중요한 유전자를 제거하지만, SVM-RCE 스코어는 유전자의 클러스터를 제거하는 반면, SVM-RFE 스코어는 알고리즘의 각 라운드에서 단일 또는 작은 수의 유전자를 제거한다.
SVM-RCE 방법은 여기에 간단히 기재된다. 저발현 유전자 (2x 배경보다 더 낮은 평균 발현)를 제거하고, 변위치 정규화(quantile normalization)를 수행한 다음 중앙 발현 값이 데이터세트의 중앙값으로부터 3 시그마 이상 상이한 "이상치" 어레이를 제거하였다. 나머지 샘플은 알고리즘의 10배 교차-검증의 10회 반복을 사용하여 SVM-RCE를 받았다. 유전자는 t-검사 (훈련 세트에 적용됨)에 의해 최종 결과에서 최고의 정확도를 산출하는 실험적으로 결정된 최적의 값으로 감소되었다. 이러한 개시 유전자는 K-평균에 의해 평균 크기가 3-5개 유전자인 상관 유전자의 클러스터로 클러스터링되었다. SVM 분류 평점 체계는 3배 재샘플링을 5회 반복하여 각각의 클러스터에 대해 수행되었고, 최악의 평점 클러스터가 제거되었다. 정확도는 샘플 (시험 세트)의 레프트-아웃(left-out) 10%를 사용하여 생존한 유전자 풀에서 결정되며 높은 평점을 받은 100개의 유전자가 기록되었다. 상기 절차는 클러스터링 단계부터 2개의 클러스터 종점까지 반복되었다. 최적의 유전자 패널은 가장 빈번하게 선택되는 유전자로 시작하여 최대 정확도를 제공하는 최소 수의 유전자로 취해졌다. 이 패널에서 개별 유전자의 동일성은 고정되지 않으며, 그 이유는 그 순서가 주어진 유전자가 상위 100개의 유익한 유전자에서 선택된 횟수를 반영하며, 이 순서는 약간의 차이가 있을 수 있기 때문이다.
A. 마이오마커 선택.
양성 결절로부터 암성 종양을 식별하는데 스코어가 가장 높은 (SVM 기준) 유전자를 임상 시험을 위한 그것의 유용성에 대해 검사하였다. 고려되는 인자는 부류 간의 발현 수준의 보다 높은 차이 및 부류 내 낮은 가변성을 포함한다. 검증용 바이오마커를 선택할 때 관련 유전자의 선택을 피하고 PCR 및/또는 면역-조직화학을 포함하는 대안적인 기술에 의해 견고한 차별적인 발현 수준을 갖는 유전자를 식별하기 위해 뚜렷이 다른 발현 프로파일을 갖는 유전자를 선택하고자 하는 노력이 이루어졌다.
B. 검증.
3가지 검증 방법이 고려되었다.
교차-검증: 데이터세트 내 과-적합화(over-fitting)를 최소화하기 위해, 데이터세트를 K 부분으로 무작위로 분할하고, K-1 부분을 훈련용으로 사용하고, 1 부분을 시험용으로 사용하는 경우, K-폴드 교차-검증 (K는 일반적으로 10임)이 사용되었다. 따라서, K=10의 경우 알고리즘은 환자의 90% 및 대조군의 90%를 무작위로 선택하여 훈련시킨 다음 나머지 10%에서 시험하였다. 이것은 모든 샘플이 시험 대상체로서 이용될 때까지 반복되었고, 누적된 분류기는 모든 샘플을 사용하지만, 샘플은 일부인 훈련 세트를 사용하여 시험되지 않는다. 무작위화 영향을 감소시키기 위해, K-폴드 분리를 M회 수행하여 매회 K 폴드마다 환자 및 대조군의 상이한 조합을 생성하였다. 따라서, 개별 데이터세트에 대해 M*K 라운드의 순열식 훈련 및 시험 세트의 선택이 각각의 유전자 세트에서 사용되었다.
독립적인 검증: 데이터의 재현성 및 분류기의 일반성을 평가하기 위해, 하나의 데이터세트를 사용하여 형성되고 분류기의 성능을 평가하기 위해 또 다른 데이터세트를 사용하여 검사된 분류기를 조사해야 한다. 성능을 평가하기 위해, 최초 데이터세트로 개발된 분류기를 사용하여 제2 세트에 대한 검증을 수행하였다.
재샘플링 (순열): 질환 상태에 대한 분류기의 의존성을 입증하기 위해, 데이터세트의 환자 및 대조군을 무작위로 선택하고 (순열), 분류를 반복하였다. 무작위화된 샘플을 사용한 분류의 정확도를 개발된 분류기의 정확도와 비교하여 분류기에 대한 p 값, 즉, 분류기가 우연히 선택되었을 가능성을 결정하였다. 이런 방식으로 개발된 분류기의 일반성을 검사하기 위해, 그것은 분류기를 개발하는데 사용되지 않은 독립적인 샘플 세트를 분류하는데 사용되었다. 순열식 및 최초 분류기의 교차-검증 정확도를 독립적인 시험 세트에서 비교하여 신규한 샘플을 분류하는데 그것의 유효성을 확인하였다.
C. 분류기 성능
각각의 분류기의 성능을 상이한 방법으로 평가하였고, 몇 가지 성능 측정이 분류기를 서로 비교하는데 사용되었다. 이러한 측정은 정확도, ROC 곡선하 면적, 감도, 특이도, 진양성률 및 진음성률을 포함한다. 관심 있는 분류의 필수 특성에 기초하여, 상이한 성능 측정이 최적의 분류기를 선택하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 전체 집단의 선별에 사용하는 분류기는 질환의 작은 유병률 (~1%)을 보완하기 위해 더 나은 특이도를 요구하므로 다수의 거짓 양성 적중(false positive hit)을 피할 수 있는 반면, 병원 내 환자의 진단 분류기는 더 민감해야 한다.
양성 결절로부터 암성 종양을 진단하기 위해서는, 환자가 이미 위험도가 높기 때문에 더 높은 감도가 특이도보다 더 바람직하다.
실시예 7:
분류기의 시험
말초 혈액 샘플을 모두 PAXgene RNA 안정화 튜브에 수집하고, RNA를 제조자에 따라서 추출하였다. 샘플을 559개 프로브 (표 III)의 사용자 지정 패널(custom panel)에 대해 Nanostring nCounterTM (상기에 기재된 바와 같음)에서 시험하였다. 또한, 상기 샘플을 559개 마커 패널의 100개 프로브 서브셋에 대해서도 시험하였다.
559개 분류기에 대해, 이전의 마이크로어레이 데이터에 기초하여 432개가 선택되었고, Nanostring 연구로부터 107개의 프로브가 선택되었고, 20개는 하우스키핑 유전자였다. 본 발명자들은 5개의 수집 부위로부터 유래된 PAXgene RNA 샘플 610개 (암 278개, 대조군 332개)를 분석하였다. QC를 위해, 보편적인 RNA 표준 (Agilent)을 36개 시험 샘플의 각각의 배치에 포함시켰다. 프로브 발현 값은 20개의 하우스키핑 유전자 뿐만 아니라 Nanostring에 의해 공급된 스파이크-인(spike-in) 양성 및 음성 대조군 (분류기에 포함됨)을 사용하여 정규화되었다. Z스코어는 프로브 카운트 값에 대해 계산되며, 다항 커넬(polynomial kernel)을 사용하여 서포트 백신 머신 (SVM) 분류기로의 입력값으로 사용되었다. 분류 성능은 샘플의 10배 교차-검증으로 평가되었다.
A. 559개 분류기
도 2a 내지 2b에서 나타낸 바와 같이, 모든 샘플에서 개발된 559개 분류기 는 0.81의 ROC-AUC를 나타냈다 (도 2a). 90%로 설정된 감도에서, 특이도는 46%이다. 556개 샘플 (암 278개, 결절 278개)의 균형을 이룬 세트에서 수행될 때, 유사한 성능을 나타냈다 (도 2b). 두 세트에 대해, UHR 대조군, 사후 샘플, 및 기타 암을 갖는 환자는 배제되었다.
결절 분류 정확도가 감도에 대한 특정 역치를 사용하지 않고 크기별로 평가되는 경우, 본 발명자들은 결절 크기 및 암 위험 인자가 증가함에 따라, 암으로 분류되는 양성 결절의 수도 증가한다는 것을 발견했다. 도 3. 이 분석에서, 8mm 이하의 결절은 그 당시 88.9%로 정확하게 분류되었고, 8mm보다 크고 12mm 이하인 결절의 경우 정확도는 75%였고, 12mm보다 크고 16mm 이하의 결절의 경우 정확도는 68%였고, 16mm가 넘는 결절의 경우 정확도는 53.6%이다. 아래 표 IV를 참조한다.
[표 IV]
제2 세트의 결절을 시험하고, 크기 그룹에 대한 분류기의 정확도를 샘플 그룹 (암 대 양성 결절)별로 결정하였다. 유사하게, 결절 크기 및 암 위험 인자가 증가함에 따라, 암으로 분류된 양성 결절의 수도도 증가한다 (도 4a 내지 4c). >5mm 이상의 암의 경우, r=0.95이다. 모든 크기의 결절에 대해, r=0.97이다. 차트는 병변 크기에 기초한 암 및 결절 분류의 감도 및 특이도를 나타낸다. 이들 숫자는 아래에서 막대그래프 형태로 보여준다.
분류 정확도가 양성 결절 크기와 역의 상관관계인 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자들은 10mm보다 작은 결절 (n=244)만을 사용하여 데이터를 재분석하였고 (도 5a), 감도는 90%로 고정하였고, 이 경우에 특이도는 54%로 상승하고, ROC-AUC는 0.85로 상승한다. 10mm가 넘는 더 큰 결절 (n=88)의 경우, 특이도는 24%로 떨어지고, ROC-AUC는 0.71로 떨어진다 (도 5b). 아래 표 V를 참조한다.
[표 V]
B. 100개 마커 분류기
본 발명자들은 이제, 전체 패널로 얻어진 성능을 유지하기 위해 요구되는 최소 수의 프로브를 식별하기 위해 Nanostring 플랫폼에서 W559에 의해 분석된 633개 샘플로부터의 데이터를 재분석하였다. 본 발명자들은 이전에 기재된 바와 같이 프로브 선택을 위해 SVM-RFE를 사용하였다. 본 발명자들은 SVM-RFE를 사용한 훈련 세트에 대해 데이터의 75%를 사용하였고, 샘플의 25%로 구성된 독립적인 시험 세트에서 이러한 과정에 의해 선택된 상위 100개 프로브 (표 II)의 성능을 시험하였다. 샘플은 아래 표 VI의 훈련 및 시험 세트에 대해 무작위로 선택되었다. 시험 세트에서 얻어진 정확도는 도 6에서 나타냈다. 이 분석에서, 90%의 감도에서, 특이도는 62%였고, 79%의 감도에서, 특이도는 68%였고, 71%의 감도에서, 특이도는 75%였다 (도 6). 요약하면 ROC-AUC는 0.82이고, 0.90의 감도에서 본 발명자들은 0.62의 특이도를 달성한다.
[표 VI]
2016년 6월 21일자로 출원된, 우선권 출원, US 가특허 출원 번호 62/352,865를 포함하는 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 공보, 및 본 개시내용 전체에서 인용된 공개적으로 이용가능한 유전자 서열은 그 전문이 본 명세서에 참고로 명확히 편입되어 있다. 본 발명이 특정 구현예와 관련하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련가에 의해 고안된다는 것이 명백하다. 첨부된 청구항들은 그와 같은 구현예 및 상응하는 변형을 포함한다.
