CN115125304B - 一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用,特点是为circRNA‑miRNA调控网络,circRNA基因为hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317,miRNA基因为hsa‑miR‑4482‑3P和/或hsa‑miR‑146a‑3p;ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物和试剂盒方面的应用;药物或试剂盒在肺癌早期诊断或检测中促进hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317的表达,同时抑制hsa‑miR‑4482‑3p和/或hsa‑miR‑146a‑3p基因的表达;优点是特异性强、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌辅助诊断技术领域,尤其是涉及一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用。
背景技术
众所周知,肺癌是世界范围内癌症死亡的主要原因,5年生存时间只有20%-30%。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常见的组织学亚型(约占85%),其中肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cellcarcinoma, LUSC)是两种主要亚型。肺癌的高致死率和低生存率是由于大多数肺癌患者被诊断为晚期,从而失去了手术机会。因此,肺癌的早期筛查对提高生存率和降低肺癌死亡率至关重要。
事实上,除了传统的肿瘤标志物,如癌胚抗原(CEA)、CA125、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)等,肺癌的非侵入性早期筛查主要基于低剂量CT和液体活检生物标志物,包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、 微小RNA(microRNAs),长链非编码RNA(lncRNAs),环状RNA(circRNAs)和外泌体(exosomes)。在过去的二十年中,大量的文献表明循环miRNAs、lncRNAs和circRNAs在非小细胞肺癌的早期发现、治疗管理和预后预测中具有广阔的潜力。
大量的研究表明,非编码RNA(如miRNAs、lncRNAs和circRNAs)作为液体活检的非侵袭性生物标志物,在癌症的诊断和预后价值中发挥着重要作用。特别是在癌症中,ceRNA模式极大地扩展了人类生理和病理条件下的基因调控网络。最近,circRNA-miRNA-mRNA信号级联已被证实参与了肿瘤的发生和发展,因此被认为具有作为一种新的肿瘤生物标志物的潜力,其与单纯的circRNA或miRNA相比,具有更高的敏感性和特异性。有重要研究表明,circRNAs通过与MREs结合在NSCLC的发生和发展中发挥重要作用,导致miRNAs对其靶肿瘤相关基因的去抑制。例如,据报道,在NSCLC组织中,高表达的circ-CPA4作为let-7 miRNA海绵,从而上调程序性细胞死亡配体-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1),从而促进细胞生长、迁移和上皮-间充质转化。Zhu和同事在体外和体内鉴定了一种新型circRNAhsa_circRNA_103809,该RNA可以通过解除miR-377-3p对天冬氨酸转氨基酶1的抑制来增加NSCLC细胞的顺铂耐药。因此,考虑到circRNA-miRNA-mRNA信号级联对NSCLC的重要贡献,我们认为circRNA-miRNA调控轴可能反映一个更全面的调控网络,从而对NSCLC有更高的敏感性和特异性。目前,国内外鲜有关于ceRNA网络分析与非小细胞肺癌相关的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高的用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用,其中hsa-miR-4482-3p和hsa-miR-146a-3p表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关,hsa_circ_0008167和hsa_circ_0003317表达量与非小细胞肺癌患病风险呈正相关。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
1、一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络,所述的ceRNA调控网络为circRNA-miRNA调控网络,所述的circRNA基因为 hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317,所述的miRNA基因为hsa-miR-4482-3P和/或hsa-miR-146a-3p。
2、上述用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测药物方面的应用。
进一步,所述的药物在肺癌早期诊断或检测中促进hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317的表达,同时抑制hsa-miR-4482-3p和/或hsa-miR-146a-3p基因的表达。
3、上述用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒方面的应用。
进一步,所述的试剂盒包括
hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性上游引物:5’-CATCTTGAGGGAAACAGCAAATG-3’;
hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性下游引物:5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’;
hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性上游引物:5’-CCCGGAGTTCTTGTATGTGG-3’;
hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性下游引物:5’-CCGTAGCTTGGTAATTCTGACA-3’;
