CN108611418A - 一种检测非小细胞肺癌的特异性表达图谱及检测分析系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非小细胞肺癌血清lncRNAs特异表达谱，由表达上调lncRNA SOX2OT、ANRIL构成。所述非小细胞肺癌血清lncRNAs特异表达谱中特异表达lncRNAs的检测引物如SEQ ID NO：1～4所示。本发明还提供了一种非小细胞肺癌检测分析系统，利用以下公式：logit(P＝NSCLC)＝1.7787‑0.5362*S‑0.7764*A；计算，用于非小细胞肺癌的诊断，经ROC曲线分析，此血清lncRNAs模型对非小细胞肺癌具有较高的诊断效率，同时此模型能够诊断非小细胞肺癌早期患者(TNM I期)。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测非小细胞肺癌的特异性表达图谱及检测分析系统。
背景技术
肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是肿瘤性死亡的首要原因。而非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型，约占非小细胞肺癌的80％。尽管早期诊断的非小细胞肺癌患者可以通过手术联合放化疗或者靶向药物治疗进行干预，但非小细胞肺癌患者早期症状与体征并不明显，导致非小细胞肺癌早期诊断异常困难，患者总体的五年生存率仍然不容乐观，仅仅21％左右。目前常用的检查手段，如影像学检查(X光片、数字CT)、血清肿瘤标志物(CEA、SCCA、CYFRA21-1等)、支气管镜检查等，因特异性差、敏感性不强、病人依从性差等原因存在各种不足。因此，寻找一种新型非侵入性、高灵敏度和高特异性的诊断标志物用于非小细胞肺癌的诊断是当前的研究热点和难点。
Long noncoding RNA(lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，可通过转录调控、染色质修饰、X染色体沉默、核内运输多种机制调控靶基因的表达，进而参与肿瘤细胞分化、生长、代谢和凋亡等过程。已经有研究证实，lncRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的lncRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中lncRNAs表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的lncRNAs表达谱，为肿瘤的无创性诊断提供了新的依据。因此，确定非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱，筛选差异表达的lncRNAs，建立非小细胞肺癌血清lncRNAs诊断模型，有助于实现对非小细胞肺癌的早期诊断。
本发明在前期研究中发现，单个的基因检测非小细胞肺癌灵敏度和特异性均比较低，如SOX2OT、ANRIL、CEA、CYFRA21-1和SCCA的AUC分别为0.740、0.723、0.622、0.622和0.607。而将五个基因联用，通过见建立模型：Logit(P)＝1.6487-(0.002×CEA)-(0.0249×CYFRA21-1)-(0.095×SCCA)-(0.5474×SOX2OT)-(0.6174×ANRIL)，所得AUC为0.853。lncRNAs与肿瘤标志物联合虽然可以提高检测的灵敏度和特异性，但是多个基因的联用不仅会增大检测成本，而且增大了数据分析，同时在检测过程中针对不同的基因采用相同的检测分析条件，无疑会增大误差。因此，还需探究更为灵敏、准确的检测方法。
发明内容
本发明主要目的是，提供一种检测非小细胞肺癌的特异性表达图谱及检测分析系统。本发明在前期研究基础上，发现将SOX2OT和ANRIL作为特异性表达图谱，通过设计合适的引物联合用于检测非小细胞肺癌，建立非小细胞肺癌检测分析系统，可使检测灵敏度和特异性大幅提高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一，提供一种非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱，由上调表达的SOX2OT和ANRIL构成。
本发明目的之二，提供上述的lncRNAs特异性表达谱在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。
本发明目的之三，提供一组用检测以上所述非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱的引物，所述SOX2OT的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；所述ANRIL的上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。
本发明目的之四，提供以上所述的引物在制备检测非小细胞肺癌试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明目的之五，提供一种检测非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ IDNO：1所示、SEQ ID NO：2所示的SOX2OT引物，SEQ ID NO：3所示、SEQ ID NO：4所示的ANRIL引物。
本发明目的之六，提供以上所述的试剂盒在制备检测非小细胞肺癌试剂中的应用。
本发明目的之七，提供一种以上所述非小细胞肺癌血清lncRNAs特异表达谱分析系统，所述分析系统包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。
本发明目的之八，提供以上所述的分析系统运行方法，包括以下步骤：
(1)采用定量检测模块，获得SOX2OT表达量数值S，ANRIL表达量数值A；
(2)将上述步骤(1)所得S、A数值输进输入模块；
(3)分析模块进行运算分析；
(4)输出模块输出1或0；其中0代表非小细胞肺癌检测阴性；1代表非小
细胞肺癌检测阳性。
本发明取得的有益效果：
本发明特异表达图谱仅由lncRNA SOX2OT、ANRIL组成，由此建立的
检测分析系统提高了对非小细胞肺癌检测的灵敏度和特异性；并且，该检测
分析系统可以对非小细胞肺癌不同分期进行诊断，能够使非小细胞肺癌患者
早发现早治疗，有效延长非小细胞肺癌患者生存时间。
附图说明
图1：两种lncRNAs在非小细胞肺癌组和对照组中的表达，其中，A：训练组SOX2OT；B：训练组ANRIL；C：验证组SOX2OT；D：验证组ANRIL。
图2：两种lncRNAs对非小细胞肺癌的诊断ROC曲线，其中，A：训练组SOX2OT；B：训练组ANRIL；C：验证组SOX2OT；D：验证组ANRIL。
图3：建立的诊断模型(panel)对非小细胞肺癌及不同分期的诊断ROC曲线。其中，A：训练组Panel；B：验证组Panel；C：验证组I期；D：验证组II期；E：验证组III期。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
本发明目的之一，提供一种非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱，由上调表达的SOX2OT和ANRIL构成。
本发明目的之二，提供上述的lncRNAs特异性表达谱在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。