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aaggaagact gtgtgtagaa tcttacgtaa tagtctgatt ctttgactct gtggctagaa 60
tgacagttat ctatggaggt ggtagaatta agccatacct 100
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cctaaacaaa caagaggtga ccaccttatt gtgaggttcc atccagccaa gtttatgtgg 60
cctattgtct caggactctc atcactcaga agcctgcctc 100
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ctcactgtga cccatcctta ctctacttgg ccaggccaca gtaaaacaag tgaccttcag 60
agcagctgcc acaactggcc atgccctgcc attgaaacag 100
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agccaatagt gatttgtttg catatcacct aatgtgaaaa gtgctcatct gtgaactcta 60
cagcaaatta tattttagaa aatactttgt gaggccgggc 100
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ctatcactca tgtcaatcat atctatgaga caaatgtctc cgatgctctt ctgcgtaaat 60
taaattgtgt actgaaggga aaagtttgat cataccaaac 100
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ttctagagtg agatttgtgt tttctgccct tttcctctcc agccgatggg ctggagctgg 60
gagaggtgct gagctaacag tgccaacaag tgctccttaa 100
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gccagtactc gggacagact aagggcgctt gtcccatcct ggacttttcc tctcatgtct 60
ttgctgcaga actgaagaga ctaggcgctg gggctcagct 100
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<213> Homo sapiens
<400> 8
ctaccacccg tccagtttga ctggagtagc agtggcctta ctaacccttt agatggtgtg 60
gatccggagt tgtatgagtt aacaacttct aagctggaaa 100
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ctacccggca ggtaggttag atgtgggtgg tgcatgttaa tttcccttag aagttccaag 60
ccctgtttcc tgcgtaaagg tggtatgtcc agttcagaga 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
aatgaaatta ctgtagagtc agcaaagaag tagagaagaa aaaacaccaa gaatgaggag 60
aacctagcaa gggcaggctt ttggaagcaa gaggtagata 100
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
agaatttctt ggtagcttta caccgaaaaa tgcgtgtaac taaataccag acatcttgac 60
cattcagcta gaaccctggc agcaacagag ctatttaatt 100
<210> 12
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
cccctccagc cagccctgcg tggttgtggc cccactgcag aaacgcctcc gcttaacact 60
ccagcctctc ttctattcgg tcaggccaca gctgctgact 100
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gtacctggta gaaattgtgt cttggaatga ccctttcgag ttattgacat ggctctgatg 60
aatagaacat gagccccaaa actaaatcca aaaggaattt 100
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
cttattgatt agtgaatgta gcttaagcct ttgtatgtgt cctcaggggg cagaccgact 60
ttaagaggga ccagataacg tttgaatgga gggattatat 100
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ctgtaagtgt cctcaactgg cttctcagtg atctccagaa gtatgccttg ggtttccaac 60
atgcactgag cccctcaacc tctacctgta aacataaagt 100
<210> 16
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gaggacgtct ctatgccggt gactggacat atcacctcta cttaaatccg tcctgtttag 60
cgacttcagt caactacagc tgagtccata ggccagaaag 100
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
ggggatcggg atggagtcat gccaaaaatg gacatcattt ctggaacact tggcaaagcc 60
tttggttgtg ttggagggta catcgccagc acgagttctc 100
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
accaccctct tgctgaaagc actggttccc ctgttgaagc ttgctaggga ttacagtggg 60
tttgactcaa ttcaaagctt cttttattct cgtaagaatt 100
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gtgatgctca ggggctgtca aagtgactgc gttcatcagt tttacactgg ggctgctaca 60
taatattttc atttgaacga agaacttcaa aaagcacagg 100
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
cttggaaccc tatgataaaa gttatccaaa attcaactga atgcactgat gcccagcaga 60
tttggcctgg cacgtgggca cctcatattg gaaacatgca 100
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
caccttggaa cctttgaaaa agttagaatg tctgaaaagc ctggacctct ttaactgtga 60
ggttaccaac ctgaatgact accgagagag tgtcttcaag 100
<210> 22
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
gaaatcagag acattaacag ggtctacaga gaggaactga agagagatct ggccaaagac 60
ataacctcag acacatctgg agattttcgg aacgctttgc 100
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tggatgaaac caaaggagat tatgagaaaa tcctggtggc tctttgtgga ggaaactaaa 60
cattcccttg atggtctcaa gctatgatca gaagacttta 100
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
cgagtaaccg tgccgttgtc gtgtgatgcc ataagcgtct gtgcgtggag tccccaataa 60
acctgtggtc ctgcctggcc ttgccgtcaa aaaaaaaaaa 100
<210> 25
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
aaactccaga acagcagaaa gcgggtgctg tagaggagca ctcagctcac ggggagggag 60
ctcttggctg agcttctaca gggctgagag ctgcgctttg 100
<210> 26
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
cacttttagc tggttgaaaa gtaccactcc cactctgaac atctggccgt ccctgcaaag 60
agtgtactgt gcttgaagca gagcactcac acataaatgg 100
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
aaggaactaa aaggaaagat tcccgatgtg ccaggattct cctgggtgac tccctgtata 60
tctgccaagg atattgtgta tattggcttg agagacgtgg 100
<210> 28
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
ttcggacttg ctcgggaggg taatcacaag cctattgact accttaaccc acctaagtaa 60
atgtggaaac atccgatata aatctcatag ttaatggcat 100
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
catgtatggt ctgtgtctcc ccagtcccct cagaaccatg cccatggatg gtgactgctg 60
gctctgtcac ctcatcaaac tggatgtgac ccatgccgcc 100
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
tttttgacca aaaagataac aaataccagg tatggcaagt tgtgaagaca gcacattaaa 60
acatacctaa tttcacagta ttcctgtcac gacagaatgt 100
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
tccctgagct ttcccagtag cctccagttt cctttgtaag acccagggat cacttagcca 60
tagcctgaat cttttagggg tattaaggtc agcctctcac 100
<210> 32
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
gattacaaca tttcctcact gcgggatatt tctgacccgc tttagaactt aagacctgat 60
tctagcaata aacgtgtccg agatgagcgg tgaaaaaaaa 100
<210> 33
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gaatgtgtct cctccacagt ggctcccaga ggttccacac actctctgaa gctccttctc 60
ccacactgca cctactcctt gaggctgaac tggtcacaga 100
<210> 34
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
gggggaccat tggggcctga gccaaggaac tttccttcta ctgccttata gtgcttaaac 60
attctccgcc tccagggtgc agattcagag ctggccagag 100
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
accattacaa agaatgtggc aacttgcttg tgcctaaaag gaggaattgg aactagaatg 60
tgtgactctg tggggactgc ataggtttgt taattgacct 100
<210> 36
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
acggggaaga cgttttcatc ccgctaatct tgggaataag aggaggaagc ggctggcaac 60
tgaaggctgg aacacttgct actggataat cgtagctttt 100
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
ctgtctccgg gccagggtca gggaccctct gcctctggca gccttaacct gtcctctgct 60
aggaccaggg tgatttcaag ccagggaagc aactgggacc 100
<210> 38
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
ggacgcagct actctgacct acgacactct ccggtttgct gagtttgaag attttcctga 60
gacctcagag cccgtttgga tactgggtag aaaatacagc 100
<210> 39
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
tgcagtggct gagtgaacat ctgagctacc cggataattt tcttcatatt agtatcatcc 60
cacagccaac agattgaagg atcaactatt tgcctgaaca 100
<210> 40
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
acgctaagtc gctggccatt ggtggacatg gcgcaggcgc gtttgctccg acgggccgaa 60
tgttttgggg cagtgttttg agcgcggaga ccgcgtgata 100
<210> 41
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
taaaaagtcc ccaaacccaa acaaatggtt tatgaaccag agtatatgtg gaagattctt 60
tgctggtctt gctctgtgtg catctgaagc ttctttggcc 100
<210> 42
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
ctatatggtg ggacccattg aagaagctgt ggcaaaagct gataagctgg ctgaagagca 60
ttcatcgtga ggggtctttg tcctctgtac tgtctctctc 100
<210> 43
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
ttgccagaga attggcagaa gatgacagca tattaaagtg agtgaccctg cgacccactc 60
tttggaccag cagcggatga ataaagcttc ctgtgttgtg 100
<210> 44
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
gctggcatgc tacgtgctct ttagctactc cttttcctac aagcatctca agcacgagcg 60
gctccgcaaa taccactgaa gaggacacac tctgcacccc 100
<210> 45
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
gggacggggt cctgcagcgg gtccttccgg cgggtgacat tcagccggcg gttcggggcg 60
acggactctc cattccagaa ccatggccca atttgtccgt 100
<210> 46
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
agcagaaggc aggggagtcc acacagggca agcagcaacc aggcttctga ggacaggaaa 60
ggagggagca tctggtggga agctggcgag gaggggctgg 100
<210> 47
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
gatatctcac acacggaata atcattaaga aacaaccact gttgagcaaa gttgataggc 60
agtaaggaaa taaagtggac ataaacacag cagtactaat 100
<210> 48
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
gaattggtgt cagatgctgg aatttattct gaccaatgaa cacagctgac tcaggggagt 60
acaatctcct gccaagtaat agaaccaaac ccaatatgca 100
<210> 49
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
tccagaacca gtctgatgca agtgcacctc taatatatgc cttacaaact ccagaggcca 60
tattcaaaac agggtcttct cagtgtatgc aaggggctgc 100
<210> 50
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
ccccaccacc tgttagctgt ggttgtgcac tgtcttttgt agctctggac tggaggggta 60
gatggggagt caattaccca tcacataaat atgaaacatt 100
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
ggagcccttt gctgtgtgct ctgtccagtg tcatgaggca ggtgtttgca aagccagctc 60
tcggttccga tggggtattg ctgacctact tttctagggg 100
<210> 52
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
cctggcaaac aggactcatc tgatgatgtg agaagagttc agaggaggga gaaaaatcgt 60
attgccgccc agaagagccg acagaggcag acacagaagg 100
<210> 53
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
tgaaaatacc atcttctctt caactacact tcccagacct ggggacccag gggctcctcc 60
tttgccacca gatctacagt tagaagaaga aggaacttgt 100
<210> 54
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
cctcacggtg ccttttttca cggaagtttt caatgatggg cgagcgtgca ccatcccttt 60
ttgaagtgta ggcagacaca gggacttgaa gttgttacta 100
<210> 55
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
atacaaagct ctgatgacag gccatgactg tagagtggtc agaactgtgt ggttggtttg 60
agggagcgaa ttcggggaag gcacttggtg atataacttt 100
<210> 56
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
tgtatttctg tgcaatgaga gaggctcttt atggtggtgc tacaaacaag ctcatctttg 60
gaactggcac tctgcttgct gtccagccaa atatccagaa 100
<210> 57
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
aagcacgaca gtggatgctg ggtccatatc acacacattg ctgtgaacag gaaactcctg 60
tgaccacaac atgaggccac tggagacgca tatgagtaag 100
<210> 58
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
cagcggccct ggcgggtgcc ctggctacca tggaccatcc tgctggtcag cactgcggct 60
gcttcgcaga atcaagaacg gctatgtgcg tttaaagatc 100
<210> 59
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
gctggagtga ttggccctga tgaccatgga gaaaagagag tagggagaac agtataacca 60
gaagtcaggg gggtctcctg gaatccctcc tcacaatacc 100
<210> 60
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
ccctgtgggc cttgcaggcc agtccaggca ggtctttcac actgttgtcc cacataacag 60
aaaaagctga gcagacaggg taggaaacac acttgcatct 100
<210> 61
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
ttaagcaact tgctccagtg acgcagctgg taagcagcag agctgggatt aaaacccagg 60
cattctgatt ccaccaccta cacacttagc cattccgccc 100
<210> 62
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
atttagggtg agagcttcac agctgaaaat ctcctttaaa gaaaacgcgg cccaaatgtg 60
ctgggaggag aagccagtgg atctaggagg gggcccggcg 100
<210> 63
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
atattttgga gagggaagtt ggctcactgt tgtagaggac ctgaacaagg tgttcccacc 60
cgaggtcgct gtgtttgagc catcagaagc agagatctcc 100
<210> 64
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
atgcagacaa tttgcctgtg agatgaggaa aattctctgg aagatttagg ccctgagagc 60
tgaaaaggga ccctaaacat tacctggtga caactgccct 100
<210> 65
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
cctgagcttt taacgtgagg gtctttattg gataggacta ctccctattt cttgcctaga 60
gaacacacat gggctttgga gcccgacaga cctgggcttg 100
<210> 66
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
aaggatgggg gtggattgac caagctgggc cagaggtgcg aggagctgat ctgcgagccc 60
tgtgtgcctg tgagtcctgg cggagtggcc gtgcgtggtg 100
<210> 67
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
catctacctg gacaaggtct cacactctga ggatgactgt ctagctttca aagttcacca 60
atactttaat gtagagctta tccagcctgg agcagtcaag 100
<210> 68
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 68
gagtccaggg tgcactacac cgtgtgcatc tggcggaacg gcaaggtggg gctgtctggc 60
atggccatcg cggacgtcac cctcctgagt ggattccacg 100
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
gaaccgtgaa gatgaaacag agagataaga aagttgtgac aaagaccttt catggtgcag 60
gcttggttgt tccagtagat aaaaatgatg ttgggtaccg 100
<210> 70
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 70
taaaagatga agttcaccca gaggtgaagt gtgttggctc cgtagccctg actgccttgg 60
tgactgtatc ctcagaagaa tttgaagaca agtggttcag 100
<210> 71
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
cgctggccat ggggaagcca cctccagggc agtcccaggg actgaattgg aagttgtccc 60
aagtcacttc aggtccaact gggacagcag aggtaacccc 100
<210> 72
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 72
ttgtccagag aatcaaggat tttttgcgga atcttgtacc caggacagag tcctagtgtg 60
tgccctaccc tggctcaggc ttctgggctc tgagaaataa 100
<210> 73
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
atttatccaa taatggacaa gtcaagccgc acacgtcttg ctctcattat ctgcaatgaa 60
gaatttgaca gtattcctag aagaactgga gctgaggttg 100
<210> 74
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
cccaccactc ttgactcagg tggtgtcctt cttcctcaag tcttgacaat tcccgggccc 60
ttcagtccct gagcagtcta cttctgtgtc tgtcaccaca 100
<210> 75
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
actccacagc acctggttat tattcttggc gaaattcaaa ggatggctcc tggttcatcc 60
agtcgctttg tgccatgctg aaacagtatg ccgacaagct 100
<210> 76
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 76
atgaggggga aaaaaactta tgtgtagtca atcttttaag ctttgactgt tttgggaagg 60
aagagtacct cttatcgagg tagtataaaa cacatagggt 100
<210> 77
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
ttgcataagc acagctcaag aactgagctt tgtatgtgtc cttttggggg ataacagggc 60
tggaccatgc ttccctgccc ttaaacgcag agcttttagt 100
<210> 78
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
gggagagggc ccacacagtc tcctcgccgg caccggcctc ctccattttt ccgggccttg 60
cgtggagggt tttggcggat gtttttgaac gaaggaatgt 100
<210> 79
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 79
atccagagtg agacagcatt ggagggacaa gtgtgcatgc agatgtcctc agacgggaag 60
gtttgagaag ggtcagatgg taggcgggcc taacaagggc 100
<210> 80
