CN116356016A - 一种肺癌长链非编码rna生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺癌长链非编码RNA生物标志物及其应用，本发明的一种肺癌长链非编码RNA生物标志物，所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物为FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15。本发明所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物AWPPH联合血清肿瘤标志物Cyfra21‑1在制备肺癌早期诊断产品中的应用。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明AWPPH与Cyfra21‑1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

Description

一种肺癌长链非编码RNA生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种肺癌LncRNA生物标志物及其应用。

背景技术

肺癌是一种高发病率高死亡率的恶性肿瘤，云南是我国的癌症高发地区。目前肺癌的诊断大多依靠病理学活检和影像学检查，而这两种检测方法都存在着各自的缺陷，并不适用于肺癌的早期诊断。临床常用的肿瘤标志物都有敏感性和特异性不佳的问题，因此迫切需要找寻一种具有较好的敏感性和特异性的肺癌标志物。多项研究表明LncRNA有作为多种癌症标志物的潜力，本发明在前期研究的基础上，从LncRNA芯片结果中挑选出一部分表达差异较大的LncRNA，对目标LncRNA进行筛选验证，建立相对定量的实时荧光定量PCR检测方法。检测目标LncRNA在肺癌患者血清中的表达并评估其作为肺癌诊断标志物的价值。

2020年全球共新增癌症病例达1930万例，其中肺癌占比11.4％，约220万例，且肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，约有180万死亡病例。根据国家癌症中心登记的数据，肺癌仍然是中国发病率和死亡率最高的癌症，也是中国男性最常见的癌症。而且癌症在我国各个地区都属于高发恶性肿瘤，对人民生命健康威胁巨大。

肺癌是一种起源于肺部支气管黏膜或腺体的常见恶性肿瘤，按照组织学分型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌又可分为腺癌、鳞癌和大细胞癌几种亚型，不同的亚型往往有着不同的病理特征和生长扩散特点。肺癌的病因至今仍未完全阐明，有观点认为是原癌基因或抑癌基因突变导致了肺癌的发生。目前临床上大多根据病理学活检、影像学检查、临床症状和肿瘤标志物检测对肺癌做出诊断，病理学活检虽然是金标准，但是对于人体损伤过大且并非所有适用于所有患者，影像学检查虽然提高了肺癌的检出率，但是仍然有放射损伤和定位困难等缺点。肿瘤标志物能够反映肿瘤的存在和生长，且表达水平改变往往早于临床影像学表现，检测过程具有无创、快速、可动态监测等优势，适合应用于大规模人群筛查及肺癌诊治全程。肺癌标志物如癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)、细胞角质蛋白21-1片段(CYFRA21-1)等已经广泛运用于肺癌临床的诊断治疗预后中，但这些标志物也存在着特异性、灵敏度较差等缺点，随着肺癌的发病趋于年轻化，也为了满足肺癌的早诊断早治疗早康复的需求，寻找新的能更好地指导临床的肺癌标志物就显得刻不容缓。

人类基因组研究计划指出人类基因组中仅有1％-2％的蛋白质编码RNA，其余的98％被认为是无用DNA。大多数无用DNA实际上被转录成如snRNA、snoRNA、microRNA和circularRNA等非编码RNA，这些RNA大多没有或仅有很少的编码潜能，但是同样在人体细胞的正常生理活动中扮演着重要的角色。近年来，越来越多的非编码RNA(ncRNAs)已被确定为许多生物过程的关键调控因子，包括基因表达调控、细胞周期控制、凋亡、细胞身份决定、染色质重塑和表观遗传修饰，想要弄清不同类型的细胞在特定的时间内ncRNAs的功能以及它们之间、它们和DNA之间的相互作用还有很长的路要走，远比基因组计划更为艰巨。因此，摸清ncRNA的调控网络会为破解生命的奥秘提供巨大的帮助和启发。

长链非编码RNA(LongncRNA，简称LncRNA)是一组长度超过200个核苷酸的异质性ncRNA。LncRNA一般由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，结构与信使RNA相似，具有多聚(A)尾巴、5’-帽结构和启动子结构，但是缺少开放阅读框，因此也就不具备编码蛋白质的能力。LncRNA功能包括:(1)招募染色质重构和修饰复合体到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达；(2)与mRNA结合，调控mRNA的翻译；(3)与某些转录因子结合成复合体，影响mRNA转录；(4)作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，竞争结合miRNA的目标mRNA。近年来已经有多项研究表明LncRNA与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系，使得LncRNA越发受到业内关注。在Liu等人的研究中，宫颈癌细胞中高表达的LncRNA SNHG1能够有效的促进宫颈癌的发展，而敲低SNHG1的表达就能够有效抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。LncRNA NBR2与肝细胞癌、大肠癌、甲状腺癌等多种癌症的发生发展有着密切的关系，是目前一个重要研究的LncRNA，此外NBR2也能够通过调节NSCLC中的相关通路抑制EMT进展。这就说明了LncRNA在人体内存在和作用的广泛性和复杂性，也为LncRNA的研究提供了新的思路。

液体活检即通过微创的手段获取脑脊液、血液、尿液和唾液等样本对疾病进行诊断，LncRNA在外周血、外泌体及TEP(tumor educated platelet)中含量较高易于富集和检测，在肺癌诊断中具有较大潜力。随着对LncRNA分子机制和生物学功能的进一步了解，LncRNA在肿瘤早期诊断和预后标志物中的作用越来越受到重视。以往的方法都是采用侵入性的方法从人体组织中提取LncRNA，目前的研究表明从体液中获得稳定的循环LncRNA是可能的。LncRNA广泛存在于血液、唾液、胃液和尿液等各种体液中。LncRNA在体液中也高度稳定，即使在反复冻融、45℃孵育24h、室温孵育24h以及其他恶劣条件下，它们也表现出显著的稳定性，这表明人体内存在一种保护循环中的LncRNA免受外界降解的机制。目前，循环中的LncRNA被认为主要由肿瘤细胞分泌，主要包含在脂质或脂蛋白小泡中(如凋亡小泡、外泌体或微泡)，从而抵抗核糖核酸酶在体液中的降解。LncRNA的高稳定性和在各种体液中的广泛存在，使得循环中的LncRNA成为肿瘤潜在的生物标志物。目前，循环LncRNA已成为肿瘤非侵袭性诊断和预后的新热点，近年来的研究表明，多种LncRNA可作为肿瘤生物标志物，对临床研究具有重要意义。而对于标本收集，有研究表明使用了EDTA抗凝剂和无抗凝剂分离得到的血清或血浆相比使用肝素抗凝剂分离得到的血清中的LncRNA含量更高且稳定性更好，这一点也指导了本发明的收集标本的选择。