本发明目的之三，提供一组用检测以上所述非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱的引物，所述SOX2OT的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；所述ANRIL的上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。
本发明目的之四，提供以上所述的引物在制备检测非小细胞肺癌试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明目的之五，提供一种检测非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ IDNO：1所示、SEQ ID NO：2所示的SOX2OT引物，SEQ ID NO：3所示、SEQ ID NO：4所示的ANRIL引物。
本发明目的之六，提供以上所述的试剂盒在制备检测非小细胞肺癌试剂中的应用。
本发明目的之七，提供一种以上所述非小细胞肺癌血清lncRNAs特异表达谱检测分析系统，所述分析系统包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。
进一步，所述定量检测模块包括；所述定检测模块采用以上所述引物检测血清中SOX2OT、ANRIL表达量，采用2-△△Ct方法分别进行分析，得SOX2OT表达量数值S，ANRIL表达量数值A。
进一步，所述分析模块包括logit模型计算和ROC曲线分析；所述logit模型为：
logit(P＝NSCLC)＝1.7787-0.5362*S-0.7764*A；所述S为SOX2OT表达量数值；所述A为ANRIL表达量数值。
本发明目的之八，提供以上所述的分析系统运行方法，包括以下步骤：
(1)采用定量检测模块，获得SOX2OT表达量数值S，ANRIL表达量数值A；
(2)将上述步骤(1)所得S、A数值输进输入模块；
(3)分析模块进行运算分析；
(4)输出模块输出1或0；其中0代表非小细胞肺癌检测阴性；1代表非小
细胞肺癌检测阳性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
1、研究对象
血清标本共来自经受试者同意的126例非小细胞肺癌患者(NSCLC)和126例排除肿瘤的对照者。所有非小细胞肺癌患者均来自山东大学齐鲁医院胸外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经支气管镜检查或术后病理检查确认。所有血清标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。
2、标本采集
采集血清3ml，立即4℃低温条件下，1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80℃待测。
3、RNA分离及提取
取冻存组织样本于常温下解冻，按Trizol(Invitrogen,Carlsbad)试剂使用说明提取组织总RNA。血清样本于常温下解冻，按丙型肝炎核酸纯化诊断试剂盒(QIAGEN,深圳)试剂使用说明提取血清总RNA。
5、RT-qPCR
使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(Takara)反转录上述总RNA成cDNA，然后使用SYBR Premix Ex Taq(Takara)进行PCR反应，运行于CFX96TM实时荧光定量PCR分析仪(Bio-Rad Laboratories,USA)。
PCR反应体系(25μl)：
模板DNA：2ul
SYBR Premix Ex Taq：12.5μl
DyeⅡ：0.5μl
上游引物(10μM)：1μl
下游引物(10μM)：1μl
无菌水：8μl
反应条件为：95℃30秒→1个循环；(95℃5秒，58℃30秒)→45个循环，每个标本均重复测定三次，lncRNA表达量采用2-△△Ct方法进行分析。
6、数据处理与统计学分析
通过SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-Whitney U非参数检验比较两组样本间lncRNAs的浓度差异，P<0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立lncRNAs诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。
7、检测结果
1)通过对非小细胞肺癌组与对照组组织样本进行检测，共得到11个差异表达的lncRNAs，其中上调的包括SOX2OT、ANRIL、IRAIN、PCAT1、CCAT2、SCAL1、UCA1、MALAT1、PANDAR，下调的包括MEG3、TUG1。序列如表1所示(如SEQ ID NO：1～22所示)。
表1测序筛出的差异lncRNAs序列
| lncRNA名称 | 上游引物 | 下游引物 |
| SOX2OT | 5’-GTTCATGGCCTGGACTCTCC-3’ | 5’-ATTGCTAGCCCTCACACCTC-3’ |
| ANRIL | 5’-ACTACAGATGCACCACCATGC-3’ | 5’-TAGGCATCTGTGTGTCTCCAC-3’ |
| IRAIN | 5’-CGACACATGGTCCAATCACTGTT-3’ | 5’-AGACTCCCCTAGGACTGCCATCT-3’ |
| PCAT1 | 5’-AATGGCATGAACCTGGGAGGCG-3’ | 5’-GGCTTTGGGAAGTGCTTTGGAG-3’ |
| CCAT2 | 5’-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3’ | 5’-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT-3’ |
| SCAL1 | 5’-ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT-3’ | 5’-AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT-3’ |
| UCA1 | 5’-TTCCTTATTATCTCTTCTG-3’ | 5’-TCCATCATACGAATAGTA-3’ |
| MALAT1 | 5’-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3’ | 5’-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3’ |
| PANDAR | 5’-TGCACACATTTAACCCGAAG-3’ | 5’-CCCCAAAGCTACATCTATGACA-3’ |
| MEG3 | 5’-CTGCCCATCTACACCTCACG-3’ | 5’-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3’ |
| TUG1 | 5’-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3’ | 5’-CACAAATTCCCATCATTCCC-3’ |
2)上述11个lncRNAs经RT-qPCR验证，以平均Cq值小于35且检测率大于75％；在非小细胞肺癌组和对照组表达差异具有统计学意义，即P<0.05为入选标准，共确定出2个差异表达的lncRNAs，即SOX2OT和ANRIL。检测引物为自主设计，其序列如表2所示(如SEQ ID NO：1～13所示)。
表2引物序列
3)如图1所示，分别在两个独立研究队列(Training和Validation组)中进行检测分析，lncRNA SOX2OT和ANRIL在非小细胞肺癌组表达显著增高。建立上述2个lncRNAs各自诊断非小细胞肺癌的ROC曲线，如图2所示。