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 80
cagttctctg catcacttgc tgctgacacg ccgaccgcct gctgcttcag ctacacctcc 60
cggcagattc cacagaattt catagctgac tactttgaga 100
<210> 81
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 81
ggagcctgag ccttgggaac atgcgtgtga cctctacagc tacctcttct atggactggt 60
tattgccaaa cagccacact gtgggactct tcttaactta 100
<210> 82
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
ggggaggagc aggagcctga gccttgggaa catgcgtgtg acctccacag ctacctcttc 60
tatggactgg ttattgccaa acagccacac tgtgggactc 100
<210> 83
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 83
ttctgcagcc tcacctctga gaaaacctct ttgccaccaa taccatgaag ctctgcgtga 60
ctgtcctgtc tctcctcatg ctagtagctg ccttctgctc 100
<210> 84
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 84
ggccagccat gtctgcattt cggtggctag tcaagctcct cctccctgca tctgaccagc 60
agcgcctttc ccaactctag ctgggggtgg gccaggctga 100
<210> 85
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 85
catcatttgg gccctggcca tcttggcttc catgccaggc ttatactttt ccaagaccca 60
atgggaattc actcaccaca cctgcagcct tcactttcct 100
<210> 86
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 86
ctttaactgc gggatgctgc tcctgacttg cattagcatg gaccggtaca tcgccattgt 60
acaggcgact aagtcattcc ggctccgatc cagaacacta 100
<210> 87
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 87
ccctgttctc tatgtttttg tgggtgagag attccgccgg gatctcgtga aaaccctgaa 60
gaacttgggt tgcatcagcc aggcccagtg ggtttcattt 100
<210> 88
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 88
gcccaagggc accatgaaga tgctcgtttc tggcgctgga gacatcaaac ttactaaaga 60
cggcaatgtg ctgcttcacg aaatgcaaat tcaacaccca 100
<210> 89
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 89
gcccaagcac actcgcctgc cttttcctgc gaacaggttc gcgccttccc ggcccttacc 60
agcctagacc tgtctgacaa tcctggactg ggcgaacgcg 100
<210> 90
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 90
ttgatgttca ccataagcca agtcacaccg ttgcacagtg ggacctacca gtgttgtgcc 60
agaagccaga agtcaggtat ccgccttcag ggccattttt 100
<210> 91
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 91
aaaggaagac agccagatcc agtgattgac ttggcatgaa aatgagaaaa tgcagacaga 60
cctcaacatt caacaacatc catacagcac tgctggagga 100
<210> 92
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 92
cctgttttag atatccctta ctccagaggg ccttccctga cttacaagtg ggaagcagtc 60
tcttcctggt ctgaactccc gccacatttt agccgtactt 100
<210> 93
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 93
taaagaatct gaagaggaac tatattgtgc ctattctttg gcttaatgag actgggacca 60
ttggtgatga gaaggcaaac atgttcagaa gtcaagtaac 100
<210> 94
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 94
aatttaaagg cagggtcaga cttgatcctc agagtggcgc actgtacatc tctaaggtcc 60
agaaagagga caacagcacc tacatcatga gggtgttgaa 100
<210> 95
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 95
tatacagtgt cttacagaga aaagacataa gcaaagacta tgaggaatat ttgcaagaca 60
tagaatagtg ttggaaaatg tgcaatatgt gatgtggcaa 100
<210> 96
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 96
cctatgggtg cgtcctgcgg gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc 60
tcgtggtgtg catccagcgc ttcgcacagg ctcagcagca 100
<210> 97
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 97
tgaagatgaa aacctttatg aaggcctgaa cctggacgac tgctccatgt atgaggacat 60
ctcccggggc ctccagggca cctaccagga tgtgggcagc 100
<210> 98
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 98
gaagctggaa aagggccgca tggaagagtc ccagaacgaa tctctcgcca ccctcaccat 60
ccaaggcatc cggtttgagg acaatggcat ctacttctgt 100
<210> 99
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 99
agggctttgt ggaggacagg ccttgccctc aagaacgtcg tacctgacgc tgagcctgtc 60
atgagaatgc aacaggagca aaccaagtgt tgctgtgaca 100
<210> 100
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 100
tctccccttc tctgcctcac ctggtcgcca atccatgctc tctttctttt ctctgtctac 60
tccttatccc ttggtttaga ggaacccaag atgtggcctt 100
<210> 101
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 101
catgtgtcct ggttcccgtt tctccaccta gactgtaaac ctctcgaggg cagggaccac 60
accctgtact gttctgtgtc tttcacagct cctcccacaa 100
<210> 102
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 102
ctggttggtc tttattgagc acctactata tgcagaaggg gaggccgagg tgggaggatc 60
attggatctc aggagttcga gatcagcatg ggccacgtag 100
<210> 103
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103
tccaccctaa caaagtagga tggggttggg ggctaaatta attggagtgg ggcgaggaga 60
gagccagaaa acatagatcc gagggcagca gtgctgggtg 100
<210> 104
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
cgccgctccc tcatgctgcc cgggcccttc ctccaagacc ctacagagcc tgaggggcac 60
cttggcttcc gcctgtgcta gctttgccat gtcatctgga 100
<210> 105
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 105
actaaggaaa tggaatctta aaagtctatg acagtgtaac tctacagtct caaaatgacc 60
tgataaattg ataagacaaa gatgagatta ttggggctgt 100
<210> 106
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 106
gcatgtcttg taaagagagg ggatgtgcat ttgtgtgtga tgttggatag tcatccacgc 60
tcagtttgga ccattggagg aacttagtgt cacgcacaaa 100
<210> 107
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 107
agacttggtg tccaacagag tctaggctgg gttcattaca tgattcatga gccagaacca 60
catattcttc tctttagacg acctcttcca aaagatcaac 100
<210> 108
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 108
atttctactg aatcagcatc ttggcaagac agtgagaagg actgtgctag aatggaggct 60
cacctgctgg tgataaacac tcaagaagag caggatttca 100
<210> 109
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 109
tacgagagta tcaacagtat catccaagcc tgacctgcgt catggaagga aaggacatag 60
aagattggag ctgctgccca accccttgga cttcatttca 100
<210> 110
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 110
ccccatccaa cccttagact cacgaacaaa tccacctgag atcagcagag ccaccctaga 60
tcagctgaaa ctctaagcac aaaaataaaa acttatcact 100
<210> 111
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 111
cgtacgccgc tacctggaca gcgcgatgca ggagaaagag ttcaaataca cgtgtccgca 60
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<210> 112
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 112
gattatagcc gggatcgggg agatgcctac tatgacacag actatcggca ttcctatgaa 60
tatcagcggg agaacagcag ttaccgcagc cagcgcagca 100
<210> 113
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 113
ggcgccagag ctgggctctt caacacggca tttagcgcag aaagtcgtgg ttcaggcagt 60
atgggccgct gtgacaaaac acctaagact gggtagttta 100
<210> 114
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 114
tctgtgtttc cagccatctc gccctgccag cccagcacca ctgggaatca tggtgaagct 60
gatgcagcgt tgccgagggg gtgggttggg cgggggtggg 100
<210> 115
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 115
ttgaatactg ttctgtgacc ctgactgcta gttctgagga cactggtggc tgtgctatgt 60
gtggccatcc tccatgtccc gtccctgtag ctgctctgtt 100
<210> 116
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 116
aggaaactaa gacatggaaa ggttaggtaa cttgcccaag gtcgcacagc tagtaagtgg 60
cagacatcca gagtctctgc tctgctctta actctcacca 100
<210> 117
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 117
aatgactgaa gctggagaag ccgtggttga agtcagccta cactacagtg cacagttgag 60
gagccagaga cttcttaaat catccttaga accgtgacca 100
<210> 118
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 118
ttgcagtaag cgaacagatc tttgtgacca tgccctgcac atatcgcatg atgagctatg 60
aaccactgga gcagcccaca ctggcttgat ggatcacccc 100
<210> 119
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 119
acacaagcca ggctatccag cgaatcaaga acgactttca aaatctgcag caggtttttc 60
ttcaagccaa gaaggacacg gattggctga aggagaaagt 100
<210> 120
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 120
ctgtgtgcca ggcctcacag actcccagtt gggttgaaga atggttgact gagtttgatt 60
cttcctgtac cctcggtcgt ctgagctgtg tgcggacaac 100
<210> 121
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 121
ctctcgagtc cgggccgcaa gtcccagacg ctgcccatgg aggcgtccag cgagccgccg 60
ctggatgcta agtccgatgt caccaaccag cttgtagatt 100
<210> 122
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 122
aagtaaagtt gttgatggtg gtgaaacacc gtagggcatg tggttcaaag agaagcagga 60
gggcaaggga aagttaccct gatcttagtt tgtagcttat 100
<210> 123
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 123
gaagttttgc caaaacctcg gatgcgtggc cttctggcca ggcgtctgcg aaatcatatg 60
gctgtagcat tcgtgctatc cctgggggtt gcagctttgt 100
<210> 124
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 124
cagagccacc agaaacgtac acctgatttt catgacaaat acggtaatgc tgtattagct 60
agtggagcca ctttctgtat tgttacatgg acatatgtag 100
<210> 125
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
caaggtcgtg aaaaaaaagg tcttggtgag gtgccgccat ttcatctgtc ctcattctct 60
gcgcctttcg cagagcttcc agcagcggta tgttgggcca 100
<210> 126
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 126
tgtatttgtt tctttacaac aggtgtaggt ataggaggtc aagaaaagga gttcggtaaa 60
gggcatagct aataacaacc acacattggg ccaggcacag 100
<210> 127
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 127
ggtgtcaagc aaataatatg tgggggccga cacgactacc aacctgtgta agtgttttcc 60
ctctcgagtg tccagcactt cctatgatcc acaatggaca 100
<210> 128
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 128
agcccagttt cactgccata tactcttcaa ggactttctg aagcctcact tatgagatgc 60
ctgaagccag gccatggcta taaacaatta catggctcta 100
<210> 129
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 129
tttgatggta ggtcagcagc agtgctagtc tctgaaagca caataccagt caggcagcct 60
atcccatcag atgtcatctg gctgaagttt atctctgtct 100
<210> 130
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 130
acctactcac ctttttccct tctaagttct gctaaatcac atctgcctca tagagaaagg 60
aatgttgcct ttgagaactg tcttggagaa cagataagct 100
<210> 131
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 131
ttctaaagga gcagaaggac aggtctctga gacaggatcg ttgtccctac aggaggaaca 60
gtggccttgc ttcttagacg gtcttcactg tgtgttttaa 100
<210> 132
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 132
cagctcaggt ggccctgagg gctccctcgg aacagtgcct caaatcctga cccaagggcc 60
agcatgggga agagatggtt gcaggcaaaa tgcactttat 100
<210> 133
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 133
cctcctagca agacctgttg gttagctgga catgctttgg caattttttt atactaccaa 60
gtgaccataa aggcatggca tttgttgtga ctggcaccca 100
<210> 134
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 134
tctagggacc cctcgcccca gcctcattcc ccattctgtg tcccatgtcc cgtgtctcct 60
cggtcgcccc gtgtttgcgc ttgaccatgt tgcactgttt 100
<210> 135
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 135
caaccacacc ttgaagcaga ctctgagctg ctactctgaa gtctgggtcg tgccctggct 60
ccagcacttc gaggtgcctg ttctccgttg tcactgaccc 100
<210> 136
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 136
gcggggccag ggggccggag agccgcctgc ttgagttcta cctcgccatg cctttcgcga 60
cacccatgga agcagagctg gcccgcagga gcctggccca 100
<210> 137
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 137
gaggtcgggc cagctgcccc attcttttaa cgttgtaggg cctgcccatg gagcggaccc 60
tcctctttgg gcctcgtgag cttttttgct tatcatgttc 100
<210> 138
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 138
tgcaccgagg gagcaatacc tgtggcatca ccaagttccc gctcactgcc cgtgtgcaga 60
aaccggatat gaagccccga gtctcctgcc ctccctgaac 100
<210> 139
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 139
cactggctgc gagtgttcct gagagttgaa agtgggatga cttatgacac ttgcacagca 60
tggctctgcc tcacaatgat gcagtcagcc acctggtgaa 100
<210> 140
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 140
agcaccacgg tgtgacgaaa tgcaacatca cgtgcagcaa gatgacatca aagatacctg 60
tagctttgct catccactat caacagaacc aggcatcatg 100
<210> 141
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 141
atcacatgtc agccactgtg atagaggctg aggaatccaa gaaaatggcc agtgagatca 60
atgtgacggc agggaaatgt atgtgtgtct attttgtaac 100
<210> 142
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 142
acctcaaaaa tggaagattt taacatggag agtgacagct ttgaagattt ctggaaaggt 60
gaagatctta gtaattacag ttacagctct accctgcccc 100
<210> 143
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 143
acgtcccttt tttctctgag tatctcctcg caagctgggt aatcgatggg ggagtctgaa 60
gcagatgcaa agaggcaaga ggctggattt tgaattttct 100
<210> 144
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 144
actggagagg gtacctcagt tataaggagt ctgagaatat tggccctttc taacctatgt 60
gcataattaa aaccagcttc atttgttgct ccgagagtgt 100
<210> 145
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 145
cttacaccaa actactgaat gaagcagtat tttggtaacc aggccatttt tggtgggaat 60
ccaagattgg tctcccatat gcagaaatag acaaaaagta 100
<210> 146
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 146
gttcttggtc tgtatgtgta ggtggaggga ggcaaagttg tggtaataaa gtgggaaggc 60
ccgggaagaa cagctaactg tataggggtg aaatgacgct 100
<210> 147
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 147
cataaataca gaacggcccg ggatgttgga cttcacgggc aaggccaagt gggatgcctg 60
gaatgagctg aaagggactt ccaaggaaga tgccatgaaa 100
<210> 148
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 148
ttaacactgt gctgtgaaac aactatgggg aatctccatt gaaggctact tcatgggcac 60
ctgaaagtgg agtgttatag ctatgacttt ctatttcttg 100
<210> 149
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 149
gacctgttgt aggcagctat cttacagacg catgaatgta agagtaggaa ggggtgggtg 60
tcagggatca cttgggatct ttgacacttg aaaaattaca 100
<210> 150
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 150
attgcactgg gccatcagct catgccaggc tatgggggca gccagttggc attgctcccc 60
agactgaaca gaaacctggc cgccggatgg gacctccttt 100
<210> 151
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 151
acatcgagtg gcatatctat caggactggc attcttttct cctgtgggag tttgccagcc 60
ggatcacatt acatggcttc atctacctcc aggcttctcc 100
<210> 152
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 152
ttgtaaagaa tctgtaacca ataccatgaa gttcaggctg tgatctgggc tccctgactt 60
tctgaagcta gaaaaatgtt gtgtctccca accacctttc 100
<210> 153
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 153
cccgtgtcaa cttctttctc cctggcggtg accacctggt tctgctaaat gtttacacac 60
agtgggctga gagtggttac tcttcccagt ggtgctatga 100
<210> 154
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 154
accaaagagt tcatgagaca ggtactggag attgagagca gttggcttct ggaggtggct 60
ccccattatt ataaggccaa ggagctagaa gatccccatg 100
<210> 155
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 155
ctcctgcagc ttctgtgagc caagccccag cctgcaccgt cgctgcccct tccctgccta 60