血液中循环的LncRNA是如何产生的，其在血液中长期循环的机制尚不清楚。最普遍的解释是，它作为一种循环核酸(CNA)，可能源于肿瘤细胞的自我分泌、裂解凋亡和坏死。许多研究表明，在接受手术的癌症患者血清中，LncRNA的表达水平改变可以反映手术效果和肿瘤动态，有希望成为多种癌症的诊断标志物。在Han等人的研究中，与配对的术前血浆相比，术后GAS5和H19水平分别在71.8％和82.1％的乳腺癌患者血浆中表达显着降低，且术前Ki67增殖指数高的患者(P＝0.012)和术后淋巴结转移阳性的患者(P＝0.029)血浆GAS5水平较低，因此认为血浆LncRNA GAS5具有评估乳腺癌患者手术效果和预后的潜力而H19可以成为检测乳腺癌的潜在标志物。在另一项研究中，Zheng等人经过两个阶段的验证表明，与健康对照组相比，胃癌患者血浆中FAM49B-AS，GUSBP11和CTDHUT三种LncRNA的血浆水平更高(P<0.05)，并且三种LncRNA联合诊断的AUC为0.818(95％CI:0.772-0.864)，在根治性手术后第10天，三种LncRNA的血清表达水平相比术前均显著下降(P<0.05)，因此认为这三种LncRNA的表达水平变化能够对手术的治疗效果进行评估。LncRNA H19在NSCLC患者血浆相对表达水平比良性肺疾病患者高，且H19对NSCLC的诊断敏感度为67.74％，特异性为63.08％，ROC曲线下的面积为0.73，cut-off值为6.62，可作为血清学指标辅助诊断NSCLC。LncRNA有望成为包括癌症在内的多种疾病的新型诊断标志物，因此对于循环LncRNA的研究就显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的第一目的在于提供一种肺癌LncRNA生物标志物及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种肺癌长链非编码RNA生物标志物，所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物为FAM30A(family with sequencesimilarity 30 member A)，AWPPH(MIR4435-2 host gene)，CHCHD4P4(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 4 pseudogene 4)，SRA1(steroidreceptor RNA activator 1)和SNHG15(small nucleolar RNA host gene 15)。

进一步地，所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的正向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1、3、5、7、9所示，所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的反向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.2、4、6、8、10所示。

进一步地，所述的肺癌长链非编码RNA AWPPH在肺癌组织和肺癌患者血清中表达均上调，本发明结果与芯片结果一致。

本发明所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，所述的诊断产品包含检测所述的一种或多种标志物的试剂，所述的试剂通过检测受试者标本中所述的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌。

进一步地，所述的标本是肺组织或血液。

进一步地，所述的试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述的一种或多种标志物浓度时所需的试剂。

更进一步地，所述的诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

本发明含有所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物的肺癌早期诊断试剂盒。

进一步地，该试剂盒用于检测肺组织或血液中FAM30A和/或AWPPH和/或CHCHD4P4和/或SRA1和/或SNHG15。

本发明所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物AWPPH联合血清肿瘤标志物Cyfra21-1在制备肺癌早期诊断产品中的应用。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明AWPPH与Cyfra21-1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

有益效果：本发明表明肺癌长链非编码RNA生物标志物是潜在的肺癌诊断标志物，AWPPH联合血清肿瘤标志物Cyfra21-1可以进一步提高肺癌的诊断效能。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明AWPPH与Cyfra21-1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)结合前期研究取得的芯片结果，选择了5条在肺癌组织和癌旁组织中表达差异倍数较大的LncRNA：FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15。选取了LncRNA AWPPH进行下一步的血清大样本检测，就是采用qRT-RCR的方法检测肺癌组、肺良性疾病组、健康组血清中AWPPH的表达水平。使用ddPCR对扩增曲线进行校正，以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt计算血清AWPPH相对表达水平。通过ROC曲线评价外AWPPH对肺癌的诊断效能。

附图说明

图1为本发明的芯片分析结果图；

图2为本发明的生信分析图；图2A为本发明的FAM30A生信分析靶标图；图2B为本发明的FAM30A生信分析相关疾病图；

图3为本发明的生信分析图；图3A为本发明的AWPPH生信分析靶标图；图3B为本发明的AWPPH生信分析相关疾病图；

图4为本发明的CHCHD4PD生信分析疾病图；

图5为本发明的SRA1生信分析图；图5A.SRA1生信分析靶标图；图5B为本发明的SRA1生信分析相关疾病图；

图6为本发明的SNHG15生信分析图；图6A为本发明的SNHG15生信分析靶标图；图6B为本发明的SNHG15生信分析相关疾病图；

图7为本发明的扩增曲线图和熔解峰图；图7A为本发明的FAM30A扩增曲线图和熔解峰图；图7B为本发明的AWPPH扩增曲线图和熔解峰图；图7C为本发明的CHCHD4P4扩增曲线图和熔解峰图；图7D为本发明的SRA1扩增曲线图和熔解峰图；图7E为本发明的SNHG15扩增曲线图和熔解峰图；

图8为本发明的产物电泳图；图8A为本发明的FAM30A、CHCHD4P4和AWPPH产物电泳图；图8B为本发明的SRA1和SNHG15产物电泳图；

图8A为本发明的泳道1是1000bp Maker，从上至下分别是：1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。泳道2是FAM30A扩增产物。泳道3是CHCHD4P4扩增产物。泳道4是AWPPH扩增产物。泳道5是空白对照。能够看出条带清晰且均为单一条带，至此可以确定产物为单一产物，且产物长度在100bp至200bp间，与设计引物时预测一致。