hsa-miR-4482-3p特异性逆转录茎环引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGAGCCCC -3’;
hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性上游引物:5’-TCGGCAGGTTTCTATTTCTCAG-3’;
hsa-miR-146a-3p特异性逆转录茎环引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGAAGA-3’;
hsa-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性上游引物:5’-TCGGCAGGCCTCTGAAATTC-3’。
进一步,所述的hsa-miR-4482-3p和/或hsa-miR-146a-3p基因表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关,所述的hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317基因表达量与肺癌患病风险呈正相关。
与现有肿瘤标志物相比,本发明的优点在于首次公开了用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用,该调控网络由两个circRNA(hsa_circ_0008167,hsa_circ_0003317)和两个miRNA(hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p)组成,hsa_circ_0008167和hsa_circ_0003317在非小细胞肺癌患者血清中高表达,hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p在非小细胞肺癌患者血清中低表达。其机理可能是hsa_circ_0008167和hsa_circ_0003317海绵化hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p,从而调节去下游靶基因表达来影响非小细胞肺癌进展。因此,特异性的circRNA-miRNA网络,结合hsa_circ_0008167、hsa_circ_0003317、hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p可以方便快捷地在分子水平上实现对非小细胞肺癌的检测,检测效率高,针对性强,4种非编码RNA的组合对诊断NSCLC具有更高的敏感性和特异性是非小细胞肺癌辅助诊断、检测和筛选的一种创新用途。
附图说明
图1为利用Cytoscape软件构建circRNA-miRNA网络;
图2为采用ROC分析评价血清hsa_circ_0008167、hsa_circ_0003317及其组合对区分肺良性肿瘤与非小细胞肺癌的诊断能力;
图3为通过ROC分析评估血清hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-146a-3p及其组合对区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌的诊断能力;
图4为通过ROC分析评估传统肿瘤标志物(CEA、CA125、NSE 和 CYFRA21-1)对区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌的诊断能力;
图5为不同miRNAs和circRNAs组合对区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌的诊断能力;
图6为1个circRNA与2个miRNAs组合或2个circRNA与1个miRNAs组合对区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌的诊断能力。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、研究对象的收集
随机抽取郑州大学附属第一医院临床实验室手术或治疗前NSCLC (n=160)、肺良性肿瘤(n=30)、肺炎(n=50)患者血清。从宁波大学医学院附属宁波市康宁医院取52份无肿瘤病史的健康人血清样本。本研究中,每位受试者均填写知情同意书,要求将其血液用于研究,所有采血均经宁波大学医学院临床研究伦理委员会批准,符合《赫尔辛基宣言》原则。所有参与研究的患者的临床特征(年龄、性别、是否吸烟、组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小等)见表1。
表1 本研究中的血清样本和相应的临床参数
2、细胞培养
人正常支气管上皮细胞株(Beas-2B)和人NSCLC细胞株(SPC-A-1、LTEP-a-2、A549和NCI-H1299)购自细胞库/干细胞库(中国上海)。Beas-2B细胞和NSCLC细胞分别在DMEM(Corning,美国)和RPMI-1640(康宁,美国)中培养,添加10%胎牛血清(PAN,德国)和100 U/ml青霉素/链霉素(New Cell & Molecular Biotech,中国),在37℃下5% CO2的培养箱中培养。所有细胞系均未受支原体污染。
3、ceRNA网络构建
为了筛选NSCLC相关的miRNAs,我们使用Trizol试剂(Invitrogen,美国)从4名健康个体和4名NSCLC患者的血清样本中分离出总RNA。随后,8个分离的RNA样本在小RNA深度测序平台(OE Biotech, Shanghai, China)上进行测序。通过高通量测序得到原始测序序列,称之为原始测序数据(RawReads),去除含有5’引物和poly (A)尾的数据(reads),没有3’接头和标签序列的数据、长度小于15 nt或大于41 nt的数据,进一步对低质量的数据进行过滤,得到过滤后的测序数据(clean reads)。随后,根据过滤后的测序数据在参考基因组中的长度分布,用Bowtie软件将序列与 Rfam v10.1数据库(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam)进行比对,注释出rRNA、scRNA、Cis-reg、snRNA、tRNA 等序列并做过滤处理,再依次和cDNA 序列、物种重复序列库Repbase 数据库、miRBase 数据库(http://www.mirbase.org/) 进行比对注释,去除降解的转录本序列和重复序列,并实现对已知miRNA的鉴定和注释,同时对不同样品中已知的miRNA表达模式进行分析。
