CN116083579A

CN116083579A - 用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络及其应用

Info

Publication number: CN116083579A
Application number: CN202211621067.8A
Authority: CN
Inventors: 赵一锴; 孟小丹; 杨佳诺; 马欣怡; 陈振华; 何翊瑜; 李乐怡
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2023-05-09

Abstract

本发明公开了用于非小细胞肺癌诊断的circRNA‑miRNA‑mRNA调控网络及其应用，特点是为circRNA‑miRNA‑mRNA调控网络，circRNA基因为hsa_circ_0061235，miRNA基因为hsa‑miR‑3180‑5p，mRNA基因为PPM1L；circRNA‑miRNA‑mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物和试剂盒方面的应用；药物或试剂盒在肺癌早期诊断或检测中促进hsa_circ_0061235和/或PPM1L的表达，同时抑制hsa‑miR‑3180‑5p基因的表达；优点是特异性强、灵敏度高。

Description

用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络及其应用

技术领域

本发明涉及肺癌辅助诊断技术领域，尤其是涉及用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络及其应用。

背景技术

2020年全球癌症数据显示，肺癌是死亡率最高的癌症类型。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理类型，约占肺癌病例的85%。据统计，NSCLC患者的五年生存率仅为20%-30%。因为NSCLC在早期阶段往往无症状或症状不明显，患者在首次诊断时已处于晚期，失去手术机会，同时NSCLC治疗方案有限，导致患者预后差。因此，肺癌的早期筛查对提高生存率和降低肺癌死亡率至关重要。

目前，早期肺癌非侵入性筛查可以基于低剂量计算机断层扫描(computedtomography，CT)和液体活检生物标志物。其中液体活检因其微创、实时监测和易获得的优点在早期筛查、测量治疗反应和预测肺癌预后方面具有优势。临床上液体活检常见的肿瘤标志物除了癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment， CYFRA21-1)外，还包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、微小RNA(microRNAs，miRNAs)、长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)、环状RNA(circular RNAs，circRNAs)和外泌体(exosomes)。在过去的二十年，大量文献表明循环miRNAs、lncRNAs和circRNAs在非小细胞肺癌的早期发现，治疗阶段和预后检测中具有广阔的潜力。

大量的研究表明，非编码RNA(如miRNAs、lncRNAs和circRNAs)作为液体活检的非侵袭性生物标志物，在癌症发生发展中起重要作用，而竞争性内源RNA(competingendogenous RNA，ceRNA)作为一种全新的基因表达调控模式，较其他调控网络更为精细和复杂，涉及的RNA分子更丰富，在多种疾病尤其是癌症中起重要作用。最近的研究证实基于ceRNA机制的circRNA-miRNA-mRNA信号级联参与了肿瘤的发生和发展。因此circRNA-miRNA-mRNA调控网络被认为具有作为一种新的肿瘤生物标志物的潜力，其与单纯的circRNA或miRNA相比，具有更高的敏感性和特异性。近期研究表明，circRNAs通过 miRNA应答元件(microRNA response elements，MREs)与靶miRNA结合使miRNAs对其靶肿瘤相关基因的去抑制，在NSCLC的发生和发展中发挥重要作用。例如，据报道，在NSCLC组织中，circ-CPA4通过海绵化吸附let-7 miRNA上调程序性细胞死亡配体-1(programmed cell deathligand-1，PD-L1)的表达。此调控网络在肿瘤微环境中使CD8⁺T细胞失活，影响肺癌细胞的生长，干细胞特性以及耐药性。由此可见，circ-CPA4-let-7 miRNA-PD-L1调控网络在肺癌中起重要作用。

因此，考虑到circRNA-miRNA-mRNA信号级联对NSCLC的重要作用，我们认为circRNA-miRNA-mRNA调控轴反映了一个更全面的基因调控网络，可能对NSCLC早期诊断具有更高的敏感性和特异性。目前，国内外鲜有关于ceRNA网络分析与非小细胞肺癌相关的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络及其应用，其中hsa-miR-3180-5p表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关，hsa_circ_0061235和PPM1L表达量与非小细胞肺癌患病风险呈正相关。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，所述的circRNA-miRNA-mRNA调控网络中circRNA基因为hsa_circ_0061235， miRNA基因为hsa-miR-3180-5p，mRNA基因为蛋白磷酸酶Mg²⁺/Mn²⁺依赖性1L(Protein phosphatase Mg²⁺/Mn²⁺ dependent1L，PPM1L)。