图8B中泳道1是1000bp Maker，从上至下分别是：1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。泳道2是空白对照。泳道3是SRA1扩增产物。泳道5是SNHG15扩增产物。可以看出产物条带虽然是单一条带但不够清晰，产物长度也小于100bp，和设计引物时预测不一致。

图9为本发明的FAM30A正向测序与UCSC查询结果图；

图10为本发明的FAM30A反向测序与UCSC查询结果图；

图11为本发明的CHCHD4P4正向测序与UCSC查询结果图；

图12为本发明的CHCHD4P4反向测序与UCSC查询结果图；

图13为本发明的AWPPH正向测序与UCSC查询结果图；

图14为本发明的AWPPH反向测序与UCSC查询结果图；

图15为本发明的内参β-actin扩增曲线图和熔解峰图；

图16为本发明的β-actin正向测序与UCSC查询结果图；

图17为本发明的β-actin反向测序与UCSC查询结果图；

图18为本发明的引物浓度为0.25μmol/ml时的熔解峰曲线图；

图19为本发明的引物浓度为0.5μmol/ml时的熔解峰曲线图；

图20为本发明的引物浓度为0.75μmol/ml时的熔解峰曲线图；

图21为本发明的引物浓度为1.0μmol/ml时的熔解峰曲线图；

图22为本发明的温度梯度电泳结果图。

图23为本发明的AWPPH在肺癌组、肺良性组和健康组的水平对比图。

图24为本发明的肿瘤标志物AFP在肺癌组和健康组的图；图24A为本发明的肿瘤标志物AFP在肺癌组和健康组的水平对比图；图24B为本发明的肿瘤标志物CEA在肺癌组和健康组的水平对比图；图24C为本发明的肿瘤标志物NSE在肺癌组和健康组的水平对比图；图24D为本发明的肿瘤标志物Cyfra21-1在肺癌组和健康组的水平对比图。

图25为本发明的AWPPH独立检测的ROC曲线图。

图26为本发明的Cyfra21-1独立检测的ROC曲线图。

图27为本发明的Cyfra21-1和AWPPH联合检测肺癌时的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明的一种肺癌长链非编码RNA生物标志物，所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物为FAM30A(family with sequence similarity 30 member A)，AWPPH(MIR4435-2host gene)，CHCHD4P4(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 4pseudogene 4)，SRA1(steroid receptor RNA activator 1)和SNHG15(small nucleolarRNA host gene 15)。

所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的正向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1、3、5、7、9所示，所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的反向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.2、4、6、8、10所示。

所述的肺癌长链非编码RNA AWPPH在肺癌组织和肺癌患者血清中表达均上调，本发明结果与芯片结果一致。

本发明所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，所述的诊断产品包含检测所述的一种或多种标志物的试剂，所述的试剂通过检测受试者标本中所述的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌。

所述的标本是肺组织或血液。

所述的试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述的一种或多种标志物浓度时所需的试剂。

所述的诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

本发明含有所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物的肺癌早期诊断试剂盒。

该试剂盒用于检测肺组织或血液中FAM30A和/或AWPPH和/或CHCHD4P4和/或SRA1和/或SNHG15。

FAM30A——lncRNA KIAA0125作为肿瘤抑制因子通过Wnt/β-catenin通路调节结直肠癌的生长和转移。

10.1002/cbin.11196。长的非编码RNA AWPPH的上调通过miR-203a/DKK2轴抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。10.1007/s13577-019-00277-x。长链非编码RNA CHCHD4P4在草酸钙诱导的肾损伤中促进上皮间质转化并抑制细胞增殖。10.1590/1414-431X20176536。LncRNASRA1在肝细胞癌中的表达降低及其临床意义。10.3233/CBM-160305。SNHG15通过靶向miR-188-5p/DAAM1促进口腔鳞状细胞癌的恶性行为。10.1111/jop.13169。以上的LncRNA在文章讨论中均有提及出处。

本发明所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物AWPPH联合血清肿瘤标志物Cyfra21-1在肺癌诊断产品中的应用。可提高肺癌的诊断效能。

试验例1

1实验试剂

2实验仪器

3患者标本收集

从2021年7月至2021年12月间收集昆明医科大学第一附属医院肺癌病人EDTA抗凝血，用离心机3000r/min离心10min分离出血清，血清用无RNAse酶冻存管分装后保存在-80℃冰箱。同样方法处理肺良性疾病组病人标本和健康人群标本。共收集到155例肺癌病人血清，114例肺良性疾病病人血清，60例健康人血清。

各组标本纳入标准：

肺癌组：主要来自我院胸外科及老年胸外科诊断为肺癌的病人。

肺良性疾病组：主要来自我院呼吸科及老年呼吸科，病人是患有如肺炎，肺大疱等良性疾病或者经病理学活检为肺良性肿瘤。

健康组：主要来自我院体检中心，常规体格检查、全身彩超、X胸片和各项实验室检查结果正常。

各组标本排除标准：

肺癌组：患有糖尿病等代谢类疾病、患有肺癌外的其他恶性肿瘤、传染性疾病或其他肿瘤转移导致的肺癌，患有免疫系统疾病。

肺良性疾病组：患有糖尿病等代谢类疾病、传染性疾病、其他恶性肿瘤或免疫系统疾病。

健康组：既往患过恶性肿瘤、糖尿病等代谢类疾病、传染性疾病或免疫系统疾病。

本发明经过昆明医科大学伦理委员会批准(8216080364)，入选患者已填写知情同意书。

4芯片分析

对北京博奥公司晶芯LncRNA+mRNA表达谱芯片得到的图片进行预处理，再使用Agilent GeneSpring GX软件计算，找到有差异表达的基因并计算差异倍数和P值。