计算差异表达的miRNAs时,以P值< 0.05和Fold change(差异倍数)值>2为阈值进行过滤筛选。从而选择健康和NSCLC亚群之间差异表达的miRNAs。通过小RNA深度测序,筛选出NSCLC中显著下调的前5个血清miRNAs (P值最小,Fold Change最大原则)。然后通过miRbase、miRanda、starBase和RNAhybrid四个生物信息学数据库搜索了可能与miRNA相互作用的circRNA。基于Max Score>170和Max Energy<-27进一步选择潜在的circRNA。随后,我们以上述5个NSCLC相关miRNA为目标节点,其对应的目标circRNA为源节点,通过Cytoscape_v3.9.1构建circRNA-miRNA网络。如图1所示,我们发现在5个下调的miRNA中,4个miRNA具有6个候选circRNA的结合位点hsa_circ_0008167、hsa_circ_0009129、hsa_circ_0003317、hsa_circ_0006821、hsa_circ_0003603和hsa_circ_0005283。
4、引物设计
circRNA引物的设计:我们首先通过circBase (http://circbase.org/)获得circRNA 5'-3'序列和circRNA ID。为了放大circRNA的环状结构而不是线性结构,我们将circRNA序列进行了如下转换:将3’端150bp的序列切掉,放在5’端前面,形成一个新的序列,新序列的连接处就是剪接位点。然后将新序列导入Primer Premier5.0软件,在限制条件下(引物长度15-30nt, G+C含量40-60%,qRT-PCR扩增产物约100bp)挑选特异性引物。外显子环化circRNA的引物设计在剪接位点,内含子环化circRNA的引物设计在剪接位点或内含子区域周围。然后,利用NCBI和circPrimer中的BLAST引物工具检测设计引物的特异性。同时进行circRNA扩增后的熔解曲线,琼脂糖凝胶电泳,和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circRNA产物的特异性。
circRNA荧光定量PCR特异性引物序列如下:
hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性上游引物:5’-CATCTTGAGGGAAACAGCAAATG-3’;
hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性下游引物:5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’;
hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性上游引物:5’-CCCGGAGTTCTTGTATGTGG-3’;
hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性下游引物:5’-CCGTAGCTTGGTAATTCTGACA-3’;
hsa_circ_0009129荧光定量PCR特异性上游引物:5’-GACCATTTCCAGGACTTGTGA-3’;
hsa_circ_0009129荧光定量PCR特异性下游引物:5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’;
hsa_circ_0006821荧光定量PCR特异性上游引物:5’-GTTATTTCCTACTTGCCTCCTGG-3’;
hsa_circ_0006821荧光定量PCR特异性下游引物:5’-TCTCTTCCACTTGCTTCCGT-3’;
hsa_circ_0003603荧光定量PCR特异性上游引物:5’-GTTTTCCAGTGGTAAGGGCC-3’;
hsa_circ_0003603荧光定量PCR特异性下游引物:5’-ATTTAGCTTTATCACAGGCAGC-3’;
hsa_circ_0005283荧光定量PCR特异性上游引物:5’-GAATCACTGCAAACAAGAGTACT-3’;
hsa_circ_0005283荧光定量PCR特异性下游引物:5’-GCCTGTCACCTCTAGCTTGA-3’。
miRNA引物的设计:采用qRT-PCR技术对成熟miRNA进行定量,需要逆转录茎环引物(RT)和qRT-PCR引物。该miRNA RT引物由一个长度为36bp的规则的5'端茎环结构(5'-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttag-3')和一个3'端miRNA特异性序列组成。3'端特异性miRNA序列是通过与成熟miRNA 3'端6-8个碱基反向互补获得的。qRT-PCR正向引物由一个通用的5'端序列(5'-GCCGAG-3'或5'-TCGGCAGG-3')和一个3'端miRNA特异性序列组成,该序列在成熟miRNA的5'端有13-16个碱基。qRT-PCR反向引物为通用引物(5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3')。所有引物均由华大基因(Beijing Genomics institute,China)合成。
miRNA特异性引物序列如下:hsa-miR-4482-3p特异性逆转录茎环引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGAGCCCC -3’;
hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性上游引物:5’-TCGGCAGGTTTCTATTTCTCAG-3’;
hsa-miR-146a-3p特异性逆转录茎环引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGAAGA-3’;
hsa-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性上游引物:5’-TCGGCAGGCCTCTGAAATTC-3’
hsa-miR-7973特异性逆转录茎环引物:5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGTAATTA -3’;
hsa-miR-7973荧光定量PCR特异性上游引物:5’- GCCGAGTGTGACCCTAGAA-3’