2、上述用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物方面的应用。

进一步，所述的药物在肺癌早期诊断或检测中促进hsa_circ_0061235和/或PPM1L的表达，同时抑制hsa-miR-3180-5p基因的表达。

3、上述用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒方面的应用。

进一步，所述的试剂盒包括

hsa_circ_0061235荧光定量PCR特异性上游引物：5’- TGTTCACGCTAGCCAACCTA -3’；

hsa_circ_0061235荧光定量PCR特异性下游引物：5’- TCATCATTCACAGCTTCCCG -3’；

hsa-miR-3180-5p特异性逆转录茎环引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGACGTGG -3’；

hsa-miR-3180-5p荧光定量PCR特异性上游引物：5’- TCGGCAGGCTTCCAGACGCTCC -3’；

PPM1L荧光定量PCR特异性上游引物：5’- GATAGGAAGAATTCATGCAGGTGGA -3’；

PPM1L荧光定量PCR特异性下游引物：5’- TCAGCTGCAGTTGTTGAAAAAG -3’。

进一步，所述的hsa-miR-3180-5p基因表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关，所述的hsa_circ_0061235和PPM1L基因表达量与肺癌患病风险呈正相关。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，该调控网络由一个circRNA(hsa_circ_0061235)，一个miRNA(hsa-miR-3180-5p)和一个mRNA(PPM1L)组成，hsa_circ_0061235和PPM1L在非小细胞肺癌患者血清中高表达，hsa-miR-3180-5p在非小细胞肺癌患者血清中低表达。其机理可能是hsa_circ_0061235作为hsa-miR-3180-5p的分子海绵，与hsa-miR-3180-5p特异性结合进而调节hsa-miR-3180-5p下游靶基因PPM1L的表达，从而影响非小细胞肺癌进展。因此，特异性的circRNA-miRNA-mRNA网络，结合hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p和PPM1L可以方便快捷地在分子水平上实现对非小细胞肺癌的检测，检测效率高，特异性强，circRNA、miRNA和mRNA的组合对诊断NSCLC具有更高的敏感性和特异性是非小细胞肺癌辅助诊断、检测和筛选的一种创新用途。

附图说明

图 1为通过Small RNA深度测序筛选出非小细胞肺癌患者中前5种表达上调的miRNAs；

图 2为利用Cytoscape软件构建circRNA-miRNA-mRNA网络；

图 3为通过ROC分析评估血清hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p和PPM1L不同组合对区分健康人与非小细胞肺癌的诊断能力；

图 4为通过ROC分析评估血清hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p和PPM1L不同组合对区分肺良性肿瘤与非小细胞肺癌的诊断能力；

图 5为通过ROC分析评估传统肿瘤标志物(CEA、NSE 和 CYFRA21-1)对区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌的诊断能力；

图 6为通过ROC分析评估hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p及其组合对区分非小细胞肺癌有无淋巴结转移的诊断能力；

图 7为通过ROC分析评估hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p及其组合对区分非小细胞肺癌有无远处转移的诊断能力；

图 8为通过ROC分析评估hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p和PPM1L对区分I-II和III-IV分期的诊断能力；

图 9为通过ROC分析评估hsa_circ_0061235、hsa-miR-3180-5p和PPM1L所有组合对区分I-II和III-IV分期的诊断能力；

图 10为通过ROC分析评估传统肿瘤标志物(CEA、NSE 和 CYFRA21-1)对区分I-II和III-IV分期的诊断能力。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

随机抽取宁波大学医学院附属医院、宁波大学附属李惠利医院临床实验室手术或治疗前NSCLC (n=200)、肺良性肿瘤(n=30)、肺炎(n=50)患者血清和无肿瘤病史的健康人血清样本(n=50)。本研究中，每位受试者均填写知情同意书，要求将其血液用于研究，所有采血均经宁波大学医学院临床研究伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》原则。所有参与研究的患者的临床特征(年龄、性别、是否吸烟、组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小等)见表1。

