CN107400710A - 一种用于met基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒 - Google Patents

一种用于met基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能快速、简便、敏感、特异的检测MET基因14外显子跳跃缺失检测的试剂盒，采用了特异的MET基因14外显子特异探针和引物，以及内参基因GADPH特异探针和引物，结合荧光PCR检测技术可以高灵敏的检测血液外泌体或肿瘤组织中MET基因14外显子跳跃缺失的检测；使用特异性探针对定量分子进行识别，具有高准确性，特异性好，假阳性低；操作简单安全，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。

Description

一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的检测试剂盒。
背景技术
1984年Cooper在研究人骨肉瘤Hos细胞系时，克隆出了一个具有转化活性的片段，定名为c-met。c-met位于人类7号染色体长臂（7q31）。c-met基因大小约110kb，包括21个外显子。近些年来人们对肿瘤固有的MET异常产生了极大兴趣，MET活化形式多样，包括MET基因扩增、MET 蛋白过表达和MET基因突变。
最近研究发现MET基因14外显子跳跃缺失（MET exon14-skipping）多发生于非小细胞肺癌，并以其中的肺肉瘤样癌和腺癌更多见，在肺腺癌中的发生率约3~4%，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22%。从2014年7月TCGA发现肺腺癌MET exon14-skipping到现在，在1年半时间就MET exon14-skipping发表的的研究已超过10项，MET抑制剂显示了极好的近期疗效，从而引起人们的极大兴趣和研究热情。MET突变可能有望成为其靶向治疗的潜在靶点。
外泌体（exosomes）是一种直径在40-100nm的圆形单层膜性小囊泡，可由机体多种类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体含有多种蛋白、mRNAs、microRNAs、信号分子等，能够反映来源细胞的许多生物学性状。目前，关于外泌体的研究主要集中在免疫学和肿瘤学方面。
MET基因14外显子跳跃缺失的检测在肺癌、尤其是肺肉瘤样癌有巨大的需求，对其治疗方案的制定具有重要指导意义。但是，目前还没有可以利用血浆样本进行快速便捷、经济实效的检测MET基因14外显子跳跃缺失的的试剂盒。基于上述研究，本发明利用MET基因14外显子跳跃缺失的检测，用于制定肺癌、尤其是肺肉瘤样癌的个体化临床治疗方案，服务精准治疗。
发明内容
本发明的目的：提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测MET基因14外显子跳跃缺失检测的试剂盒，采用了特异的MET基因14外显子特异探针和引物，以及内参基因GADPH特异探针和引物，结合荧光PCR检测技术可以高灵敏的检测血液外泌体或肿瘤组织中MET基因14外显子跳跃缺失的检测；使用特异性探针对定量分子进行识别，具有高准确性，特异性好，假阳性低；操作简单安全，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针。
所述特异性反转录引物包括如下序列：
metE14RT:5’CAGAGGATACTGCACTTGTCG3’
Actin反转录：5’CAGGAGGAGCAATGATCTTG3’
所述Q-PCR特异性引物如下序列：
metE14F:5’TACTTGGGTTTTTCCTGTGG3’
metE14R:5’ATGAACCGTTCTGAGATGAATTAG3’
ACTBF:5’CTGGCATTGCCGACAGGA3’
ACTBR:5’AGGAGCAATGATCTTGATCTTC3’
所述探针包括如下序列：
metE14Taqman:5’-FAM-CCTAATTCATCTCAGAACG-MGB-3’
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB
一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，通过所述的检测试剂盒提取RNA样本，并在RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应，所述的RT-PCR反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其中，所述的RT-PCR反应的条件如下。
一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其中，所述的RNA样本来自于新鲜血液样本。
一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其中，所述的血浆样本的重量为10ml。
本发明检测用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的检测，由于以血浆作为检测样本，解决了临床的肿瘤患者难于获取组织样本的现状；通过检测MET基因14外显子跳跃缺失的情况，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有高准确性，特异性好，假阳性低；操作简单安全，检测廉价，使得临床检测结果更好判读。
具体实施方式
还包括人类基因组野生型位点引物，FAM-MGB Taqman探针，具体为：
ACTBF CTGGCATTGCCGACAGGA
ACTBR AGGAGCAATGATCTTGATCTTC
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB 一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类MET基因的基因序列，针对MET基因来设计引物和探针。
针对选定的MET序列，应用Premier 6.0引物设计软件设计多对特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12，000 rpm（～13，400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10 μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中；10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中；10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