4)将上述2个lncRNAs带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为：logit(P＝NSCLC)＝1.7787-0.5362*S-0.7764*A；所述S为SOX2OT表达量数值；所述A为ANRIL表达量数值。经ROC曲线分析，此模型在训练组中对非小细胞肺癌的诊断效能AUC为0.886，敏感性和特异性分别为87.5％和77.8％，在验证组中对非小细胞肺癌的诊断效能AUC为0.869，敏感性和特异性分别为74.1％和90.7％，如图3所示。
5)利用该诊断模型对非小细胞肺癌分期为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ期的患者进行分析，其诊断I，II，III期患者的AUC分别为0.845，0.873和0.891，如图3所示。说明该模型能够实现对非小细胞肺癌的早期诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种检测非小细胞肺癌的特异性表达图谱及检测分析系统
<130>
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttcatggcc tggactctcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attgctagcc ctcacacctc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actacagatg caccaccatg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taggcatctg tgtgtctcca c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgacacatgg tccaatcact gtt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agactcccct aggactgcca tct 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatggcatga acctgggagg cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggctttggga agtgctttgg ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccctggtcaa attgcttaac ct 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttattcgtcc ctctgtttta tggat 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
accagctgtc cctcagtgtt ct 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aggcctttat cctcgggttg cct 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttccttatta tctcttctg 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tccatcatac gaatagta 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggtaacgatg gtgtcgaggt c 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagcattac agttcttgaa catg 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgcacacatt taacccgaag 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccccaaagct acatctatga ca 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctgcccatct acacctcacg 20
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctctccgccg tctgcgctag gggct 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tagcagttcc ccaatccttg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cacaaattcc catcattccc 20
Claims (10)
1.一种非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱，其特征在于：由上调表达的SOX2OT和ANRIL构成。
2.如权利要求1所述的lncRNAs特异性表达谱在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。
3.一组用于检测权利要求1所述非小细胞肺癌lncRNAs特异表达谱的引物，其特征在于，所述SOX2OT的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；所述ANRIL的上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求3所述的引物在制备检测非小细胞肺癌试剂和/或试剂盒中的应用。
5.一种检测非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO：1所示、SEQ ID NO：2所示的SOX2OT引物，SEQ ID NO：3所示、SEQ ID NO：4所示的ANRIL引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒在制备检测非小细胞肺癌试剂中的应用。
7.一种如权利要求1所述非小细胞肺癌血清lncRNAs特异表达谱检测分析系统，其特征在于：包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。
8.如权利要求7所述的分析系统，其特征在于，所述定量检测模块包括；所述定检测模块采用权利要求3所述引物检测血清中SOX2OT、ANRIL表达量，采用2-△△Ct方法分别进行分析，得SOX2OT表达量数值S，ANRIL表达量数值A。
9.如权利要求7所述的分析系统，其特征在于，所述分析模块包括logit模型计算和ROC曲线分析；所述logit模型为：
logit(P＝NSCLC)＝1.7787-0.5362*S-0.7764*A；所述S为SOX2OT表达量数值；所述A为ANRIL表达量数值。
10.如权利要求7所述的分析系统运行方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用定量检测模块，获得SOX2OT表达量数值S，ANRIL表达量数值A；
(2)将上述步骤(1)所得S、A数值输进输入模块；
(3)分析模块进行运算分析；
(4)输出模块输出1或0；其中0代表非小细胞肺癌检测阴性；1代表非小细胞肺癌检测阳性。
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