accctttcct gtctcgcctt ggaagcaccc atgtctccct 100
<210> 156
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 156
cacaatggct ggctctccca caactgtggc catcatgaag acgctggtgt catctgctca 60
gcttcccagt cccagccgac acccagccca gacacttggc 100
<210> 157
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 157
gacctctggc tccagtgaag ctgaatgtcc tcactttgtg ggtcacactc tttacatttc 60
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<210> 158
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 158
cttccctgca tgctccctcc cagtgacttt ccttcccttt cacatgagga tctgccgttc 60
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<210> 159
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 159
aaagagattt ccatttctgc tgccagagct ggtatttgcc tgcctgattc tctgtgtttc 60
ctgtttcacc gccacccttt caggagagaa ctacaccagt 100
<210> 160
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 160
tctcagctca tggggaagcc acatagacat ccctttcttc ccttgcacgc tcgctagcag 60
ctggtaaggt cttcacaccc tgattcctca agttttctgc 100
<210> 161
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 161
tttgggaact cggtggagga acctctttat tggacttaat cagcataccc atcacaggtg 60
acaccttacg gacgttttct cttgttctcg ttctggatct 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 162
cccagtgtct tgcccagtag atacaagata aatattgcca gaatcagata tcaggaagta 60
gtaagaaaag gagttaatat gcaaactaaa tcactcgctc 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 163
ggatacggaa ttaagaaact tcaaatacag tgtgtagttg aagatgataa agttggaaca 60
gatatgctgg aggagcagat cactgctttt gaggactatg 100
<210> 164
<211> 80
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 164
agcagcatgg acgacctgat acgccactgt aacgggaagc tgggcagcta caaaatcaat 60
ggccggacga aagccatggt 80
<210> 165
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 165
gaggcatacc aagatccact tgcggcagaa ggacaagaaa gcagacaaaa gtgttgtggc 60
ctcttcggcc acctcctctc tctcttccta cccgtccccg 100
<210> 166
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 166
tcaaacatta aatatcccga ggtctccttg gtgggtggca ggatttaaat tcaatcaaat 60
cctgtcctag tgtgtgcagt gtcttcggcc ctgtggacac 100
<210> 167
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 167
gccagtttag ttaactcagt cattaggggg aatgcaaact ggaagggaat acggcaatgt 60
gcaattgaag gaggaagcac actccgaaat ggaaacagac 100
<210> 168
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 168
gtctctaatg agctagatga ccctgatgat ctgcaatgta agcggggaga acatgttgcg 60
ctggctaact ggcagaacca cgcatcccta cggttgttga 100
<210> 169
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 169
cacactgggc aggaccctgc ttcatctcgg gttggtttat gggcttttac tttggagcac 60
tctgtgtgaa gctgtttggt ggaacccatg catctggtgt 100
<210> 170
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 170
gggaagacga ttggatcaat cattgcatac tcattcacca tcatcaacac ccttcaggga 60
gtgttgctct ttgtggtaca ctgtctcctt aatcgccagg 100
<210> 171
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 171
ccagccaggc ccaacagagc agtcctggat taggtttgat aaatagcatg gtcaaaagcc 60
caatgacaca ggcaggcttg acttctccca acatggggat 100
<210> 172
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 172
catccttcca cctgctgggg caccattctt agtatacaga ggtggcctta cacacatctt 60
gcatggatgg cagcattgtt ctgaaggggt ttgcagaaaa 100
<210> 173
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 173
tgatggccct ggaggcgggg ctgaggaaca gggaaatgcc gctgtgaagt cttaaagcac 60
ttctgcttaa actcccatgt gtgaggagtg tgcctccctg 100
<210> 174
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 174
tgacctcttg tcatctgtgg ctctgagtgg tactaatcat gaacatgacc agccggcaca 60
cttaacctta agggatgaca gtatacctgt aaatagaaat 100
<210> 175
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 175
gagagagcta aactgtgtaa tttaatggta tcttccttgc tggatgtggc agaatccaca 60
ccagcttatc aaccaacaca gctaatttta gaatagatcc 100
<210> 176
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 176
aaaaatggat aaaggcgagc accgtcagga gcgcagagat cggccctact agatgcagag 60
accccgcaga gctgcattga ctaccagatt tattttttaa 100
<210> 177
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 177
gattcctggt taggaactgc attaaagtcc ttacttctca tccagtccag aaagaattgt 60
gtgaatgttc tgatcactac cacccagctg gttccagccc 100
<210> 178
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 178
ttagaacaag tagaatggga aaggagtgac tgataaatct aagattcaaa atagtcccgt 60
cgaaacttaa aggccagatt attgctttgg agctttctat 100
<210> 179
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 179
actcttagac tcagagtcct tgggaggcag ccgcaaggcc actgacagag gggtggcccc 60
tgacagcaag acaactggca gctcataccc ttttcagctg 100
<210> 180
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 180
ccctgacttg tagccagctt gtgtaagatc ccttgcagaa cgagaaagtt aaaaacaagc 60
ccacccagta ctcacaccat caagtctgtt atagagtgta 100
<210> 181
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 181
agacccctga aatgttgcca aattcttcaa ataactgttt ggggggtggg gggagatgaa 60
agagagtcgc gttttgttta cagttaaaga catccaatat 100
<210> 182
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 182
ttctgagtat tttagtgttg ccacctggat ttgctgcatt gctctgctga gctgtattga 60
aaccatgact gggcccactg tcagacagaa attagaatag 100
<210> 183
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 183
caggctctag atcacatggc atcaggctgg ggcagaggca tagctattgt ctcgggcatc 60
cttcccaggg ttgggtctta cacaaataga aggctcttgc 100
<210> 184
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 184
agaaacaagc cctttaagtt tatgctaggc aagcaggagg tgatccgagg ctgggaagaa 60
ggggttgccc agatgagtgt gggtcagaga gccaaactga 100
<210> 185
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 185
cagacctgag ctggctttgg aatgaggtta aagtgtcagg gacgttgcct gagcccaaat 60
gtgtagtgtg gtctgggcag gcagaccttt aggttttgct 100
<210> 186
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 186
tgtgtgttgc actaattcta aactttggag gcattttgct gtgtgaggcc gatcgccact 60
gtaaaggtcc tagagttgcc tgtttgtctc tggagatgga 100
<210> 187
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 187
ttttttgccg taggcaccat tctgcatctt gaacccagac tgaagtgtgc ctctcacaga 60
tggaaggtgc acacgctcct gtctcctcct cactctgcca 100
<210> 188
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 188
cttgtcctcc cagctgagct ttcttattcc accctttctg gtgtctatag gaatgcatga 60
gagaccctgg acgtttttct gctctcttct ggccctccat 100
<210> 189
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 189
ggactcagag gccgccatca accgccagat caacctagag ctctgtgcct cctacgttta 60
cctgtccatg tcttactgct ttgaccgtga tgatgtggct 100
<210> 190
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 190
gtccagttga ttgtacgtag ccacaggagc cctgctatga aaggaataaa acctacacac 60
aaggttggag ctttgcaatt ctttttggaa aagagctggg 100
<210> 191
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 191
actcgcgctg gccggccggg ggaagggacc cgcacgccgg gctttgttgt ggaaatcccg 60
gttacctggc ttataaccca caccatggat aacttattgg 100
<210> 192
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 192
aaagcatagt tggtcttggt gtcatatgga tcagaggcac aagtgcagag gctgtggtca 60
tgcggaacac tctgttattt aagatggcta tccagataat 100
<210> 193
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 193
tacagcaggt gaacagtcta caaggtcttt tatcttggat aaaatcattg aagaggatga 60
tgcttatgac ttcagtacag attatgtgta acagaacaat 100
<210> 194
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 194
cctgtgtttg catcctctgt tcctattctg cccttgctct gtgtcatctc agtcatttga 60
cttagaaagt gcccttcaaa aggaccctgt tcactgctgc 100
<210> 195
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 195
ctcactgacc ggaaggtcca ggtgaatctc gtcataagtg atctcaggct ctcacaggat 60
ccggagggaa atgtgttaga gggtctggaa aattcagtgc 100
<210> 196
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 196
agtctgggag cagcagtctt cgtggctggt tcagggtgtt ttgttccgag cctgcctgcc 60
tgccggttct atacctcagg ggcattttta caaaaagccc 100
<210> 197
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 197
cagtgctcaa gtgacctctc acgacgcttc taccaatggg ctcatcaact tcatcaagca 60
gcagcgcgag gccagagtcc aataaactcg tgctcatctg 100
<210> 198
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 198
tatgattttt ctcactcttt ctttggactc cagggtgtca gccatcaggt ctcctaattt 60
tgtgtaccgg tctccaacaa ccccagctac tgaatactgc 100
<210> 199
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 199
agagctctac ttacagaaca gccctgaggc ctgtgactat gggctctgaa gggggcagga 60
gtcagcaata aagctatgtc tgatattttc cttcactaat 100
<210> 200
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 200
ggtatcccca ctcagtagcc aagtcacaat gtttggaaaa cagcctgttt acttgagcaa 60
gactgatacc acctgcgtgt cccttcctcc ccgagtcagg 100
<210> 201
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 201
gcctccgagg tggaagagac tcgtgcaatg gagattctgg aagccctttg ttgtgcgagg 60
gtgttttccg aggggtcact tcctttggcc ttgaaaataa 100
<210> 202
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 202
acactacaag aggtgaagat gacagtgcag gaagatcgaa agtgcgaatc tgacttacgc 60
cattattacg acagtaccat tgagttgtgc gtgggggacc 100
<210> 203
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 203
ggcccctcgt gtgtaaggac gtagcccaag gtattctctc ctatggaaac aaaaaaggga 60
cacctccagg agtctacatc aaggtctcac acttcctgcc 100
<210> 204
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 204
aaccaaatag aaataagcat gcaacatgaa cagctggaag agagttttca ggaactagtg 60
gaagattacc ggcgtgttat tgaacgactt gctcaagagt 100
<210> 205
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 205
tatatgaagt ggaggagccc aatgagtatt attgctatgt cagcagcagg cagcaaccct 60
cacaaccttt gggttgtcgc tttgcaatgc catagatcca 100
<210> 206
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 206
aagatgaaga gagagagatt tggaaggggc tctggctccc taacacctga atcccagatg 60
atgggaagta tgttttcaag tgtggggagg atatgaaaat 100
<210> 207
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 207
caatcgacat ggacaactac atgctctcga gaaacgtgga caacgccgag ggctccgaca 60
ctgactactg accgtgcggg tgctctcacc ctcccttctc 100
<210> 208
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 208
taagaatgat ttagactgac ctgtcctttt ttatctgcgc atgcgagaac atcaccttcc 60
tctgtacact tggaaatgcc tctggcttgt tgcagccctc 100
<210> 209
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 209
agtcagagga tgggtccggc aaaggtgcgg ccctggtcac cgctgttgcc tgccgccttg 60
cgcagttgac tcgtgtctga ggaaacctcc aggctgagga 100
<210> 210
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 210
ccctgagatg ggagccgtct tcccagtcca ccgtccccat cgtgggcatt gttgctggcc 60
tggctgtcct agcagttgtg gtcatcggag ctgtggtcgc 100
<210> 211
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 211
cccgtgagct ggaaggaaca gatttaatat ctaggggctg ggtatcccca catcactcat 60
ttggggggtc aagggacccg ggcaatatag tattctgctc 100
<210> 212
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 212
aagagctcag attgaaaagg agggagctac tctcaggctg caatgtgaaa cagctgccct 60
gtgtgggact gagtggcaag tccctttgtg acttcaagaa 100
<210> 213
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 213
tatgcatttt ttgtgcaaac ttgtcgggag gagcataaga agaagcaccc agatgcttca 60
gtcaacttct cagagttttc taagaagtgc tcagagaggt 100
<210> 214
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 214
tgctgcatat cgtgccaagg gcaaaagtga agcaggaaag aagggccctg gcaggccaac 60
aggctcaaag aagaagaacg aaccagaaga tgaggaggag 100
<210> 215
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 215
ccccatggaa atcactctcc tgttgactat ttccagagct ctaggtgttt aggcagcgtg 60
tggtgtctga gaggccatag cgccatcatg ggctgatttt 100
<210> 216
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 216
tccctacctt ggaagagggc ctgcagttgc catcacccac tgcaaccagc cagctcccgc 60
tcgaatctga tgctgtggaa tgcttaaatt accaacacta 100
<210> 217
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 217
gcaaggtaga gaagttgtgc cgctcaatca cagacacctg cacccacaac atacttctgt 60
tacacacaag aacatttcag gaaactcagc cagcttattt 100
<210> 218
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 218
aacaatagga agctatgtgt atcttctgtg taaagcagtg gcttcactgg aaaaatggtg 60
tggctagcat ttccctttga gtcatgatga cagatggtgt 100
<210> 219
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 219
gaggttccta taattgtctc tgagtaaccc tttggaatgg agagggtgtt ggtcagtcta 60
caaactgaac actgcagttc tgcgcttttt accagtgaaa 100
<210> 220
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 220
tccacccaga tttcttcagc cagaggtctc agactgaaaa ggacttctca gagaagcatt 60
cgaccctggt gaatgatgcc tataagaccc tcctggcccc 100
<210> 221
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 221
gcctactact actattctgc aaacgaggaa ttcagaccag agatgctcca aggaaagaaa 60
gtgattgtca caggggccag caaagggatc ggaagagaga 100
<210> 222
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 222
ggcattctct aaaaatctca agcttggaat ccacgaagac tccactaacc gccgccgcct 60
gtctgagctg ctgcgctatc atacctccca gtctggagat 100
<210> 223
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 223
gtggcactca agcccgccag ggggacccca gcaccggccc catcattgag gaggttgatt 60
gaatggccct tcgtgataag tcagctgtga ctgtcagggc 100
<210> 224
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 224
ccaccaactc accgtgtgtg tcccagctgc cccatcttcc ccagcgcata cctgttcctc 60
ttctcattct ctccccgccg cctgtttcct caccttctct 100
<210> 225
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 225
tgttccagga gcaccagttt gaggctctgg gcctgctgat tctgctccgg ctgtggcggg 60
tggcccggat catcaatggg attatcatct cagttaagac 100
<210> 226
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 226
ctattataag atgctctgaa aactcttcag acactgaggg gcaccagagg agcagactac 60
aagaatggca cacgctatgg aaaactcctg gacaatcagt 100
<210> 227
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 227
tggatggaca tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt 60
ccaattcctg tggactttca gcggaaaatc cgccagagct 100
<210> 228
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 228
actttacacc tacccctcac cggaaagcta gacccgcttc agggccagga gtggcgtttc 60
cgcacaggat ttcctaagac gagagggatt tagccaagag 100
<210> 229
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 229
gtcagtgttg ggggcctgct tggggaattc accttcttct tctctcccag ctgaacccga 60
ggctaaagaa gatgaggcaa gagaaaatgt accccaaggt 100
<210> 230
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 230
tgagatgatc cagcagacct tcaatctctt cagcacagag gactcatctg ctgcttggga 60
acagagcctc ctagaaaaat tttccactga actttaccag 100
<210> 231
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 231
ctaatcagct ctcagtgatc aacccactct tgttatgggt ggtctctgtc actttgaatg 60