5标志物筛选

在癌组织和癌旁组织中表达差异倍数大于2且经过T检验得到的P值小于0.05的LncRNA才能够入选。从芯片分析数据中按照差异倍数的顺序筛选出有价值的LncRNA，并在NCBI中查找其基因序列，选择能够找到基因序列并且差异倍数较大的LncRNA作为候选标志物。

6引物设计

根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)数据库查询候选标志物的基因信息及序列，并使用设计软件Primer Premier 5进行引物设计，内参有GAPDH、U6与β-actin。

7总RNA提取

7.1标本预处理：将冻于-80℃冰箱内的血清取出，室温放置等待融化。融化后将其转移到2ml无RNAse酶EP管内，12000r/min离心10min再次去除红细胞等杂质。

7.2制备裂解物：取250μl血清加入EP管，加入750μl Trizol，用漩涡振荡器混匀后室温静置5min。

7.3加入氯仿：在4℃条件下，12000r/min离心5min，将透明的上清液转移到新的EP管内，加入150μl氯仿，再次震荡混匀，室温静置10min。

7.4加入异丙醇：在4℃条件下，12000r/min离心15min，转移上清液到新的EP管内，再加入1.25倍体积的异丙醇(即400μl上清液和500μl的异丙醇)，再次震荡混匀后室温静置15min。

7.5分离总RNA：在4℃条件下，12000r/min离心10min，直接倒掉上清液(注意不要倒掉底部的RNA沉淀)。

7.6清洗总RNA：加入750μl 75％乙醇，用手微微震荡清洗(可看见RNA沉淀悬浮在液体中，切勿剧烈震荡)，直接在4℃条件下，8000r/min离心5min。

7.7挥发残留液体：缓慢轻柔倒净上清液，注意不要倒掉RNA沉淀，或用移液枪吸走液体，将EP管放置于生物安全柜内等待残留液体挥发。

7.8溶解总RNA：沉淀干燥后，加入20μl ddH₂O溶解RNA，用移液枪反复吹打混匀。

7.9总RNA浓度测定：使用超微量紫外可见分光光度计进行总RNA浓度测定。开机后选择RNA测定模式，滴加1μl的ddH₂O在检测孔上，选择空白检测。检测结束后用纸巾擦去ddH₂O，再滴加1μl总RNA进行样品检测，得到总RNA浓度。

7.10总RNA稀释：本实验使用的逆转录试剂盒要求模板量为10ng-2000ng，根据总RNA浓度测定结果用ddH₂O对总RNA进行稀释。

8逆转录

按照TIANGEN InRcute LncRNA第一链合成试剂盒的说明书进行逆转录。

8.1前期准备：将总RNA、10×lnR RT Buffer、lnR RT Enzyme Mix、lnR-RT PrimerMix和RNAse-Free ddH₂O在室温下解冻，解冻后置于冰上。使用之前对每种试剂都涡旋震荡混匀后简短离心。

8.2gDNA去除：在八联管内加入8μl总RNA，加入2μl 5×gDNA buffer制成gDNA去除体系，彻底混匀后使用小型离心机简短离心，并置于常规PCR仪上42℃孵育3min，置于冰上保存。

8.3逆转录：按照表1的反转录体系配置混合液，逆转录体系组分如表1所示：

表1

将10μl反转录体系混合液加入到gDNA去除体系中，充分混匀后制成20μl反应体系，简短离心后使用常规PCR仪进行逆转录。42℃孵育15min，再95℃孵育3min后得到cDNA，置于冰上。

9cDNA稀释

使用超微量紫外可见分光光度计进行cDNA浓度测定。开机后选择ssDNA测定模式，滴加1μl的ddH₂O在检测孔上，选择空白检测。检测结束后擦去ddH₂O，再滴加1μl逆转录得到的cDNA进行样品检测，得到cDNA浓度。按照体系要求使用ddH₂O对cDNA进行稀释。

10实时荧光定量PCR

按照TIANGEN InRcute LncRNA荧光定量检测试剂盒的说明书进行扩增。

10.1前期准备：将2×lnR LncRNA PreMix，cDNA，引物和ddH₂O置于室温下解冻并轻轻混匀(PreMix不可使用振荡器混匀，只能轻微颠倒混匀并避免出现泡沫)，短暂离心后置于冰上。

10.2配制扩增体系：按照表2配制扩增体系组分

表2

10.3 PCR反应：将配置好的体系加入到八联管中，简短离心(需要保证无气泡)后按照表3进行三步法扩增。PCR步骤设置如表3所示：

表3

11统计学分析

对比肺癌组、健康组与肺良性疾病组血清中的标志物的表达，由于数据不符合正态分布，使用Mann-Whitney非参数检验对数据进行比较。GraphPad Prism 8.0软件用来绘制差异表达LncRNA的柱状图与散点图。使用SPSS17.0进行统计分析，p<0.05有统计学意义。

1芯片分析

筛选在癌组织和癌旁组织中表达差异倍数大于2且经过T检验得到的P值小于0.05的LncRNA。一共有1017条LncRNA表达水平有差异，其中有275条在肺癌组织中表达下调，另外的742条在肺癌组织中表达上调。分析结果如下图1，黑色表示在肺癌组织和癌旁组织中表达无差异的LncRNA，绿色表示低表达的LncRNA，红色则表示的是高表达的LncRNA。芯片分析结果图如表1所示。

2标志物筛选

对表达倍数差异最大的20条LncRNA进行生信分析，有的LncRNA由于还未进行正式命名，无法查到其基因序列，所以未能进行生信分析。在能够查询基因序列的剩下的LncRNA中有5条LncRNA的靶标在肺癌中发挥着重要作用，分别是LncRNA FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15，因此选择这5条LncRNA进行研究。