表1 本研究中的血清样本和相应的临床参数

。

2、circRNA-miRNA-mRNA网络构建

为了筛选NSCLC相关的miRNAs，我们使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)从4名健康个体和4名NSCLC患者的血清样本中分离出总RNA(浓度≥200ng/μL，总量≥10μg，OD260/280介于1.8-2.2之间)。随后，8个分离的RNA样本在小RNA深度测序平台(NovaSeq，Shanghai， China)上进行测序。通过高通量测序得到原始测序序列，称之为原始测序数据(RawReads)，去除含有5’引物和poly (A)尾的数据(reads)，没有3’接头和标签序列的数据、长度小于15 nt或大于41 nt的数据，进一步对低质量的数据进行过滤，得到过滤后的测序数据(clean reads)。随后，根据过滤后的测序数据在参考基因组中的长度分布，用Bowtie软件将序列与 Rfam v10.1数据库(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam)进行比对，注释出rRNA、scRNA、Cis-reg、snRNA、tRNA 等序列并做过滤处理，再依次和cDNA 序列、物种重复序列库Repbase 数据库、miRBase 数据库(http://www.mirbase.org/) 进行比对注释，去除降解的转录本序列和重复序列，并实现对已知miRNA的鉴定和注释，同时对不同样品中已知的miRNA表达模式进行分析。

计算差异表达的miRNAs时，以P值< 0.05和差异倍数＞2为阈值进行过滤筛选，分析健康和NSCLC亚群之间差异表达的miRNAs。如图 1所示，我们通过小RNA深度测序筛选出NSCLC中显著上调的前5个血清miRNAs (根据P值最小，差异倍数最大原则)。然后我们通过circbank(http://www.circbank.cn/)预测这5个血清miRNAs(miR-196a-3p、miR-3180-5p、miR-592、miR-203a-3p和miR-551b-5p)相互作用的circRNA。接着我们以上述5个NSCLC相关miRNA为目标节点，其对应的目标circRNA为源节点，通过CytoScape v3.9.1构建circRNA-miRNA网络。如图 2所示，我们发现最适目标circRNA为hsa_circ_0061235，在5个上调的miRNA中，具有hsa_circ_0061235结合位点的miRNA有3个：hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-3180-5p、hsa-miR-196a-3p。随后，我们通过miRDB这一个生物信息学数据库搜索了可能与上述miRNAs相互作用的靶mRNAs，并确定三种miRNA共同的靶mRNAs。通过交叉分析图发现16种靶mRNAs(ELAVL4、NUFIP2、ZNF704、BACH2、RAD18、SH3TC2、SLC1A2、CREB1、FAM78B、MEF2C、RNF38、CAMK4、SCML4、PPM1L、CACNA2D1、LPP)。

3、引物设计

circRNA引物的设计:我们首先通过circBase (http://circbase.org/)获得circRNA 5'-3'序列和circRNA ID。为了放大circRNA的环状结构而不是线性结构，我们将circRNA序列进行了如下转换:将3’端150bp的序列切掉，放在5’端前面，形成一个新的序列，新序列的连接处就是剪接位点。然后将新序列导入Primer Premier5.0软件，在限制条件下(引物长度15-30nt， G+C含量40-60%，qRT-PCR扩增产物约100bp)挑选特异性引物。外显子环化circRNA的引物设计在剪接位点，内含子环化circRNA的引物设计在剪接位点或内含子区域周围。然后，利用NCBI和circPrimer中的BLAST引物工具检测设计引物的特异性。同时进行circRNA扩增后的熔解曲线，琼脂糖凝胶电泳，和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circRNA产物的特异性。

circRNA荧光定量PCR特异性引物序列如下：

mRNA引物的设计：我们首先通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得mRNA 5'-3'序列。将获得的序列导入NCBI的引物设计界面，在限制条件下(引物长度15-30nt， G+C含量40-60%，qRT-PCR扩增产物100—200bp) 挑选特异性引物。

mRNA荧光定量PCR特异性引物序列如下：

PPM1L荧光定量PCR特异性上游引物：5’- GATAGGAAGAATTCATGCAGGTGGA -3’