hsa-miR-505-3p特异性逆转录茎环引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCGAAAC-3’;
hsa-miR-505-3p荧光定量PCR特异性上游引物:5’- GCCGAGCGTCAACACTTG-3’;
上述miRNA下游引物均为通用引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。
5、RNA提取和cDNA合成
为了从血清或细胞中提取总RNA,我们将1.2mL Trizol试剂(Thermo FisherScientific,美国)加入400µL无细胞碎片的血清或贴附细胞的六孔板中,并收集到无酶EP管中。接下来,添加240μL的氯仿(ChemMall,中国)到混合物中,4℃静置5分钟。经12000×g离心15分钟后,在4℃环境,将上层清液转移到一个新的EP管,和孵化600µL的异丙醇在4℃(ChemMall,中国)10分钟,12,000×g,4℃离心10min。然后用1.2 mL 75%乙醇在4℃下洗涤两次,最后用50µL无核酸酶水溶解,-80℃保存备用。RNA浓度在NanoDrop分光光度计上测量(NanoDrop™One, Thermo Fisher Scientific,美国)。cDNA的合成用细胞RNA 200 ng或血清RNA溶液4µL。按照制造商的建议,使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和gDNA去除剂(TOYOBO,日本),在前面描述的Life Touch TC-96/G/H(b) b (Bioer,中国)PCR设备上合成cDNA。
6、qRT-PCR
本研究中选择的miRNA和circRNA通过qRT-PCR进行定量。10μL qRT-PCR体系包括5μL SYBR缓冲液(Yeasen Biotech,中国)、3μL无核酸酶水、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物和1 μL cDNA溶液。PCR的运行程序如下:95℃热启动10分钟,然后进行40个循环,95℃ 15s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s,最后在Mastercycler梯度(Vaudaux-Eppendorf,德国)4℃保持。每个反应在三个重复中进行。利用熔解曲线评价qRT-PCR产物的特异性。选择U6和GAPDH作为内参基因,分别对miRNA和circRNA数据进行规范化处理。circRNA或miRNA的相对水平用ΔCq方法计算如下:ΔCq =平均Cq(内参GAPDH/U6) -平均Cq(感兴趣的circRNA/miRNA),相对circRNA或miRNA的水平对应的值为2^(ΔCq)。
7、统计分析
统计分析采用SPSS 22.0软件包(SPSS Inc.,芝加哥,美国)和GraphPad Prism8.0 (GraphPad Software,美国)。将circRNA和miRNA的相对水平转化为正态分布后,采用ANOVA和Tukey’s HSD检验分析健康组、肺炎组、良性肺肿瘤组和非小细胞肺癌组circRNA或miRNA水平的统计学差异。为了比较两个亚组(LUSC和LUAC,N0和N1-3, M0和M1, I-II期和III-IV期,以及肿瘤大小<5cm和≥5cm)之间的circRNAs、miRNAs和传统肿瘤标志物的水平,我们使用了非参数Mann-Whitney U检验。通过受试者工作特征(ROC)曲线检测circRNAs、miRNAs和传统肿瘤标志物的诊断能力,并计算曲线下面积(AUC)。选择Logistic回归模型组合miRNAs或环状RNA,并获得组合的概率。P<0.05为有统计学意义,P值均为双侧。
8、研究结果
我们在1个正常肺支气管上皮细胞系和 4 个肺腺癌细胞系中检测了上述 4 个miRNA 及其6个竞争性circRNA 的表达水平。基于肺癌细胞系中miRNA的显着下调和circRNA的反向上调,我们选择了hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-146a-3p、hsa_circ_0008167和hsa_circ_0003317进行进一步研究。
为了研究上述选定的 circRNA-miRNA 网络在 NSCLC 中的诊断潜力,我们量化了健康人、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌这四个样本组中血清 hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-146a-3p、hsa_circ_0008167 和 hsa_circ_0003317 的表达水平。然后,比较不同队列间hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-146a-3p、hsa_circ_0008167和hsa_circ_0003317的表达水平。通过Mann-Whitney U检验进行与临床病理学特征(组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移和远处转移)的相关性分析。同时,进行 ROC 分析以评估 miRNA、circRNA 以及传统肺肿瘤标志物(CEA、CA125、NSE 和 CYFRA21-1)的多种组合的敏感性和特异性。
结果显示对于区分肺良性肿瘤和非小细胞肺癌,单独或联合hsa_circ_0008167,hsa_circ_0003317的基因表达水平的AUC面积分别为0.811,0.659和0.847,如图 2所示。单独或联合hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-146a-3p表达水平的AUC面积分别为0.899,0.908和0.926,如图 3所示。而传统肿瘤标志物(CEA、CA125、NSE 和 CYFRA21-1)对区分良性肺肿瘤和 NSCLC的 AUC 值分别为 0.767、0.709、0.649 和 0.742,如图 4所示。对于所选miRNA和circRNA的多种组合的ROC分析,我们发现2个miRNA和2个circRNA组合的AUC值为0.964,hsa_circ_0008167+hsa-miR-4482-3p,hsa_circ_0008167+hsa-miR-146a-3p,hsa_circ_0003317+hsa-miR-146a-3p,hsa_circ_0003317+hsa-miR-4482-3p,hsa_circ_0008167+hsa_circ_0003317+hsa-miR-4482-3p,hsa_circ_0008167+hsa_circ_0003317+hsa-miR-146a-3p ,hsa_circ_0008167+hsa-miR-4482-3p+hsa-miR-146a-3p和hsa_circ_0003317+hsa-miR-4482-3p+hsa-miR-146a-3p,分别为0.953,0.940,0.912,0.895,0.957,0.946 ,0.960 和 0.930,如图 5和图6所示。