其中FAM30A，AWPPH和CHCHD4P4在肺癌组织中表达上调，而SRA1和SNHG15在肺癌组织中表达下调，内参基因是LncRNA研究中使用较多的β-actin、GAPDH和U6。标志物生信分析靶标及相关疾病分析见图2-6。图2为本发明的A.FAM30A生信分析靶标B.FAM30A生信分析相关疾病图。图3为本发明的A.AWPPH生信分析靶标B.AWPPH生信分析相关疾病图。图4为本发明的CHCHD4PD生信分析疾病图。图5为本发明的A.SRA1生信分析靶标B.SRA1生信分析相关疾病图。图6为本发明的A.SNHG15生信分析靶标B.SNHG15生信分析相关疾病图。

3引物设计

引物使用Primer Premier5软件进行设计，然后使用NCBI的BLAST功能对产物进行预测，选择产物预测正确且预测扩增产物长度在100bp到300bp之间的引物序列，使用的引物序列如表4所示。

此处是实验中所用到的所有标志物及内参的引物序列

表4

/>

后三种是在内参筛选中使用的，GAPDH和U6也参与的内参的选择，但最终选择了β-actin。

4标志物血清验证

使用部分肺癌患者和健康患者的血清对引物进行验证，看引物能否有效扩增，扩增结果如图7。图7为本发明的扩增曲线图和熔解峰图；图7A为本发明的FAM30A扩增曲线图和熔解峰图；图7B为本发明的AWPPH扩增曲线图和熔解峰图；图7C为本发明的CHCHD4P4扩增曲线图和熔解峰图；图7D为本发明的SRA1扩增曲线图和熔解峰图；图7E为本发明的SNHG15扩增曲线图和熔解峰图；

从图7中能够看出每对引物都能够产生扩增曲线且扩增后熔解峰为单峰，说明扩增产物单一，没有非特异性产物的存在，但还需要进一步对引物进行验证扩增产物是否正确。

5产物电泳验证

产物单一且扩增曲线均一还是不能够说明产物就是目标产物，一般还需要选择进行电泳排除引物二聚体的可能性。将扩增产物进行电泳，并在凝胶成像仪下曝光，看条带还是否为单一条带且长度与预测一致。电泳图见图8。图8为本发明的产物电泳图；图8A为本发明的FAM30A、CHCHD4P4和AWPPH产物电泳图；图8B为本发明的SRA1和SNHG15产物电泳图；图8A为本发明的泳道1是1000bp Maker，从上至下分别是：1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。泳道2是FAM30A扩增产物。泳道3是CHCHD4P4扩增产物。泳道4是AWPPH扩增产物。泳道5是空白对照。能够看出条带清晰且均为单一条带，至此可以确定产物为单一产物，且产物长度在100bp至200bp间，与设计引物时预测一致。

图8B中泳道1是1000bp Maker，从上至下分别是：1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。泳道2是空白对照。泳道3是SRA1扩增产物。泳道5是SNHG15扩增产物。可以看出产物条带虽然是单一条带但不够清晰，产物长度也小于100bp，和设计引物时预测不一致。

6引物测序验证

将扩增所得的PCR产物送通用生物公司进行双向测序，公司回报FAM30A、CHCHD4P4和AWPPH测序成功且测序峰图背景干净，峰值高且单一，碱基序列与对应编码相同，说明测序结果有效。SRA1和SNHG15测序失败，在使用TA克隆延长后也无法测序成功，因此判断SRA1和SNHG15的引物无法有效扩增，遂放弃SRA1和SNHG15。

使用UCSC(http://genome.ucsc.edu/index.html)数据库对安徽通用公司测序返回的产物序列进行查询，对比的结果显示产物与基因序列一致，扩增产物特异，也证明FAM30A、CHCHD4P4和AWPPH引物设计正确，可以继续用于下一步实验。测序结果见图9-14。图9为本发明的FAM30A正向测序与UCSC查询结果图；图10为本发明的FAM30A反向测序与UCSC查询结果图；图11为本发明的CHCHD4P4正向测序与UCSC查询结果图；图12为本发明的CHCHD4P4反向测序与UCSC查询结果图；图13为本发明的AWPPH正向测序与UCSC查询结果图；图14为本发明的AWPPH反向测序与UCSC查询结果图。

7血清中表达差异对比

使用FAM30A、AWPPH和CHCHD4P4对50个肺癌患者血清和50个健康组血清进行提取扩增。将三个候选标志物PCR在肺癌病人血清内的Ct值和在正常人血清内的Ct值进行对比，看其是否有统计学差异。使用2^-ΔΔCt公式进行计算。表达水平及差异如表5所示：

表5

从表5中能够看出，FAM30A、AWPPH和CHCHD4P4在肺癌患者血浆中表达相对于健康人群表达量都是上调的，与芯片结果一致。但FAM30A和CHCHD4P4在肺癌患者和正常人血浆中表达水平差异的P>0.05，不具有统计学意义，因此放弃其作为候选标志物，选择AWPPH作为接下来的标志物。

8内参基因筛选

内参基因选择其他LncRNA研究常用的三种，分别为β-actin、GAPDH和U6。对这三个内参基因进行扩增，并绘制标准曲线。β-actin的标准曲线斜率AWPPH的标准曲线斜率最接近，选择β-actin作为本项研究的内参基因。

β-actin的扩增曲线如图15所示，测序结果如图16-17所示，因此能够明确β-actin扩增产物正确。图15为本发明的内参β-actin扩增曲线图和熔解峰图；图16为本发明的β-actin正向测序与UCSC查询结果图；图17为本发明的β-actin反向测序与UCSC查询结果图。

9扩增体系优化

选定AWPPH作为标志物，就需要针对AWPPH进行对原来的扩增体系进行优化，为后面的实验做准备，优化条件主要包括引物浓度，模板量和退火温度。

9.1引物浓度优化

对引物浓度优化即在20μl体系中分别加入0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl的引物，浓度分别为0.25μmol/ml、0.5μmol/ml、0.75μmol/ml、1μmol/ml，扩增后熔解峰见图18-21。图18为本发明的引物浓度为0.25μmol/ml时的熔解峰曲线图；图19为本发明的引物浓度为0.5μmol/ml时的熔解峰曲线图；图20为本发明的引物浓度为0.75μmol/ml时的熔解峰曲线图；图21为本发明的引物浓度为1.0μmol/ml时的熔解峰曲线图；