PPM1L荧光定量PCR特异性下游引物：5’- TCAGCTGCAGTTGTTGAAAAAG -3’

miRNA引物的设计:采用qRT-PCR技术对成熟miRNA进行定量，需要逆转录茎环引物(RT)和qRT-PCR引物。该miRNA RT引物由一个长度为36bp的规则的5'端茎环结构(5'-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttag-3')和一个3'端miRNA特异性序列组成。3'端特异性miRNA序列是通过与成熟miRNA 3'端6-8个碱基反向互补获得的。qRT-PCR正向引物由一个通用的5'端序列(5'-GCCGAG-3'或5'-TCGGCAGG-3')和一个3'端miRNA特异性序列组成，该序列在成熟miRNA的5'端有13-16个碱基。qRT-PCR反向引物为通用引物(5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3')。所有引物均由华大基因(Beijing Genomics institute，China)合成。

miRNA特异性引物序列如下：

hsa-miR-203a-3p特异性逆转录茎环引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTAGTGG-3’；

hsa-miR-203a-3p荧光定量PCR特异性上游引物：5’-GCCGAGGTGAAATGTTTAGG-3’；

hsa-miR-3180-5p特异性逆转录茎环引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGACGTGG-3’；

hsa-miR-3180-5p荧光定量PCR特异性上游引物：5’-TCGGCAGGCTTCCAGACGCTCC-3’

hsa-miR-196a-3p特异性逆转录茎环引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTCAGGCA-3’；

hsa-miR-196a-3p荧光定量PCR特异性上游引物：5’-GCCGAGCGGCAACAAGAAAC-3’；

上述miRNA下游引物均为通用引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

4、RNA提取和cDNA合成

为了从血清中提取总RNA，取400µL无细胞碎片的血清到无酶EP管中，然后加入1.2mL Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)。接下来，添加240μL的氯仿(ChemMall，中国)到混合物中，4℃静置5分钟。经12000×g离心15分钟后，将上层清液转移到一个新的无酶EP管，并和600µL的异丙醇(ChemMall，中国)在4℃孵育10分钟，12，000×g，4℃离心10min。然后用1.2 mL 75%乙醇在4℃下洗涤两次，最后用50µL无核酸酶水溶解，-80℃保存备用。RNA浓度在NanoDrop分光光度计上测量(NanoDrop™One， Thermo FisherScientific，美国)。cDNA的合成用血清RNA溶液4µL。按照制造商的建议，使用ReverTra AceqPCR RT Master Mix和gDNA去除剂(TOYOBO，日本)，在前面描述的Life Touch TC-96/G/H(b) b (Bioer，中国)PCR设备上合成cDNA。

5、qRT-PCR

本研究中选择的miRNA、circRNA和mRNA通过qRT-PCR进行定量。10μL qRT-PCR体系包括5μL SYBR缓冲液(Yeasen Biotech，中国)、3μL无核酸酶水、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物和1 μL cDNA溶液。PCR的运行程序如下：95℃热启动10分钟，然后进行40个循环，95℃15 s， 60℃ 30 s， 72℃ 30 s，最后在Mastercycler梯度(Vaudaux-Eppendorf，德国)4℃保持。每个反应在三个重复中进行。利用熔解曲线评价qRT-PCR产物的特异性。选择GAPDH和U6作为内参基因，分别对mRNA、circRNA和miRNA数据进行规范化处理。mRNA、circRNA和miRNA的相对水平用ΔCq方法计算如下:ΔCq =平均Cq(内参) -平均Cq(目标mRNA、circRNA和miRNA)，相对mRNA 、circRNA和miRNA的水平对应的值为2^(ΔCq)。

6、统计分析

统计分析采用SPSS 22.0软件包(SPSS Inc.，芝加哥，美国)和GraphPad Prism8.0 (GraphPad Software，美国)。将circRNA、mRNA和miRNA的相对水平转化为正态分布后，采用ANOVA和Tukey’s HSD检验分析健康组、肺炎组、良性肺肿瘤组和非小细胞肺癌组circRNA、mRNA和miRNA水平的统计学差异。为了比较两个亚组(LUSC和LUAC，N0和N1-3， M0和M1， I-II期和III-IV期，以及肿瘤大小<5cm和≥5cm)之间的circRNA、miRNA、mRNA和传统肿瘤标志物的水平，我们使用了非参数Mann-Whitney U检验。通过受试者工作特征(ROC)曲线检测circRNA、miRNA、mRNA和传统肿瘤标志物的诊断能力，并计算曲线下面积(AUC)。选择Logistic回归模型组合miRNAs或环状RNA，并获得组合的概率。P<0.05为有统计学意义。

7、研究结果

我们在随机选取的20例健康人和20例NSCLC患者血清中检测了上述 3 个miRNAs、1个circRNA 及16个靶mRNAs 的表达水平。基于肺癌细胞系中miRNA的显著下调和circRNA、mRNA的反向上调，选择了hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PMM1L进行进一步研究。