因此,我们得到了结论是 circRNA-miRNA 网络(2 个 circRNA 和 2 个 miRNA)的组合达到了最高的 AUC 值(0.964),其次是 hsa_circ_0008167+hsa-miR-4482-3p+hsa-miR-146a-3p。 与其他组合相比,表明我们选择的 circRNA-miRNA 网络在区分良性和恶性肺肿瘤方面具有最高的敏感性和特异性。
综上所述,本研究基于血清miRNA测序构建了一个循环NSCLC相关的circRNA-miRNA网络(hsa_circ_0008167, hsa_circ_0003317, hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p)。通过qRT-PCR定量circRNA和miRNA,比较了四个研究队列(健康、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌)血清中选定的circRNA-miRNA网络的相对水平。我们发现hsa_circ_0008167、hsa_circ_0003317、hsa-miR-146a-3p和hsa-miR-4482-3p在非小细胞肺癌患者血清中表达异常,具有区分肺良恶性肿瘤的能力。4种非编码RNA的组合其AUC值比其他组合和传统的肿瘤标记物更高。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120>一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用<160>22
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性上游引物(5’-CATCTTGAGGGAAACAGCAAATG-3’ )
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性下游引物(5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’)
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性上游引物(5’-CCCGGAGTTCTTGTATGTGG-3’ )
<400> 3
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性下游引物(5’-CCGTAGCTTGGTAATTCTGACA-3’ )
<400> 4
<210> 5
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0009129荧光定量PCR特异性上游引物(5’-GACCATTTCCAGGACTTGTGA-3’ )
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0009129荧光定量PCR特异性下游引物(5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’ )
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0006821荧光定量PCR特异性上游引物(5’-GTTATTTCCTACTTGCCTCCTGG-3’ )
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0006821荧光定量PCR特异性下游引物(5’-TCTCTTCCACTTGCTTCCGT-3’ )
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0003603荧光定量PCR特异性上游引物(5’-GTTTTCCAGTGGTAAGGGCC-3’)
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0003603荧光定量PCR特异性下游引物(5’-ATTTAGCTTTATCACAGGCAGC-3’)
<400> 10
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0005283荧光定量PCR特异性上游引物(5’-GAATCACTGCAAACAAGAGTACT-3’ )
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa_circ_0005283荧光定量PCR特异性下游引物(5’-GCCTGTCACCTCTAGCTTGA-3’ )
<400> 12
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-4482-3p特异性逆转录茎环引物(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGAGCCCC -3’ )
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性上游引物(5’-TCGGCAGGTTTCTATTTCTCAG-3’ )
<400> 14
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-146a-3p特异性逆转录茎环引物(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGAAGA-3’ )
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性上游引物(5’-TCGGCAGGCCTCTGAAATTC-3’ )
<400> 16
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-7973特异性逆转录茎环引物(5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGTAATTA-3’ )