结果显示浓度在0.25μmol/ml时最先出现荧光信号，且扩增后熔解峰为单一峰，在72℃左右没有非特异性峰出现。可见随着引物浓度的增加，熔解峰曲线逐渐出现双峰，双峰产物中包含有引物二聚体，因此引物浓度过高不利于PCR反应的进行。最恰当引物浓度为0.25μmol/ml。

9.2 cDNA浓度优化

逆转录得到的cDNA浓度为1000ng/μl。扩增体系要求cDNA体积不得超过总体积的10％，即2μl，且总量不超过200ng，所以模板量可调节范围非常小，只能选择将模板稀释为100ng/μl，在体系中加入2μl的模板，保证模板量小于200ng。

9.3退火温度优化

退火温度优化，将温度分别设置为57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、59.5℃、60℃、60.5℃、61℃共8个温度，然后对AWPPH进行扩增。随后将扩增产物进行电泳并曝光，观察最亮的条带并找到最适合温度，电泳图见图22。图22为本发明的温度梯度电泳结果图。从左到右温度依次增加，可见条带在60℃-61℃最为明亮，但是扩增体系的酶最适合温度不大于60℃，因此最终选择60℃作为PCR的最佳退火温度。

10 RT-PCR血清大样本检测结果

利用成功构建的PCR体系检测AWPPH在肺癌组、肺良性疾病组、健康组中的表达。首先检测肺癌组、肺良性疾病组、健康组中AWPPH和β-actin的Ct值是否符合正态分布，数据符合正态分布后可以求得健康组的Ct值的算术平均值，然后分别计算每个标本的ΔΔCt值，由于2^-ΔΔCt值不符合正态分布，因此选择使用Mann-Whitney非参数检验对数据进行比较。

非正态分布的资料用中位数(25％,75％)描述，AWPPH在肺癌组血清中相对表达量为1.358(0.780，2.206)，在肺良性疾病组血中相对表达量为0.594(0.374，1.179)，在健康人组血清中相对表达量为0.960(0.466，1.428)。然后对两组之间分别进行两两比较，并进行统计学分析，见图23与各组间相对表达水平对比如表6所示。

表6

从表9中可以看出，AWPPH在肺癌患者和健康人血清中的表达量确实存在差异，且P<0.01，具有统计学意义，说明AWPPH有作为区分肺癌患者和健康人的潜力；同时在肺癌患者和肺良性疾病患者血清中表达量也有显著差异(P<0.001)，说明AWPPH有区分肺癌和肺良性疾病的潜力；而在肺良性疾病患者和健康人血清中的表达差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明其不能够作为常规的肺良性疾病检查指标。图23为本发明的AWPPH在肺癌组、肺良性组和健康组的水平对比图。

12 AWPPH表达水平与临床病理参数的关系

统计分析AWPPH的血清相对表达水平和性别、年龄、有无转移侵袭和肿瘤直径等临床病理参数有无关系，血清AWPPH表达水平和肺癌临床病理参数的关系如表7所示。

表7

肺癌患者血清AWPPH表达水平与患者的性别、年龄、有无转移和侵袭及肿瘤直径无关(P>0.05)。

有56例男性患者，AWPPH表达水平为1.335(0.814，2.789)，有99例女性患者，AWPPH表达水平为1.386(0.753，2.016)，表达水平差异无统计学意义(P＝0.491)。有57例老年患者(≥60岁)，AWPPH表达水平为1.386(0.909，2.051)，有98例年轻患者(<60岁)，AWPPH表达水平为1.348(0.740，2.364)，表达水平差异无统计学意义(P＝0.928)。有9例患者发生侵袭和转移，AWPPH表达水平为1.695(1.175，2.043)，有146例患者未发生侵袭和转移，AWPPH表达水平为1.353(0.751，2.223)，表达水平差异无统计学意义(P＝0.649)。有66例患者肿瘤直径≥1cm，AWPPH表达水平为1.289(0.817，1.861)，有99例患者肿瘤直径<1cm，AWPPH表达水平为1.358(0.753，2.364)，表达水平差异无统计学意义(P＝0.359)(另有22例患者未能查到肿瘤直径信息)。

13血清学肿瘤指标与肺癌的关联

收集肺癌组和健康组的血清肿瘤标志物数据，对其进行分析，以判断这些标志物在肺癌患者和健康人血清之间有无差异。

在对这些数据进行差异分析之前需要检测其是否符合正态分布，只有符合正态分布时才能够使用独立样本T检验，如果不符合正态分布则使用Mann-Whitney非参数检验，统计分析结果见表11。各肿瘤标志物表达差异如表8所示：

表8

仅有Cyfra21-1的数据符合正态分布，使用T检验，其他肿瘤标志物使用Mann-Whitney非参数检验。结果显示NSE和Cyfra21-1在肺癌组和健康组的血清中含量有差异，但是AFP和CEA在两组之间无差异，见图24与表9。图24为本发明的肿瘤标志物AFP在肺癌组和健康组的图。图24A.肿瘤标志物AFP在肺癌组和健康组的水平对比图；图24B为本发明的肿瘤标志物CEA在肺癌组和健康组的水平对比图；图24C为本发明的肿瘤标志物NSE在肺癌组和健康组的水平对比图；图24D为本发明的肿瘤标志物Cyfra21-1在肺癌组和健康组的水平对比图；

经典肿瘤标志物表达水平差异如表9所示：

表9

肺癌组和健康组的血清AFP表达水平分别为2.130(1.515，3.830)、2.150(1.800，3.095)，表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。肺癌组和健康组的血清CEA表达水平分别为1.610(0.920，2.485)、1.560(0.975，1.940)，表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。肺癌组和健康组的血清NSE表达水平分别为4.800(3.555，9.743)、2.385(1.895，4.993)，表达水平有差异且有统计学意义(P<0.001)。肺癌组和健康组的血清Cyfra21-1表达水平分别为6.210(2.480，12.180)、2.190(1.040，3.820)，表达水平有差异且有统计学意义(P<0.001)。