ccaggctggc ttctcgtcta gcagtattca gatacccctt 100
<210> 232
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 232
aaataccaca agatcatttt gtgacctcac agatgagtgg agaagcacac acgaggccta 60
tgtcaccgtc ctagaaggat tcagcgggaa cacaacgttg 100
<210> 233
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 233
cccgggcagc catctgactc caatagagag agagagttct tcacctttaa gtagtaacca 60
gtctgaacct ggcagcatcg ctttaaactc gtatcactcc 100
<210> 234
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 234
atcggaatcc cgacacctgt cctcatctgg aacaaggtaa aaaggggtca ctatggagtt 60
caaaggacag aactcctgcc tggtgaccgg gacaacctgg 100
<210> 235
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 235
ggcatctcca acatcatcat ccaacgaaga ctcagctgca aatggttctg ctgaaacatc 60
tgccttggac acagggttct cgctcaacct ttcagagctg 100
<210> 236
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 236
gggaccaaag gcggccagga tataactgac ttcaccatgc aatttgtgtc ttcctaaaga 60
gagctgtacc cagagagtcc tgtgctgaat gtggactcaa 100
<210> 237
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 237
tgcttctgcc acgtgctgct gggtctcagt cctccacttc ccgtgtcctc tggaagttgt 60
caggagcaat gttgcgcttg tacgtgttgg taatgggagt 100
<210> 238
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 238
gacactcgct gcctgggtgc gactgcacag cagttccaca ggcacaagca gctgatccga 60
ttcctgaaac ggctcgacag gaacctctgg ggcctggcgg 100
<210> 239
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 239
aataacccag cttgcgtcct gcacacttgt ggcttccgtg cacacattaa caactcatgg 60
ttctagctcc cagtcgccaa gcgttgccaa ggcgttgaga 100
<210> 240
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 240
cccacgtgtc agaacagcag ctataaaagc catgttgcag ctccatgaaa gaggactgaa 60
attacaccaa acaatttata atcaggcctg taaattactc 100
<210> 241
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 241
gtgttggccg aggtcctcac gggcatccct gcaatggata acaaccgaag cccggtttac 60
ctgaaggact tactcctcag tgatattcca agcagcaccg 100
<210> 242
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 242
ctgtgcgagt gtaccggatg cttccacctc tcaccaagaa ccagagaaaa gaaagaaagt 60
cgaagtccag ccgagatgct aagagcaagg ccaagaggaa 100
<210> 243
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 243
gggcactgtt taaaggaaag ttccgagaag gcatcgacaa gccggaccct cccacctgga 60
agacgcgcct gcggtgcgct ttgaacaaga gcaatgactt 100
<210> 244
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 244
atggatggga ctcttatgtc ataacttctg ttactccttt ggcccatagc taaggtcatc 60
cttccccaca ggggtggctt tgggattgga tgatacagct 100
<210> 245
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 245
gaggtgacaa agagccaaca gagacaatag gagacttgtc aatttgtctt gatgggctac 60
agttagagtc tgaagttgtt accaatggtg aaactacatg 100
<210> 246
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 246
gtctggtctt acccatgttc ctagcaaccc tgagatgatt ttcttccatt taccaaagca 60
gccgggtcag tgctttctca cgttgccgta ttcttcaggt 100
<210> 247
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 247
ctgaatgcag agaaccacag aactaagatc actgtcgtct tcctgaaaga tgagaagtac 60
cattctttgc ctatcatcat taaaggcagc gttggtggac 100
<210> 248
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 248
gtgagggctt gtcattacca gacggttcac cagcctctct tggtttcctt ccttggaaga 60
gaatgtctga tctaaatgtg gagaaactgt agtctcagga 100
<210> 249
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 249
gagaacacca agctctggta tgctccaaat cgcaccatca ccgttgatga caagatgtcc 60
ctccggctcc actaccggat gaggttctat ttcaccaatt 100
<210> 250
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 250
ccttcacatc cagatccctg tcggtgttag ttccactctt ggtctttcac gctccccttg 60
cctgtggaac attgtctggt cctagctgtg gttcccattg 100
<210> 251
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 251
cccagactgt agccatgcag ggtcctgcac ggactttaac gatgcaaaga ggcatgaaca 60
tgagtgtgaa cctgatgcca gcgccagcct acaatgtcaa 100
<210> 252
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 252
acaagtaaaa taacttgaca tgagcacctt tagatccctt cccctccatg ggctttgggc 60
cacagaatga acctttgagg cctgtaaagt ggattgtaat 100
<210> 253
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 253
cgacatcagt ttcatcgagg aaagctgaaa ataaatatgc aggagggaac cccgtttgcg 60
tgcgcccaac tcccaagtgg caaaaaggaa ttggagaatt 100
<210> 254
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 254
atcgtgccca gtgttaacct cggctggcct tcactaaggg gactagacct ccctctcccc 60
aggagcccca gccccagagt ggtttgcaat aatcaagata 100
<210> 255
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 255
gaggtgacat atgcacagtt ggatcactgc gttttcacac agacaaaaat cacttcccct 60
tctcagaggc ccaagacacc tccaacagat accaccatgt 100
<210> 256
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 256
tccgaaaccg gtaaccccag acacctacat gttctgattg ggacctcagt ggtcaaaatc 60
cctttcacca tcctcctctt ctttctcctt catcgctggt 100
<210> 257
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 257
ccggcagcac catgtcgctc atggtcatca gcatggcatg tgttgggttc ttctggctgc 60
agggggcctg gccacatgag ggattccgca gaaaaccttc 100
<210> 258
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 258
cagcaactcc gagagaaatg cttgttattt tctcacactg tcaacccttg gaataacagt 60
ctagctgatt gttccaccaa agaatccagc ctgctgctta 100
<210> 259
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 259
acctatcact gcaaagattt accatcagct ccagagaagc tcattgttgg gatcctggga 60
attatctgtc ttatcttaat ggcctctgtg gtaacgatag 100
<210> 260
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 260
tatgtgagtc agcttatagg aagtaccaag aacagtcaaa cccatggaga cagaaagtag 60
aatagtggtt gccaatgtct cagggaggtt gaaataggag 100
<210> 261
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 261
caattttact ggattggact ctcttacagt gaggagcaca ccgcctggtt gtgggagaat 60
ggctctgcac tctcccagta tctatttcca tcatttgaaa 100
<210> 262
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 262
tatacagaaa aacctaagac aattaaacta cgtatggatt gggcttaact ttacctcctt 60
gaaaatgaca tggacttggg tggatggttc tccaatagat 100
<210> 263
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 263
aagtgcaatt aaatgccaaa atctcttctc ccttctccct ccatcatcga cactggtcta 60
gcctcagagt aacccctgtt aacaaactaa aatgtacact 100
<210> 264
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 264
ctgctgccag gcggcctgtg agcccagccc ctgccagtca ggctgcacca gctcctgcac 60
gccctcgtgc tgccagcagt ctagctgcca gccagcttgc 100
<210> 265
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 265
ttgcctgctg gtgttcctac aagtatttaa atgcaggagc aggaggaatt gctggtgcct 60
tcattcatga aaagcatgcc catacgatta aacctgcgag 100
<210> 266
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 266
ccaaccccgg cccctggtca ggcccctgca gctgcctcac accgcccctt gtgctcgcct 60
cataggtgtc tatttggact ctaagctcta cgggtgacag 100
<210> 267
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 267
atcttgtgta gtcttcaact ggttagtgtg aaatagttct gccacctctg acgcaccact 60
gccaatgctg tacgtactgc atttgcccct tgagccaggt 100
<210> 268
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 268
aacacatagt ggcttctccg cccttgtaag gtgttcagta gagctaaata aatgtaatag 60
ccaaacccac tctgttggta gcaattggca gccctatttc 100
<210> 269
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 269
aaaggaccca tcacttcttc tgaagaacct acactccagg ccaaatcaca aatgacggcc 60
cagaacagca aggctagttc aaaaggagca taaaggacta 100
<210> 270
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 270
gggatggaag gctgtcttct tttgaggatg atcagagaac ttgggcatag gaacaatctg 60
gcagaagttt ccagaaggag gtcacttggc attcaggctc 100
<210> 271
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 271
ttgaatgctg gagccttgga agcgaatctg atggtcctag gaggttcggg aagaccatct 60
gaggcctatg ccatctggac tgtctgctgg caatttcttt 100
<210> 272
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 272
caccctctca gccctgccca gtcctgtggt gacctcagga gagaacgtga ccctccagtg 60
tggctcacgg ctgagattcg acaggttcat tctgactgag 100
<210> 273
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 273
gcggcagcca atcagcgcgc ggcttctata gggcttgagt tattagacgc tgatctcaaa 60
acatccttca tcagacacga aggagaggcc aacagatgag 100
<210> 274
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 274
agggtcatgc agctactgag gtcacagcct ggattcatac acaggtctga ctcctgagca 60
cttagccagg tggctgtaac agtgttccca gaaacacagg 100
<210> 275
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 275
acctgtcttc cgggtctgtt cacccgtccc ctggactggc accagcacag agggtcgagt 60
gttggcacct gtcttctggg tctccatccc tccctttgtt 100
<210> 276
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 276
gagaatgtct gcgcggagac agcatagctc tgtagaaatg agtggcagcg tatgtaacct 60
ggcattttga acccaggagc acaattttat taaaggaaaa 100
<210> 277
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 277
gagtagtagg tggacagccg tcccacacaa gggtttgtat ctgggctaca cagattccct 60
tcagaaaagc accaatgtaa gcaactccct tacagttgct 100
<210> 278
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 278
gagatagctt cctgaaatgt gtgaaggaaa atgatcagaa aaagaaagaa gccaaagaga 60
aaggtacctg ggttcaacta aagtgccagc ctgctccacc 100
<210> 279
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 279
gctctgtcct ttgccgctca gaccaaaaac cttagagctg tctttgactt ctgtctttcc 60
cttccaccca cagttaacca ggaaatcctg ccatctccgc 100
<210> 280
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 280
ggttacagcc attttgtgtg attcacttcg ggggttaagt aatgcaggat tctgcaaaca 60
aggtgtcgcc gtccaaatgt actgtcctgg catagagagc 100
<210> 281
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 281
acatggcgcc acggccactt cctgctgccc tggaccccgc aagcccaggg acatccaaga 60
gcacccctcc tgagacccca gactcagaag cagcgagaag 100
<210> 282
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 282
cccctggtgg accgcgacct ccgcaagacg ctaatggtgc gcgacaacct ggccttcggc 60
ggcccggagg tctgagccga cttgcaaagg ggataggcgg 100
<210> 283
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 283
gcaaagcact atcacaagga atataggcaa atgtacagaa ctgaaattcg agtggcgagg 60
atggcaagaa aagctggcaa cttctatgta cctgcagaac 100
<210> 284
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 284
aagattatgt cttcccctgt ttccaaagag ctgagacaga agtacaatgt gcaatccatg 60
cccatccgaa aggatgatga agttcaggtt gtacgagggc 100
<210> 285
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 285
atgggaccca ctctactgag gctttatgta gaactcatag aggaagctgg ctttgaggaa 60
tgaactaccc tgtgcttttc ttaggactaa aatctcagga 100
<210> 286
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 286
gacggtaacc gggacccagt gtctgctcct gtcaccttcg cctcctaatc cctagccact 60
atgcgagatg actccttcaa caccttcagt gagacgggtg 100
<210> 287
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 287
gagttttcca aaccctggat ttccttcgga gagagctaga ttctattcca ttcttggaat 60
tcagctcctt gcccttctct gtgaccccgg atcgcgaatg 100
<210> 288
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 288
tgttgcaaaa gccaactacc actgtcaaac ttagcccgtt tacaacatgg ggaaaggcgt 60
atttcttact aatatctcaa caacgataac aatgctgtat 100
<210> 289
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 289
cgggtgcagc gggaaaaggc taatggcaca actgtccacg taggcattca ccccagcaag 60
gtggttatca ctaggctaaa actggacaaa gactgtgaaa 100
<210> 290
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 290
ggtgaagaat ttgttctatt atgaagatac tgtctgggct aaaaagctta cagtgagtgg 60
aagatagcaa cttgtagggt tggtggctga acaggccgac 100
<210> 291
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 291
ctggctcaag gatggcacgg tgttatgtga gctcaataat gcactgtacc ccaaggggca 60
ggtcccagta aagaagatcc aggcctccac catggccttc 100
<210> 292
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 292
caggcgctgc aagttctccc aggagaaagc catgttcagt tcgagcgcca agatcgtgaa 60
gcccaatggc gagaagccgg acgagttcga gtccggccat 100
<210> 293
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 293
gaagcactgg taaatgtctg ctgcattaac tcactcagac caaactttct cttatctagg 60
tccaaaagga agctgctcgg ctggaaggaa cctggtgagg 100
<210> 294
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 294
aggtgctgca aaattaccag gaatacagtc tggccaacag catctactac tctctgaagg 60
agtccaccac tagtgagcag agtgccagga tgacagccat 100
<210> 295
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 295
tggagagaag aatgaagagg tggtggttct gggtttgatt tgagttcacc tgtgggcagt 60
gggcagtgtc ttggtgaaag ggagcggata ctactttttg 100
<210> 296
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 296
gcccttctgc catcaacgag gtggtgaccc aagaacatac catcaacatt cacaagcgca 60
tccatggaga gggcttcaag aagcgtgctc ctcgggcact 100
<210> 297
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 297
gtagttgtcc actgctttcc tggatggatg ggactcttat gtcataactt ctatactcct 60
ttggcccata gctaaggtca tccttcccca caggggtggc 100
<210> 298
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 298
ccaaaccaaa agaggcaagc aagtctgcgc tgaccccagt gagtcctggg tccaggagta 60
cgtgtatgac ctggaactga actgagctgc tcagagacag 100
<210> 299
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 299
ccctgggtgc cccttaaccc gggcggtagc tcgttaagat ggcgaagtgt ccggtccgga 60
acacgcgaaa ccccaaatcc cgcctgcccg acctcctgac 100
<210> 300
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 300
gcgcggttgc ggttagcggg cgcggtgcca aagctgccat ccccagctca cagctcctca 60
tatccaccct gccctcatct ttatgaattg cgtgtagacc 100
<210> 301
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 301
gcccttcaga gctgcgggag atcattgatg agtgccgggc ccatgatccc tctgtgcggc 60
cctctgtgga tgagcagaag cgcagactta atgatgtgtt 100
<210> 302
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 302
atgttgcatt gactagagga aagaggcatt tgttgattgt gggaaattta gcctgtttga 60
ggaaaaatca actttgggga cgagtgatcc aacactgcga 100
<210> 303
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 303
agattgtttg cactggcgtg tggttaactg tgatcggagg aagtgcaccc gccgtttttg 60
ttcagtctac ccactctcag ggtaacaatg cctcagaagc 100
<210> 304
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 304
ccccacacac ctctcgaggc acctcccaga caccaaatgc ctcatcccca ggcaacccca 60
ctgctctggc caatgggact gtgcaagcac ccaagcagaa 100
<210> 305
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 305
agaaaaaact taaaaatggg atgtcctaaa atgaaagctg ctcaaagtca cagaacaacc 60
gagggacaaa ggagattgga tgactgggaa gcgctggccc 100
<210> 306
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 306
ttccaatacc cagcttgctt ccatggccaa tctaagggca gagaagaata aagtggagaa 60
accatctcct tctaccacaa atccacatat gaaccaatcc 100
<210> 307
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 307