为了研究上述选定的 circRNA-miRNA-mRNA 网络在 NSCLC 中的诊断潜力，我们量化了健康人、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌这四个样本组中血清hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PMM1L的表达水平。然后，比较不同队列间hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PMM1L的表达水平。通过Mann-Whitney U检验进行与临床病理学特征(组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移和远处转移)的相关性分析。同时，进行 ROC 分析以评估miRNA、circRNA 以及传统肺肿瘤标志物(CEA、NSE 和 CYFRA21-1)的多种组合的敏感性和特异性。

结果显示对于区分健康人和非小细胞肺癌，不同组合的hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PMM1L中，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235，hsa_circ_0061235+PMM1L，hsa-miR-4482-3p+PMM1L，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235+PMM1L的AUC面积分别为0.907，0.939，0.963和0.968(图 3)。对于区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌，不同组合的hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PMM1L中，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235，hsa_circ_0061235+PMM1L，hsa-miR-4482-3p+PMM1L，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235+PMM1L的AUC面积分别为0.846，0.907，0.852和0.919(图 4)。而传统肿瘤标志物(CEA、NSE和 CYFRA21-1)对区分良性肺肿瘤和 NSCLC的 AUC 值分别为 0.708、0.621和0.663(图5)。对区分非小细胞肺癌有无淋巴结转移，单独或联合hsa_circ_0061235，hsa-miR-3180-5p的基因表达水平的AUC面积分别为0.696、0.759、0.791(图 6)。对区分非小细胞肺癌有无远处转移，单独或联合hsa_circ_0061235，hsa-miR-3180-5p的基因表达水平的AUC面积分别为0.622、0.681、0.695(图 7)。对区分I-II和III-IV分期，单独hsa_circ_0061235，hsa-miR-3180-5p，PPM1L的基因表达水平的AUC面积分别为0.752、0.830、0.612.(图 8)。而多种组合中，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235，hsa_circ_0061235+PMM1L，hsa-miR-4482-3p+PMM1L，hsa-miR-3180-5p+hsa_circ_0061235+PMM1L的AUC面积分别为0.866、0.785、0.865、0.891(图 9)。相比，传统肿瘤标志物(CEA、NSE 和 CYFRA21-1)对区分I-II和III-IV分期的 AUC 值仅为 0.519、0.516和0.455(图 10)。

因此，我们得到了结论是 circRNA-miRNA-mRNA的组合达到了最高的 AUC 值(0.968)。与其他组合相比，表明我们选择的 circRNA-miRNA-mRNA 网络在区分良性和恶性肺肿瘤方面具有最高的敏感性和特异性。同时circRNA-miRNA-mRNA 网络在区分不同恶性程度的NSCLC中也具有较高的敏感性和特异性。

综上所述，本研究基于血清miRNA测序构建了一个循环NSCLC相关的circRNA-miRNA-mRNA网络(hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PPM1L)。通过qRT-PCR定量circRNA、mRNA和miRNA，比较了四个研究队列(健康、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌)血清中选定的circRNA-miRNA-mRNA网络的相对水平。我们发现hsa-miR-3180-5p、hsa_circ_0061235和PPM1L在非小细胞肺癌患者血清中表达异常，具有区分肺良恶性肿瘤的能力。3种RNA的整体组合其AUC值比其他组合和传统的肿瘤标记物更高。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，其特征在于：所述的circRNA-miRNA-mRNA调控网络中circRNA基因为 hsa_circ_0061235，miRNA基因为hsa-miR-3180-5p，mRNA基因为PPM1L。

2.一种权利要求1所述的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物方面的应用。

3.根据权利要求2所述的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物方面的应用，其特征在于：所述的药物在肺癌早期诊断或检测中促进了hsa_circ_0061235和/或PPM1L基因的表达，同时抑制了hsa-miR-3180-5p基因的表达。

4.一种权利要求1所述的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒方面的应用。

5.根据权利要求4所述的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒方面的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括

hsa-miR-3180-5p特异性逆转录茎环引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGACGTGG -3’

6.根据权利要求5所述的用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒方面的应用，其特征在于：所述的hsa-miR-3180-5p基因表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关，所述的hsa_circ_0061235和/或PPM1L基因表达量与肺癌患病风险呈正相关。