14血清LncRNA AWPPH作为肺癌标志物的价值

AWPPH在肺癌组和健康组血清中表达量有差异且有统计学意义，绘制AWPPH检测肺癌的ROC曲线图。在绘制ROC曲线之前对数据进行回归分析验证AWPPH的相对表达量与患肺癌是否有相关性，只有存在相关性才可以进行ROC曲线的绘制。经过回归分析提示AWPPH与患肺癌存在相关性，可以绘制ROC曲线。在对经典标志物进行回归分析验证后表明仅Cyfra21-1与患肺癌存在相关性，能够绘制ROC曲线。最后绘制AWPPH和经典标志物Cyfra21-1联合检测的ROC曲线，如图25-27与表13。图25为本发明的AWPPH独立检测的ROC曲线图；图26为本发明的Cyfra21-1独立检测的ROC曲线图；图27为本发明的Cyfra21-1和AWPPH联合检测肺癌时的ROC曲线图；LncRNA AWPPH、Cyfra21-1独立和联合检测的ROC曲线统计结果如表10所示：

表10

受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析结果显示，结果均有统计学意义(P<0.05)。AWPPH在诊断肺癌时的AUC为0.618(95％CI:0.531-0.705)，敏感性是45.2％，特异性78.3％。Cyfra21-1在诊断肺癌时的AUC为0.731(95％CI:0.653-0.808)，敏感性为61.3％，特异性为91.5％。AWPPH的敏感性与特异性都比Cyfra21-1差一些。

Cyfra21-1与AWPPH进行联合检测肺癌时AUC为0.748(95％CI:0.672-0.825)，敏感性是66.5％，特异性85％，提示AWPPH与Cyfra21-1联合检测用于区分肺癌患者和健康人群的诊断价值相对更大。

本发明选择的标志物来自于发明人在之前的研究中使用基因芯片对23对肺癌及癌旁组织的检测结果。一共有1017条LncRNA表达水平有差异，其中有275条在肺癌组织中表达上调，另外的742条在肺癌组织中表达下调。从中选出了20条表达差异最大的LncRNA，其中有5条LncRNA的靶标在肺癌的发生发展中起到了重要的作用，分别是LncRNA FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15，其中LncRNA FAM30A，AWPPH和CHCHD4P4是表达上调，SRA1和SNHG15则是表达下调。MiR-4507是FAM30A的靶标，研究显示miR-4507在NSCLC细胞中上调，miR-4507靶向TP53通过PI3K/AKT信号促进肺癌细胞的增殖和迁移，miR-4507可以作为NSCLC治疗的潜在靶点。BCL2L11是AWPPH的靶标，BCL2L11与肺癌不良的临床反应和预后相关，可能是接受奥西替尼治疗的EGFR T790 M NSCLC患者的阴性预测和预后生物标志物。

ANKHD1是SRA1的靶标，Liu等人在NSCLC细胞和组织中观察到ANKHD1蛋白表达显着上调，这与NSCLC患者的晚期病理肿瘤-淋巴结-转移分期、淋巴结转移和预后不良有关，ANKHD1过表达也促进了NSCLC细胞的增殖和侵袭，ANKHD1上调通过增加YAP蛋白水平以及抑制YAP蛋白磷酸化来灭活Hippo信号，而YAP的消耗消除了ANKHD1对细胞增殖和侵袭的影响，因此认为ANKHD1可能通过调节YAP依赖的Hippo信号通路在NSCLC中发挥重要作用。PURB是SNHG15的靶标，Pan等人认为木犀草素通过miR-133a-3p/PURB介导的MAPK和PI3K/Akt通路抑制NSCLC-VECs的迁移和侵袭。在血清中对引物进行验证后将扩增产物送测序，结果SRA1和SNHG15无法测序，遂进行剔除。再经过后续的测序、小样本验证和差异对比排除差异不具有统计学意义的FAM30A和CHCHD4P4，最终选择AWPPH作为研究的标志物。

LncRNA广泛参与基因表达、表观遗传调控和X染色体失活等重要生命过程，还与肿瘤发生和发展密切相关。报道称长链非编码RNA H19、HOTAIR和MALAT1在血清中稳定存在，LncRNA可能以微泡、外泌体或蛋白质复合物形式进入人体循环系统中，形成循环LncRNA稳定而广泛存在于血液、尿液等体液中，所以对体液中LncRNA进行检测是可行的。

本院患者从采血到检测结束一般都是间隔8-10h，由于患者自身的项目检测需求，所以临床收集样本收集需要待临床检测结束。预实验的结果表明，将全血标本置于4℃条件下24h后,分离出的血清中AWPPH和β-actin表达水平与新鲜血清相比下降不大。也有文献提到，血清标本可在-80℃条件下保存至少一个月，LncRNA在冻融循环处理血清样品时相对稳定，这些文献的结论与本发明的结果在一定程度上是一致的。原本计划收集部分的肺癌组织用以对比血清和肺癌组织中的AWPPH水平差异，但是由于肺癌组织本身的稀有，能够进行外科手术的患者的肿瘤组织较小，大多仅够病理诊断使用，很多晚期病人由于病情的进展，已经不具备进行外科手术的条件，只能选择进行保守治疗，最终的肺癌肿瘤标本收集计划只能作罢。

LncRNA MIR4435-2HG，全称是MIR4435-2 host gene，又名LncRNA AWPPH、AGD2、MORRBID、LINC00978、MIR4435-1HG，基因位于2号染色体，在肝癌、肺癌、结直肠癌等癌症中均有异常表达。LncRNA AWPPH可作为miRNA-204“海绵”来上调CDK6水平，从而推动NSCLC的进展。Song等人认为AWPPH可通过激活Wnt/β-catenin信号传导途径来促进NSCLC细胞的增殖、抑制凋亡。AWPPH也能够通过上调TGF-β1促进NSCLC的远处转移且不促进癌细胞的生长。而在另一项研究中，在NSCLC组织中高表达的AWPPH充当TGF-β1的“海绵”促进非小细胞肺癌细胞的迁移和增殖。AWPPH在肺癌组织中高表达，且在肺癌发生发展中发挥重要作用，这和之前利用芯片在肺癌组织中筛选的结果一致的。同时也有研究显示，AWPPH在胃癌患者血浆中高表达，在和另外三种LncRNA组合使用可用作胃癌患者的诊断或预后标志物。但是目前有关LncRNA AWPPH和肺癌的研究使用的标本均为肺癌组织，相比组织标本，血清标本有方便、微创和快捷等优点，更加适合临床诊疗，因此希望研究AWPPH在肺癌患者血清中的异常表达，找寻一种新型的肺癌血清标志物。