gggtcagtga cggacactta cctgacagcg gatccacaat attctcgtgc agtgtgtttg 60
gaatcctggt ctgggctctc gtcgttggcc ttgtagatca 100
<210> 308
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 308
aagggagaga ctgtgaatac aacaatatca ttctccttca agggaataaa attttctaag 60
ggaaaataca aatgtgttgt tgaagctatt tctgggagcc 100
<210> 309
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 309
tcctgaagag cgatgaaggt ggcaaagtgc tgcttccaaa gctcattgac ttttctgctc 60
agattgcaga gggaatggca tacatcgagc ggaagaacta 100
<210> 310
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 310
aggggccaag cacctcttgt atcctggagt ccttgttccg agcagtaatc actaagaagg 60
tggctgattt ggttggtttt ctgctcctca aatatcgagc 100
<210> 311
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 311
actgtgcccc tgaggagaaa atctgggagg agctgagtgt gttagaggtg tttgagggga 60
gggaagacag tatcttgggg gatcccaaga agctgctcac 100
<210> 312
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 312
gccatattat actgctgccc acgcaatgag ttggtgttta cagtgttccc aaggagtggc 60
ttatcttcac agcatgcaac ccaaagcgct aattcacagg 100
<210> 313
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 313
gtcaaaaagg gatatcaaat gaagtgatgg ggtcacaatg gggaaattga agtggtgcat 60
aacattgcca aaatagtgtg ccactagaaa tggtgtaaag 100
<210> 314
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 314
tccaagtagg ttttgtttac cctactcccc aaatccctga gccagaagtg gggtgcttat 60
actcccaaac cttgagtgtc cagccttccc ctgttgtttt 100
<210> 315
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 315
tggctgcagg cctgactact gcccacacca acgaggtgat ctagcagata catggcaacg 60
tgtgaactgc aacaacgcct ggtgccccag caccaacctt 100
<210> 316
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 316
catactagag tatactgcgg cgtgttttct gtctacccat gtcatggtgg gggagattta 60
tctccgtaca tgtgggtgtc gccatgtgtg ccctgtcact 100
<210> 317
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 317
tctgaagccc agctgcctgc ccgtgtatac ggccacctcg gatacccagg acagcatgtc 60
cctgctcttc cgcctgctca ccaagctctg gatctgctgt 100
<210> 318
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 318
cccagcccct agaaacccaa gctcctcctc ggaaccgctc acctagagcc agaccaacgt 60
tactcagggc tcctcccagc ttgtaggagc tgaggtttca 100
<210> 319
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 319
gaagagatcg tgtctgatcc catctacatc gaagtacaag gacttcctca ctttactaag 60
cagcctgaga gcatgaatgt caccagaaac acagccttca 100
<210> 320
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 320
aagggctgcg ttacacaaaa taaacaatgg cattgtcata ggccttcctt ttactagtag 60
ggcataatgc tagggaatat gtgaagatgt ttttatgaag 100
<210> 321
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 321
agctggcatt tcgccagctt gtacgtagct tgccactcag tgaaaataat aacattatta 60
tgagaaagtg gacttaaccg aaatggaacc aactgacatt 100
<210> 322
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 322
cattcagcca agcctcctcc tctagcagca atttccagct gtgtaacact atcctgggca 60
aatgttttac cctgtcctcc agcctccctg cttcccttct 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 323
tcaaactggt agctatgctt tgatgtcctg ttgaggccat cggacagaga ctggagccca 60
ggtgacagga gatggtgata ccagaagtca agggttgggg 100
<210> 324
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 324
attcaaatgt ggctgtgatt tctgcatata tcatagatgg gatccttctg agaatactgg 60
aatagggaat taggacacca agccaattca gctgtgaacc 100
<210> 325
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 325
ttctcaccat tctgggactt ggtagtgctg tgtcactcac aatctgtgga gctggggaag 60
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<210> 326
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 326
ctgggaagtt aaatgactgg cctggcatta tgctatgagt ttgtgccttt gctgaggaca 60
ctagaacctg gcttgcctcc cttataagca gaaacaattt 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 327
ctgcggtgga aacaggctta ctctgacttc cctgggagtg tacttttcct gcctcacagt 60
tacattggta attctggcat gtcctcaaaa atgactcatg 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 328
tcctcctcat ctaatgctca tctgtttaat ggtgatgcct cgcgtacagg atctggttac 60
ctgtgcagtt gtgaataccc agaggttggg cagatcagtg 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 329
tctttttcct ggccatgagg acaaaaatta ctgagtggcc cttaaagagg gaagtttgtt 60
ttcagctgtt ctcttttgcc cgtaggtggg agggtgggga 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 330
tgaatgtgta gtgcacacgc acgggtgttt ctgtgtgcta gttgcttctt gctgctgctt 60
cctgcttgtc tgggactcac atacataacg tgatatatat 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 331
tgtccctgaa agggccagca catcactggt tttctaggag ggactcttaa gttttctacc 60
tgggctgacg ttgccttgtc cggaggggct tgcagggtgg 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 332
tctctgggta gcagggtggt gtgatagcgg cagcgagggg ctcggagagg tgctcggatt 60
ctcgtagctg tgccgggact taaccaccac catgtcgagc 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 333
ttgggcattt tggaagctgg tcagctagca ggttttctgg gatgtcggga gacctagatg 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 334
aaacatacca ctctcatggt tcatagtatt cactgtatgt atgctaggga aaagacttgc 60
tccagtctcc tcctcagttc tgtgcctgag aaccactgct 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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tccggggcta gtgatcgtga tcccttttat ttgcaactgt aatgagaatt tttcacacta 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggccaggca catcgggcac ctcctcccca tggactatag cgccaatgcc attgccttct 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 337
acccaagcat caaagtctac tcagctaaag actaacagag gacagagaaa agtgacagtt 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 338
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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cgatgttttg gctcctataa caaccatgcc tggtctttcc ccagtgagcc agtgaagctc 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 342
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 343
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 347
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 348
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 350
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gcgccgtgat ggccgcaaac tggtgccttg ggtagacact attaaagagt cagacattat 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 352
agtggggttc agataatgca cgtgtttcga atcccactgt gatatgccag gaagacagca 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 353
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 354
ccccagtggc atctcctcat cacgttctgt gccgtccttg ggaaaggcct gcattctgat 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 355
cataagattg atttatcatt gatgcctact gaaataaaaa gaggaaaggc tggaagctgc 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 356
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cctgcacggt gaatggcttt gtatagaacc tctttgtcta 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 357
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 358
ttctcttcct tcaccatctg cactacattt ctggctgatc ccaatcagat tcccgctaat 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 359
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 363
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 369
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 371
atcaaggttt agaacaccat gagatagtta cccctgatct ccagtcccta gctgggggct 60
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 375
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 376
tttttggggg atgggctagg ggaaataagg cttgctgttt gttctcctgg ggcgctccct 60
ccaacttttg cagattcttg caacctcctc ctgagccggg 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 377
ctgatatgaa tgaatgctgt ctgtgtggaa caagcgtcgc aatgaggact ctctacagga 60
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<213> Homo sapiens
<400> 378
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<213> Homo sapiens
<400> 379
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 380
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<210> 381
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 381
acagcaccct cacggaacca gtggtgatgg cacttctcaa atactggcca aagactcaca 60
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<210> 382
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 383
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<213> Homo sapiens
<400> 384
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<210> 385
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 385
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<210> 386
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 386
cccgttgagc tggccatcta gtgcagtgtg ctctcagatt ccatgtttgt tgattgtgtg 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 387
agaacagtga gtacctagaa ctgtgccact aattaaagga aatcctaaga aggtgcattt 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 388
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 389
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 390
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 391
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 393
gatgctcacc ttgttgctct agcagagaga gactaaacat tgtcgttagt ttaccagatc 60
cgtgatgcca cttacctgtg tgtttggtaa caacaaacca 100
<210> 394
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 394
gcggctggtg aaagatgtct tcatttctgc ggctgagaga gatgtgtaca ctggggacgc 60
actccggatc tgcatagtga ccaaagaggg catcagggag 100
<210> 395
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 395
gttacattgg tgcagcccta gttttagggg gagtagatgt tactggacct cacctctaca 60
gcatctatcc tcatggatca actgataagt tgccttatgt 100
<210> 396
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 396
actcacagag acagctattc tggaggcgtt gtcaatatgt accacatgaa ggaagatggt 60
tgggtgaaag tagaaagtac agatgtcagt gacctgctgc 100
<210> 397
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 397
catcctgtgt cttttggagt acgatgtgta agtgcccatt gggtggcctg ttggtcactg 60
tgcagcagtc tgcttcccaa taaagcgtgc tctttcacaa 100
<210> 398
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 398
gagctctctg cctccggtca ctcttgctgt ggtgctacgt ggaagtgaat ggagactgat 60
ctcaaatctg aactgcagct ttcgctgctg tgagttgggg 100
<210> 399
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 399
tcccgagtga tacccatgaa ctgccagtag aggctgctat cgttccatgt gtaaggaatg 60
aactggttca aggcgcgtcc tacccagtca ttttctttac 100
<210> 400
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 400
tatgatgact gaaagggaaa agtggaggaa acgcagctgc aactgaagcg gagactctaa 60
acccagcttg caggtaagag ctttcacctt tggtaaaaga 100
<210> 401
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 401
gccaatgctt actgcgctag acgcttcatc ccacaatctt aaggggcagc ttctattagc 60
cagtctttac agctgagcac attctggctc agggaggtta 100
<210> 402
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 402
aaatgttcta gtgtagagtc tgagacgggc aagtggttgc tccaggatta ctccctcctc 60
caaaaaagga atcaaatcca cgagtggaaa agcctttgta 100
<210> 403
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 403
ttagattaga gtcatagcct taatagccct agttgtcatc ctgggagaca ggcaacagta 60
gagatatttg agagcctaaa gagaggtttg gcctgtgggt 100
<210> 404
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 404
agggctttgc cccttttctg taagtctctt gggatcctgt gtagaagctg ttctcattaa 60
acaccaaaca gttaagtcca ttctctggta ctagctacaa 100
<210> 405
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 405
cagtctacat ttgtactctt tgtgatgcca cccgtctgga agcctctcaa aatcttgtct 60
tccactctat aaccagaagc catgctgaga acctggaacg 100
<210> 406
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 406
tcgtcctgca tgtctctaac attaatagaa ggcatggctc ctgctgcaac cgctgtgaat 60
gctgctgaga acctccctct atggggatgg ctattttatt 100
<210> 407
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 407
tggtatgtat ccaagtccct gctgaccact aatgttctag ctgatggtga gcggcacagt 60
cccacttccc catctcccca agtaggtggt gttagaaaac 100
<210> 408
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 408
taggagttga atccttctcc ctgcctacct gcagcatctc ctttcccttt aaaatgacca 60
tgtagtggca agcagccttt tactcttctg ttagctctgg 100
<210> 409
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 409
gatattgtgg ttgataactg tgccatctgc aggaaccaca ttatggatct ttgcatagaa 60
tgtcaagcta accaggcgtc cgctacttca gaagagtgta 100
<210> 410
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 410
gatggcttct atgaggctga gctctgcccg gaccgctgca tccacagttt ccagaacctg 60
ggaatccagt gtgtgaagaa gcgggacctg gagcaggcta 100
<210> 411
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 411
tgtgtccagg ctcttgtctg aacaccgcag cccctccttc gctccttcca gagctcagca 60
tgtcacggca aggactgccg cattggtgat ggagggccag 100
<210> 412
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 412
caccaaccag tactctttta accatgcatc ctgcttctgt ccaggaccag acaacagtac 60
gaactgtagc atcagctaca actgccattg aaattcgtag 100
<210> 413
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 413
aaccctcgac ccgaaaccct caccagataa actacagttt gtttaggagg ccctgacctt 60
catggtgtct ttgaagccca accactcggt ttccttcgga 100
<210> 414
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 414
gcattcttgt tagctttgct tttctcccca tatcccaagg cgaagcgctg agattcttcc 60
atctaaaaaa ccctcgaccc gaaaccctca ccagataaac 100
<210> 415
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 415
ttttcttttc cctcctttat gacctttggg acattgggaa tacccagcca actctccacc 60
atcaatgtaa ctccatggac attgctgctc ttggtggtgt 100
<210> 416
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 416
ataaaaatca ctattttgtg tgctccgcgt gctatagctt ttggggcggc cctgcccagt 60
ccccgtgccc acggggctcc ctctcccggt ggtgaaagtg 100
<210> 417
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 417
gggaggaggg aggatgcgct gtggggttgt ttttgccata agcgaacttt gtgcctgtcc 60
tagaagtgaa aattgttcag tccaagaaac tgatgttatt 100
<210> 418
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 418
ctttccacac agttgttgct gcctattgtg gtgccgcctc aggttagggg ctctcagcca 60
tctctaacct ctgccctcgc tgctcttgga attgcgcccc 100
<210> 419
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 419
ttgacagact caagagaaac tacccaggta ttacacaagc caaaatggga gcaaggcctt 60
ctctccagac tatcgtaacc tggtgcctta ccaagttgtg 100
<210> 420
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 420
tgacctgtcc tagtaacaaa actcgcaaaa attgtcacca cagtggaagc caggtgcctt 60
taatccactg taacctcaca actccaagtc cacagaatat 100
<210> 421
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 421
aattcagatc atctcagaag tctggaggga aatctggcga aaccttcgtt tgagggactg 60