<400> 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-7973荧光定量PCR特异性上游引物(5’- GCCGAGTGTGACCCTAGAA-3’)
<400> 18
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-505-3p特异性逆转录茎环引物(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCGAAAC-3’ )
<400> 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> hsa-miR-505-3p荧光定量PCR特异性上游引物(5’- GCCGAGCGTCAACACTTG-3’ )
<400> 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA下游引物通用引物(5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3')
<400> 21
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA RT引物(5'-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttag-3')
<400> 22
Claims (4)
1.一种用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络,其特征在于:所述的ceRNA调控网络为circRNA-miRNA调控网络,所述的circRNA基因为hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317,所述的miRNA基因为hsa-miR-4482-3P和/或hsa-miR-146a-3p。
2.一种权利要求1所述的用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的试剂盒包括检测hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317的荧光定量PCR引物,及检测hsa-miR-4482-3P和/或hsa-miR-146a-3p的引物;
所述的检测hsa_circ_0008167的荧光定量PCR引物包括hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性上游引物和hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性下游引物,所述的hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性上游引物的序列为:5’-CA TCTTGAGGGAAACAGCAAATG-3’,所述的hsa_circ_0008167荧光定量PCR特异性下游引物的序列为:5’-TAAGGACTTGCAGGACCACC-3’;
所述的检测hsa_circ_0003317的荧光定量PCR引物包括hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性上游引物和hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性下游引物,所述的hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性上游引物的序列为:5’-CC CGGAGTTCTTGTATGTGG-3’,所述的hsa_circ_0003317荧光定量PCR特异性下游引物的序列为:5’-CCGTAGCTTGGTAATTCTGACA-3’;
所述的检测hsa-miR-4482-3P的引物包括hsa-miR-4482-3p特异性逆转录茎环引物、hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性上游引物和hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性下游引物,所述的hsa-miR-4482-3p特异性逆转录茎环引物的序列为:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGAGCCCC-3’,所述的hsa-miR-4482-3p荧光定量PCR特异性上游引物的序列为:5’-TCGGCAGGTTTCTAT TTCTCAG-3’;
所述的检测hsa-miR-146a-3p的引物包括hsa-miR-146a-3p特异性逆转录茎环引物、hsa-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性上游引物和hsa-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性下游引物,所述的hsa-miR-146a-3p特异性逆转录茎环引物的序列为:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGAAGA-3’;所述的hs a-miR-146a-3p荧光定量PCR特异性上游引物的序列为:5’-TCGGCAGGCCTCTGAA ATTC-3’;
所述的hsa-miR-4482-3p的荧光定量PCR特异性下游引物和所述的hsa-miR-146a-3p的荧光定量PCR特异性下游引物均为通用引物,所述的通用引物的序列为:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。
4.根据权利要求3所述的用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的ceRNA调控网络在制备非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的hsa-miR-4482-3p和/或hsa-miR-146a-3p基因表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关,所述的hsa_circ_0008167和/或hsa_circ_0003317基因表达量与肺癌患病风险呈正相关。
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