实时定量PCR技术简便、灵敏，被认为是特异定量候选靶基因表达的金标准。利用逆转录酶和寡聚物或随机六聚物引物从感兴趣的细胞、组织和体液中提取总RNA，并在反应中转化为cDNA。对于LncRNA转录本，必须使用随机六聚体，因为许多LncRNA转录本缺乏poly(A)尾。此外，对于与其他蛋白编码基因重叠的LncRNA基因(如反义LncRNA)，宜采用转录本特异性反义引物进行逆转录。本发明中使用的PCR染料是SYBR Green，一种DNA小沟结合染料，在与双链DNA(dsDNA)结合时发出强烈的荧光，信号与反应中出现的dsDNA数量成比例，从而有助于实时监测PCR扩增。dPCR则是将含有DNA模板的PCR体系分成数千甚至数万个子样品进行数字化，以便确定每个子样品是否发生了复制，然后进行热循环，并通过终点检测确定包含目标DNA的子样本数量，以评估目标DNA的原始拷贝数。阳性液滴至少包含一个目标DNA分子的拷贝，dPCR能够在不执行标准PCR曲线的情况下进行绝对DNA定量，后续实验可以改用dPCR进行绝对定量而不适用本发明使用的相对定量。

本发明使用的内参是β-actin，在多项LncRNA的研究中均有使用，本发明在对比了三种LncRNA研究中常用的内参后选择了标准曲线与目标基因AWPPH最接近的β-actin作为内参基因。本发明中所研究的标志物较少，仅有一个AWPPH，因此也就不需要构建一个适合多个引物的共同体系，只需要针对AWPPH这一个标志物进行优化即可。文中对包括退火温度，引物浓度，模板量在内等条件进行了优化。退火温度优化的电泳结果显示当退火温度在60℃-61℃时条带最为明亮，但由于本扩增体系中使用的酶的最适温度不应超过60℃，所以选择60℃作为退火温度。在经过引物浓度梯度优化后提示引物浓度为0.25μmol/ml时产物熔解峰单一无杂峰，说明没有产生引物二聚体，电泳图结果也显示产物为单一条带，0.25μmol/ml为最佳引物浓度。逆转录产生的cDNA浓度一般为1000ng/μl，扩增体系要求cDNA浓度不能超过100ng/μl且总体积不能超过2μl，因此加入2μl浓度为100ng/μl的cDNA，最终构建了一个能够稳定扩增且特异性较好的PCR体系。

大规模检测血清样本后得到结果，AWPPH在肺癌组血清中相对表达量为1.358(0.780，2.206)，在肺良性疾病组血中相对表达量为0.594(0.374，1.179)，在健康人组血清中相对表达量为0.960(0.466，1.428)，且肺癌组和健康组、肺癌组与肺良性疾病组的差异均有统计学意义，也为进一步绘制ROC曲线提供了可能。分析AWPPH和肺癌患者的临床病理参数有无相关性，将性别分为男女，分析显示P值为0.491，说明AWPPH和患者性别没有相关性。同样分析年龄、有无转移和侵袭及肿瘤直径得到的P值分别是0.928、0.649、0.359，也能够得出AWPPH和肺癌患者年龄、有无转移和侵袭及肿瘤直径都没有相关性。在分析肺癌组和健康组的肿瘤标志物的表达差异，NSE和Cyfra21-1在肺癌组和健康组的血清中含量有差异，但是AFP和CEA在两组之间的差异无统计学意义。

再进一步绘制这些经典肿瘤标志物和AWPPH的ROC曲线，从ROC曲线能够看出AWPPH对肺癌患者的区分效能比经典肿瘤标志物Cyfra21-1差，AUC为0.618(95％CI:0.531-0.705)，敏感性为45.2％，特异性为78.3％，说明AWPPH有能够区分肺癌患者和健康人群的潜力。Cyfra21-1在诊断肺癌时的Cyfra21-1在诊断肺癌时的AUC为0.731(95％CI:0.653-0.808)，敏感性为61.3％，特异性为91.5％。在将Cyfra21-1与AWPPH进行联合检测肺癌时AUC为0.748(95％CI:0.672-0.825)，敏感性为66.5％，特异性为85％。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明AWPPH与Cyfra21-1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种肺癌长链非编码RNA生物标志物，其特征在于：所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物为FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15。

2.根据权利要求1所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物，其特征在于：所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的正向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1、3、5、7、9所示，所述的FAM30A，AWPPH，CHCHD4P4，SRA1和SNHG15的反向引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.2、4、6、8、10所示。

3.根据权利要求1所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物，其特征在于：所述的肺癌长链非编码RNAAWPPH在肺癌组织和肺癌患者血清中表达均上调，本发明结果与芯片结果一致。

4.权利要求1所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述的诊断产品包含检测所述的一种或多种标志物的试剂，所述的试剂通过检测受试者标本中所述的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的标本是肺组织或血液。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述的一种或多种标志物浓度时所需的试剂。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

8.含有权利要求1所述的肺癌长链非编码RNA生物标志物的肺癌早期诊断试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于检测肺组织或血液中FAM30A和/或AWPPH和/或CHCHD4P4和/或SRA1和/或SNHG15。

10.权利要求1所述的肺癌上调长链非编码RNA标志物AWPPH联合血清肿瘤标志物Cyfra21-1在制备肺癌早期诊断产品中的应用。

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