atgtgagtgt atgtccacct cactggtggc accgagaaac 100
<210> 422
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 422
ccccagagcc caaggtgcac cgagcccaag tgcccatatg aacctctctg ccctagccga 60
gggacaaact gtcttgaagc cagaaggtgg agaagccaga 100
<210> 423
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 423
acctgtaagc tatgtctaat gtgccagaaa ctcgtccagc ccagtgagct gcatccaatg 60
gcgtgtaccc atgtattgca caaggagtgt atcaaattct 100
<210> 424
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 424
cttctgtcct ctttggatga gatcagtgtc cacaagtggc cgacatggaa catgctgagc 60
agtggctcct ctgaatgttc actttattag tcatgtatat 100
<210> 425
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 425
ctcaggatcg gaatgcgggg tcgagagctg atgggcggca ttgggaaaac catgatgcag 60
agtggcggca cctttggcac attcatggcc attgggatgg 100
<210> 426
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 426
cactcagggt ctgaggcagc tagtagccgg agggtcacca tgaagttcaa tcccttcgtt 60
acctcggacc gcagtaaaaa ccgcaaacgt cacttcaatg 100
<210> 427
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 427
agaagaaagc attcatggga ccactgaaga aagaccgaat tgcaaaggaa gaaggagctt 60
aatgccagga acagattttg cagttggtgg ggtctcaata 100
<210> 428
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 428
cttgcaactg cggctttcct tctcccacaa tccttcgcgc tcttcctttc caacttggac 60
gctgcagaat ggctcccgca aagaagggtg gcgagaagaa 100
<210> 429
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 429
acctcacctc agcttgagag agccagttgt gtgcatctct ttccagtttt gcatccagtg 60
acgtctgctt ggcatcttga gattgttatg gtgagagtat 100
<210> 430
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 430
gcgggttcgg gtcggtgaca cgcagacctg agggagctgg gcccgccttt tccgcccgcg 60
ccccaggccc ttgcagatcg agatttgcgt cctagagtgg 100
<210> 431
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 431
ccccttgggt ccctcacaca gagacaccat cagccggagt ggtataatct tacggagtcc 60
ccggccagac tttcggccta gggaaccttt tctcagcaga 100
<210> 432
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 432
atgaagaaag tcagggggac tgcaaaggcc aatgttggtg ctggcaaaaa gccgaaggag 60
taaaggtgct gcaatgatgt tagctgtggc cactgtggat 100
<210> 433
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 433
taaaatgtcc aggttgctac aagatcacca cggttttcag ccatgctcag acagtggttc 60
tttgtgtagg ttgttcaaca gtgttgtgcc agcctacagg 100
<210> 434
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 434
gaatggaagg gttatgtggt ccgaatcagt ggtgggaacg acaaacaagg tttccccatg 60
aagcagggtg tcttgaccca tggccgtgtc cgcctgctac 100
<210> 435
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 435
tggagtgaca ctacactcta gaatttccac tttggagaat actcagttcc aacttgtgat 60
tcctgataga acagacttta cttttctagc ccagcattga 100
<210> 436
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 436
tggaggatga tgaagatgat ccagactata atcctgctga cccagagagt gactcagctg 60
actaatggac tgtccccatc tgcagagagg cttgactgcc 100
<210> 437
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 437
agtaattttt aaagccttgc tctgttgtgt cctgttgccg gctctggcct tcctgtgact 60
gactgtgaag tggcttctcc gtacgattgt ctctgaaaca 100
<210> 438
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 438
caagatgaac aggtcgactt tcaagaattc atatccctgg tagccattgc gctgaaggct 60
gcccattacc acacccacaa agagtaggta gctctctgaa 100
<210> 439
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 439
gttaacttcc aggagttcct cattctggtg ataaagatgg gcgtggcagc ccacaaaaaa 60
agccatgaag aaagccacaa agagtagctg agttactggg 100
<210> 440
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 440
acctgagccc ctatccttga gctcagacat ctccttaaat aagtcacagt tagatgactg 60
cccaagggac tctggttgct atatctcatc aggaaattca 100
<210> 441
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 441
gatctccacc gaataaacga actgatacag ggaaatatgc agaggtgtaa acttgtgatg 60
gatcaaatca gtgaagccag agactccatg cttaaggttt 100
<210> 442
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 442
cggttcttct gcctgacctt caaatgccca tgttggcctt ttacagcagt gccacggcac 60
caagcgagct gccacatctc acactctaaa gggtttgaac 100
<210> 443
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 443
aactggaacc acagaggata cagaggcaaa gaagaggaaa agagcagagc gctttgggat 60
tgcctgatga aaagttcctg atactttctg ttctccagtg 100
<210> 444
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 444
agttcttctc atgtaagtaa taacatgagt acaccagttt tgcctgctcc gacagcagcc 60
ccaggaaata cgggaatggt tcagggacca agttctggta 100
<210> 445
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 445
gagagaagga agaagcccga ggaaaggaaa agcctgaggt gacagacagg gcaggtggta 60
acaaaaccgt tgaacctccc attagccaag tgggaaatgt 100
<210> 446
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 446
tgattatttt gaaggggcca cttctcaacg aaaaggtgat aatgtgcctc aggttaatgg 60
tgaaaataca gagagacatg ctcagccacc acctatacca 100
<210> 447
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 447
gtcactctgg aatatagacc cgtgatcgac aaaactttga acgaggctga ctgtgccacc 60
gtcccgccag ccattcgctc ctactgatga gacaagatgt 100
<210> 448
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 448
aggcagaggc agctggagcg ccgttctctc ctgctgggac accgcttggg ctttggtatt 60
gactgagtgg ctgacagtta tcttccaacc ccaactggct 100
<210> 449
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 449
ggcagacacc aacatggatc tcatggggga ttggatattg taattataga gcaggaagat 60
gacagtgatc gtcatttggc acaacatctt aacaacgacc 100
<210> 450
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 450
agacagttat gatctcaagt caaccctgag cagtatgggg atgagtgatg ccttcagcca 60
aagcaaagct gatttctcag gaatgtcttc agcaagaaac 100
<210> 451
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 451
tggttagaag ccatcagagg tgcaagggct tagaaaagac cctggccaga cctgactcca 60
ctcttaaacc tgggtcttct ccttggcggt gctgtcagcg 100
<210> 452
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 452
aaggatcgaa gttgctgaaa ggcttcacct ggacagtaac cccttgaagt ggagtgtggc 60
agacgttgtg cggttcatca gatccactga ctgtgctcca 100
<210> 453
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 453
ggttatgtaa gcaaagctga actgtaaatc ttcaggaata tgtattaaga ttgtggaatg 60
ggtgtaagac aattggtagg gggtgaaagt gggtttgatt 100
<210> 454
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 454
acgagcgtta gagtgccgcc ttagacggag gcaggagttt cgttagaaag cggacgctgt 60
tctaaaaaag gtctcctgca gatctgtctg ggctgtgatg 100
<210> 455
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 455
gaagcagagg aggatgggtc tgaacgactt tattcagaag attgccaata actcctatgc 60
atgcaaacac cctgaagttc agtccatctt gaagatctcc 100
<210> 456
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 456
ggatatgctg tgtgaaccgt cgtgtgagtg tggtatgcct gatcacagat ggattttgtt 60
ataagcatca atgtgacact tgcaggacac tacaacgtgg 100
<210> 457
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 457
agcaccccaa ggacactgtg atcaacccga gaatgttctg ggttcaactc aagcatctcc 60
cttgcacctc cagggtcctg cgtggactct gggttccatc 100
<210> 458
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 458
tcgctcataa agaagttttt gggatgggag agaatccaga ccatcttggg gcagccaggc 60
ccttgccttc atttttacag aggtagcaca actgattcca 100
<210> 459
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 459
tttattcctg acgattccct tgctgcctac ccttttctct cctctggttc tcaacctcaa 60
cgagttcaaa tcagttgtcc tttttagctc ccgtggaact 100
<210> 460
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 460
aacaaatatt gattgagggc gctgcatgtg ctgggtacat ttcttggcac ttgggaatca 60
gtagtcaagc gaaacccttg cctttgagag tttatggtct 100
<210> 461
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 461
gcaggataga gtgggacagt tcctgagacc agccaacctg ggggctttag ggacctgctg 60
tttcctagcg cagccatgtg attaccctct gggtctcagt 100
<210> 462
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 462
aactcattaa aacttgtgca gtgttgctgg agctggcctg gtgtctccaa atgaccatga 60
aaatacacac gtataatgga gatcattctc tgtgggtatg 100
<210> 463
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 463
atcttcttca gtccctagcc aggaataccc atttgatttc cagggtgcca tctaatcctg 60
ggctgtacat gtggatatgg acttgaggcc cacctctgtg 100
<210> 464
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 464
tccagcccct tgccctctcc tcacacgtag atcatttttt ttttgcaggg tgctgcctat 60
gggccctctg ctccccaatg ccttagagag aggaggggac 100
<210> 465
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 465
agtttctagg atgaaacact cctccatggg atttgaacat atgaaagtta tttgtagggg 60
aagagtcctg aggggcaaca cacaagaacc aggtcccctc 100
<210> 466
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 466
gatattgcta actgatcaca gattctttcc cacctcacaa tccttccgaa tgtgctccag 60
gcagcaccat ttgccatcct gcttctaacg caaacccctg 100
<210> 467
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 467
attctagacc aaagacacag gcagaccaag tccccaggcc ccgcctggaa ggaagtcgtt 60
cctcaactct ccccaaggca cctgtctcca atcagagccc 100
<210> 468
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 468
attaacatga ttttcctggt tgttacatcc agggcatggc agtggcctca gccttaaact 60
tttgttccta ctcccaccct cagcgaactg ggcagcacgg 100
<210> 469
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 469
cggcctcagc agcgagaggt gctgcggcgc tgcgtagaag tatcaatcag ccggttgctt 60
ttgtgagaag aattccttgg actgcggcgt cgagtcagct 100
<210> 470
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 470
caatggccag ggttttacct acttcctgcc agtctttccc aaaggaaact cattccaaat 60
acttcttttt tcccctggag tccgagaagg aaaatggaat 100
<210> 471
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 471
ctcgtgggac tctagaggga gtcagtctgc aacagtaagt ggtgagttct tctgtccagc 60
gtcagtattt tgatggtggc tttagacttg ccagataaca 100
<210> 472
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 472
ccctccctgt cgcccactcc tccctcctct ggctatccta ccctgtctgt gggctctttt 60
actaccagcc tatgctgtgg gactgtcatg gcatttagtt 100
<210> 473
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 473
ttaactgtat ctggagccag gacctgaact cgcacctcct acctcttcat gtttacatat 60
acccagtatc tttgcacaaa ccaggggttg ggggagggtc 100
<210> 474
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 474
gggggcaatg atgagcatat gaattttttc tcactctagc aattcccttt tctaaatgac 60
acagcattta aactcaaatc tggattcaga taacagcacc 100
<210> 475
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 475
caaggatttg ggaatcttct tgaagggctg acacgcgaga ttctgagaga gcaaccggac 60
aatataccag cttttgcagc agcctatttt gagagccttc 100
<210> 476
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 476
gtattgccca ctcatttgta taagtgcgct tcggtacagc acgggtcctg ctcccgcgat 60
gtggaagtgt cacacggcac ctgtacaaaa agactggcta 100
<210> 477
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 477
gagcaatgac aaagaggatc tgtgtcgtga atttcgaagc atgcagagaa atggaaagct 60
tatctgcacc agagaaaata accctgttcg aggcccatat 100
<210> 478
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 478
agtgcctgcg tgtgtccact cgtgggtgtg gtttgtgtgc aagagctgag gatttggcga 60
tgcttgggag gggtagttgt gggtacagac ggtgtggggg 100
<210> 479
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 479
cccctccttg ctctgcaggc accttagtgg cttttttcct cctgtgtaca gggaagagag 60
gggtacattt ccctgtgctg acggaagcca acttggcttt 100
<210> 480
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 480
tactcatggc ccacagtaga atatccaaaa cgccttggct ttcaggcctg gcctttccta 60
cagggagctc agtaacctgg acggctctaa ggctggaatg 100
<210> 481
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 481
ctgattttaa tcttcgaatc atgacactga gtgcagagga ggtggcattc cgacagcagg 60
acatacatgt tggtgtgaag actgggacga cactgggtag 100
<210> 482
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 482
aagtgcctgc agcatgtctc ccaggcacct ggccatccct ggggcccagt caccacctac 60
tgccactccc tcagccctgt ggagaacaca gcagagacca 100
<210> 483
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 483
tttcctgtgg tttatggcaa tatgaatgga gcttattact ggggtgaggg acagcttact 60
ccatttgacc agattgtttg gctaacacat cccgaagaat 100
<210> 484
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 484
actgtgccca agtgggtcca agtggctgtg acatctacgt atggctccac acctccaatg 60
ctgcctggga gccagggtga gagtctgggt ccaggcctgg 100
<210> 485
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 485
cccggggaag acacagagac tcgtacctgc gctgtttgtg ccgccgctgc ctctgggccc 60
tcccagcaca cgcatggtct cttcaccgct gccctcgagt 100
<210> 486
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 486
ggggtagcgg ggtcaggaca atcatctcag tcctgcatct tttcttctgc tttcttccct 60
ccaagagcaa aacctgggca aggggactta ctgagtgggg 100
<210> 487
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 487
ttgtcagtga aactactttg gattttaacc tcttagagga agaaaaaagg ttagggaagt 60
gtcaactctg gatgaaggtg atgtgtttgc ctctcagtct 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 488
ttctgccttg tgaattcgta gtccaatcag ctgaaattaa atcacttggg agggacgcat 60
agaaggagct ctaggaacac agtgccagtg cagaagtttc 100
<210> 489
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 489
ccctctgctc ccgcccggca ccagccctcc agtagatcct ttcacgacct tggcctctaa 60
ggcttcaccc acactggact ttacagaaag ataacgccat 100
<210> 490
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 490
cttgccctcc ctgggtcgca gacgaggtcg gcctcgtcat tccccgcaga ccgccgcgcg 60
tccctcttgt gcggttcacc acagttgtat ttaagtgatc 100
<210> 491
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 491
cagccagcct gctcgaaact ttagtcggcc tgatggctta gaggactctg aggatagcaa 60
agaagatgag aatgtgccta ctgctcctga tcctccaagt 100
<210> 492
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 492
ttccaaggaa tgcactaagc cttcagtctt tttagactga cagtactggc agctaaaata 60
ttgtactgta tcttctcttg agcccagtat gtaggaaata 100
<210> 493
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 493
tatgctgaaa aaccagctac taacactgaa gataaaatac cctcatcaac ttgatcagaa 60
agtcctggag aaacaactgc cgggctccat gacaattcaa 100
<210> 494
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 494
accagtcttc aggatatcga cagcagatta tctccaggtg gatcactggc agacgcatgg 60
gcacatcaag aaggcactca tccgaaagac agaaatgtag 100
<210> 495
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 495
tgtaagtgcc caccgcggga tgccgggaag gggcattatt tgtgcactga gaacaccgcg 60
cagcgtgact gtgagttgct cataccgtgc tgctatctgg 100
<210> 496
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 496
ccaggcctgt gttgccagag ctggcagtgt gagctgtagg cagggacggg gagggactgt 60
cgctgtgatc agagtgggtt aagctgacca ggaacaccca 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 497
ggcccacctg tccatgatgc ctccgccacc cgccctcctg ctcgctgagg ccacccacaa 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 498
gtgttcggtg accgcagcac tggggaaacg atccgctccc aaaacgttat ggctgcagct 60
tcgattgcca atattgtaaa aagttctctt ggtccagttg 100
<210> 499
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 499
cctctgaaaa cggccctctt gaagggggat atgaatggag atttgaaggt ctgcaagaac 60
ctgactcgtc tgactgtgtg tggaggagtc caggccatgg 100
<210> 500
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 500
acctcaacca ggacttcagt ggatttcagc ttctagtgga tgttgcactc aaacgggctg 60
cagagatgga gcttcaggca aaacttacag cttaacccat 100
<210> 501
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 501
ccccgggatc agttttggct cgtccatcag tgatctgcca taccactgtg actgcattga 60
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<210> 502
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 502
cctaactctg cccaccctcc tgtaccgtcg acaagaatgt ccccttaggt cgcgctcttg 60
cacacacggt tttggcagct gacttggttc tgaagccatg 100
<210> 503
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 503
gaatgacaga agcaaaggac ttgttactaa gcagatttaa gggtcagtgg gggaaggcta 60
tcaacccatt gtcagatcag catcaggctg ttatcaagtc 100
<210> 504
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 504
acccatcatc catctgccca caaacctggc caaatgtgat acaacctgaa aacctgatgg 60
actaaaggag tactatttaa caattgattg cctttgcact 100
<210> 505
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 505
cgctggtggt ggcgatctgt gctgagtgtt ggctccaccg gcctcttcat cttcctctac 60
tcagttttct attatgcccg gcgctccaac atgtctgggg 100
<210> 506
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 506
gaggagcaga agaaactcga ggagctaaaa gcgaaggccg cggggaaggg gcccttggcc 60
acaggtggaa ttaagaaatc tggcaaaaag taagctgttc 100
<210> 507
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 507
ctctccctat tcacaaccag tgcacagttt gacacagtgg cctcaggttc acagtgcacc 60
atgtcactgt gctatcctac gaaatcattt gtttctaagt 100
<210> 508
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 508
aggccaatgc cagggccatc cacaggctcc ggaagcagct ggtgtggcag gttcaggaga 60
agtggcacct ggtggaggac ctgtcgcgac tgctgccgga 100
<210> 509
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 509
tcatttacat aagtattttc tgtgggaccg actctcaagg cactgtgtat gccctgcaag 60
ttggctgtct atgagcattt agagatttag aagaaaaatt 100
<210> 510
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 510
aggagaataa atgttggagg ggtaatacac aaaaacaaag gcatatttga tgaagtaccc 60
tgtgttatgt gaacacaatt tccccttctg ttaagactat 100
<210> 511
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 511
gctctgtgaa ggcaatgagt gtcacttccc tctgctctaa taaagcaata aataatagct 60
aaagggctga ctttcacttc gaactcttgg ccacggcttt 100
<210> 512
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 512
ggtggttagc tatacgggaa atggtaagta gtgttgtctt cagtatctta atttgtttct 60
gcaactgtgc actcctccct tggtggcacc ctatgggtgt 100
<210> 513
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 513
ttaactttgt aagatgcaaa gaggttggat caagtttaaa tgactgtgct gcccctttca 60
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<210> 514
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 514
gcctggagga agttttggaa agagttcaag tgtctgtata tcctatggtc ttctccatcc 60
tcacaccttc tgcctttgtc ctgctccctt ttaagccagg 100
<210> 515
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 515
agtcagagag ccggcactct cagttgccct ctggttgagt tggggggcag ctctgggggc 60
cgtggcttgt gccatggctc tgctgaccca acaaacagag 100
<210> 516
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 516
ccctcaaagg aggaaattgc tcagaagacc tcttatgtat cctgaaaagg gctccattca 60
agaagtcatg ggcctacctc caagtggcaa agcatctaaa 100
<210> 517
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 517
tctggctcgg ataagagatg ggacatcatt cagtcactag ttggatggca caaggctctt 60
cacagacgca tctgtagcag agtggatctt gtactaactt 100
<210> 518
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 518
tacttcctgt gccttgccag tgggattcct tgtgtgtctc atgtctgggt ccatgatagt 60
tgccatgcca accagctcca gaactaccgt aattatctgt 100
<210> 519
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 519
tctcccctcc accagccagg atcctccttc tagctcatct gtagatacta gtagtagtca 60
accaaagcct ttcagacgag taagacttca gacaacattg 100
<210> 520
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 520
gcctgcgtcg cttccggagg cgcagcgggc gatgacgtag agggacgtgc cctctatatg 60
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<210> 521
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 521
gccagtgtcc catatgttcc tcctgacagt ttgatgtgtc cattctgggc ctctcagtgc 60
ttagcaagta gataatgtaa gggatgtggc agcaaatgga 100
<210> 522
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 522
cacccgcttt gacatgggta gccttcggag ggagggtttt cagccacgaa gtactgatgc 60
aggggtatag cttgccctca cttgctcaaa aacaactacc 100
<210> 523
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 523
ctgggaaacc ttcatgcctc tctgatggtt actgcccacc cttaccccac ccctcagctc 60
agcctggtat ggaaagcaag gtgcacgttg gtctttgatt 100
<210> 524
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 524
tctgcagagg catccggatc ccagcaagcg agctttagca gggaagtcac ttcaccatca 60
acattcctgc cccagatggc tttgtgattc cctccagtga 100
<210> 525
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 525
gtgctaccaa aggggataca caagcccttt aggaagcagt acctctcgcc tggaggatct 60
gtgccatctt ggattgagaa ttgcagatgt gacagaatgg 100
<210> 526
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 526
ctgctattcg ggtaatcttc acagaaatga ctgagagaag aatctgcagt ttactgaggg 60
catttcagtt cctcctacca cctcaacagg actttgtcca 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 527
ctctatacca ataagtcagt caccttgctc ctctccagag gcaaagtgga agagatcctg 60
caagacacat ctatcctttc acagtgttcc caagggaact 100
<210> 528
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 528
agttgatgaa cccatcatgc tggtttttct ctgagcacaa agttttaggc tgtacacagc 60
cagccttggg aatctcgttg agcgttcggc gtggatccac 100
<210> 529
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 529
ccccagacca acccttccct ccctttcccc acctcttaca gtgtttggac aggagggtat 60
ggtgctgctc tgtgtagcaa gtactttggc ttatgaaaga 100
<210> 530
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 530
tactaatcag gcatctgacc tgcactgtca tcccctgcct ggacttttgc gatggactct 60
ttgggggaaa aactaacgct ttttaattat tgtgaaagca 100
<210> 531
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 531
tcgactgctc agatctcaga atcaagacaa acccgaattg aaaagaagat tgaagcccac 60
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 532
caaaaaagaa tgaacacccc tgactctgga gtggtgtata ctgccacatc agtgtttgag 60
tcagtcccca gaggagaggg gaaccctcct ccatcttttt 100
<210> 533
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 533
taagctagag gtcatggtca ctgaaattac tttccaaagt ggaagacaaa atgaaacagg 60
aactgaggga atatttaaga tcccacagaa gcgtaaaaat 100
<210> 534
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 534
ttggatccat ttccatcggt ccttacagcc gctcgtcaga ctccagcagc caagatggtg 60
aagcagatcg agagcaagac tgcttttcag gaagccttgg 100
<210> 535
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 535
tcatctactg ccaagtagga gaaaagcctt attggaaaga tccaaataat gacttcagaa 60
aaaacttgaa agtaacagca gtgcctacac tacttaagta 100
<210> 536
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 536
ctcagttgca gcactgagtg gtcaaaatac atttctgggc cacctcaggg aacccatgca 60
tctgcctggc atttaggcag cagagcccct gaccgtcccc 100
<210> 537
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 537
tgttgcatgg aagggatagt ttggctccct tggaggctat gtaggcttgt cccgggaaag 60
agaactgtcc tgcagctgaa atggactgtt ctttactgac 100
<210> 538
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 538
tttatggcca aactattttg aattttgttg tccggccctc agtgccctgc cctctccctt 60
accaggacca cagctctgtt ccttcggcct ctggtcctct 100
<210> 539
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 539
ccgccacgtg cgggcgctgg tgcttgagct gtgctgtaac gacgagagcg gcgaggatgt 60
cgaggttccc tatgtccgat acaccatccg ctgaccccgt 100
<210> 540
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 540
tgcagatctt cgtgaagacc ctgactggta agaccatcac tctcgaagtg gagccgagtg 60
acaccattga gaatgtcaag gcaaagatcc aagacaagga 100
<210> 541
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 541
acgctggctc cctatccaca ctgtggaaac catcatgatt agtgtcattt ctatgctggc 60
agaccctaat ggagactcac ctgctaatgt tgatgctgcg 100
<210> 542
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 542
ctgctctgct gactggggaa gtcatcgtgc cacccagaac ctgagtgcgg gcctctcaga 60
gctccttcgt ccgtgggtct gccggggact gggccttgtc 100
<210> 543
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 543
gggggtccca aagagtttga tgaggccctc cacacctgcg gcccaatcca aggtggggtg 60
gaagcttggg gaagacccat tccttcccag aggggcctgc 100
<210> 544
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 544
tgacgcggat gcggcatgtg atcagctaca gcttgtcacc gttcgagcag cgcgcctatc 60
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<210> 545
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 545
tctattcctt atatggagtt gttgaacaca gtggtactat gaggtcgggg cattacactg 60
cctatgccaa ggcaagaacc gcaaatagtc atctctctaa 100
<210> 546
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 546
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Claims (40)
- 포유동물 대상체에서 폐암의 존재를 진단하거나 진행을 평가하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 적어도 10개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 I의 유전자로부터 선택되는 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화되는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 검출가능한 표지에 부착되는, 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 상이한 검출가능한 표지에 부착되는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 포획 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 포획 올리고뉴클레오타이드는 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있는, 조성물.
- 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 포획 올리고뉴클레오타이드는 기재에 결합하는, 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 포획 올리고뉴클레오타이드가 결합하는 기재를 추가로 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 15개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 25개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 50개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 75개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 100개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 적어도 500개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 표 I에 열거된 각각의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 포유동물 대상체에서 폐암의 존재를 진단하거나 진행을 평가하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 적어도 10개의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 표 II의 유전자로부터 선택되는 샘플에서의 상이한 유전자, 유전자 분절, 유전자 전사체 또는 발현 산물에 혼성화되는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 검출가능한 표지에 부착되는, 조성물.
- 청구항 16에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드는 상이한 검출가능한 표지에 부착되는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 기재를 추가로 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 적어도 15개의 리간드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 적어도 20개의 리간드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 적어도 30개의 리간드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 표 II에 열거된 각각의 상이한 유전자 발현 산물에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1 및 22 중 어느 한 항의 조성물 및 샘플 수집용 장치를 포함하는 키트.
- 청구항 23에 있어서, 상기 샘플 수집용 장치는 샘플을 안정화시키는 시약을 포함하는, 혈액 보유용 튜브를 포함하는, 키트.
- 청구항 24에 있어서, 상기 시약은 샘플에서 mRNA를 안정화시키는, 키트.
- 포유동물 대상체에서 폐암의 존재를 진단하거나 폐암을 평가하는 방법으로, 상기 대상체의 샘플에서 10개 이상의 유전자의 발현 변화를 식별하는 단계 (상기 유전자는 표 I의 유전자 또는 표 II의 유전자로부터 선택됨); 및 상기 대상체의 유전자 발현 수준을 기준 또는 대조군의 동일한 유전자의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 기준의 것으로부터 상기 대상체의 유전자의 발현 변화는 폐암의 진단 또는 평가와 관련이 있는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 진단 또는 평가는 폐암의 진단, 양성 결절의 진단, 폐암의 단계 진단, 폐암의 유형 또는 분류의 진단, 폐암 재발의 진단 또는 검출, 폐암 퇴행의 진단 또는 검출, 폐암의 예후, 또는 외과적 또는 비-외과적 요법에 대한 폐암의 반응 평가 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 변화는 상기 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 상향조절 또는 상기 기준 또는 대조군과 비교하여 하나 이상의 선택된 유전자의 하향조절을 포함하는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 대상체에서 폐 결절의 크기를 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 특이도는 약 90%의 감도에서 약 46%인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 특이도는 10mm보다 작은 결절에 대해 약 90%의 감도에서 약 54%인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 정확도는 8mm 이하의 결절에 대해 약 88%, 8mm보다 크고 12mm 이하인 결절에 대해 약 75%, 12mm보다 크고 16mm 이하인 결절에 대해 약 68%, 16mm보다 큰 결절에 대해 약 53%인, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 진단을 위해 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 조성물을 사용하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 기준 또는 대조군은 적어도 하나의 기준 대상체의 표 I 샘플의 3개 이상의 유전자를 포함하고, 상기 기준 대상체는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법: (a) 악성 질환을 갖는 흡연자, (b) 비-악성 질환을 갖는 흡연자, (c) 비-악성 질환을 갖는 과거 흡연자, (d) 질환이 없는 건강한 비-흡연자, (e) 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)이 있는 비-흡연자, (f) COPD가 있는 과거 흡연자, (g) 고체 폐 종양의 제거 수술 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; (h) 상기 종양의 외과적 제거 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체; (i) 고체 폐 종양을 위한 요법 전 고체 폐 종양을 갖는 대상체; 및 (j) 고체 폐 종양을 위한 요법 중 또는 요법 후 고체 폐 종양을 갖는 대상체.
- 청구항 34에 있어서, 상기 기준 또는 대조 대상체 (a)-(j)는 시간적으로 더 이른 시점의 동일한 시험 대상체인, 방법.
- 청구항 26 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 말초혈인, 방법.
- 청구항 36에 있어서, 상기 샘플 내 핵산은 유전자 발현 수준의 변화를 식별하기 전에 안정화된, 방법.
- 환자에서 폐암을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 환자로부터 샘플을 수득하는 단계; 및
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계
를 포함하는, 방법. - 환자에서 폐암을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 100개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계; 및
c. 기준의 것으로부터 상기 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 상기 대상체를 진단하는 단계
를 포함하는, 방법. - 신생물 성장을 갖는 대상체에서 폐암을 진단 및 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 대상체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계;
b. 환자 샘플을 표 I 또는 표 II의 적어도 10개의 유전자의 각각의 상이한 유전자 전사체 또는 발현 산물에 특이적인 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 리간드와 유전자 산물 또는 발현 산물 사이의 결합을 검출함으로써 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 표 I 또는 표 II로부터 선택된 적어도 10개의 유전자의 발현 변화를 검출하는 단계;
c. 기준의 것으로부터 상기 대상체의 유전자의 발현 변화가 검출되는 경우 암으로 상기 대상체를 진단하는 단계; 및
d. 신생물 성장을 제거하는 단계
를 포함하는, 방법.
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