在所述的步骤2.13中，所述的逆转录PCR反应体系如下：
5×Transcription Buffer 5uL
dNTP(10mM) 1.25uL
引物终浓度 200nM
Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) 0.7uL
MLV-Transcriptase 1uL
RNA 15uL
DEPC H2O 补足至25uL
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的PCR反应的条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。检测孔Ct值是指样本检测孔对应的Ct值；结果判读如下：样本MET有S型曲线且Ct值>35时，MET基因14号外显子为阴性；1Ct≤35时，MET基因14号外显子为阳性。
所述的RNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织或新鲜血浆。
取样的所述的MET样本为1克左右。
在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在MET基因14号外显子跳跃缺失，阴性为不存在MET基因14号外显子跳跃缺失。
所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl。
步骤3：42°保温1个小时，85°C孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
实施例1：
运用于本发明体系检测质粒，实验用质粒模板（含MET基因14号外显子缺失）, 利用上述荧光PCR检测MET基因14号外显子跳跃缺失的方法如下：
（1）质粒的处理与提取：
质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid kid，DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl (10mM,pH 8.0), 经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度=（C质量浓度X6.02X1023）/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
（2）建立PCR扩增反应体系
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下体系进行PCR扩增：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.2mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL
反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
试验结束以后，按照以下步骤进行分析、判定：
1.运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2.运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3.运行的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4.有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5.在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在MET基因14号外显子跳跃缺失，阴性为不存在MET基因14号外显子跳跃缺失。
实施例2：
运用本发明检测临床样本，取检测135例送我公司检测的肺癌患者。其中男性71例，女性64例，年龄为31-93岁，平均年龄58岁，中位年龄62岁，利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测135例临床样本的MET基因14号外显子跳跃缺失突变步骤如下：
（1）样本处理与DNA的提取
提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12，000 rpm（～13，400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10 μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中；10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中；10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
在所述的步骤2.13中，所述的逆转录PCR反应体系如下：
5×Transcription Buffer 5uL
dNTP(10mM) 1.25uL
引物终浓度 200nM
Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) 0.7uL
MLV-Transcriptase 1uL
RNA 15uL
DEPC H2O 补足至25uL
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的PCR反应的条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。检测孔Ct值是指样本检测孔对应的Ct值；结果判读如下：样本MET有S型曲线且Ct值>35时，MET基因14号外显子为阴性；1Ct≤35时，MET基因14号外显子为阳性。
在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在MET基因14号外显子跳跃缺失，阴性为不存在MET基因14号外显子跳跃缺失。
检测结果表明所检测135例肺癌样本中有6例发生MET基因14号外显子跳跃缺失突变，突变率为4.5%，同时对上述所有样本进行FISH对比检测，FISH结果表明突变有5例，经测序证明FISH结果未检出的样本为阳性，进一步证明了本发明体系检测的结果优于FISH检测。
附表1：临床样本检测结果比较：
。

Claims (4)

1.一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针。
所述特异性反转录引物包括如下序列：
metE14RT:5’CAGAGGATACTGCACTTGTCG3’
Actin反转录：5’CAGGAGGAGCAATGATCTTG3’
所述Q-PCR特异性引物如下序列：
metE14F:5’TACTTGGGTTTTTCCTGTGG3’
metE14R:5’ATGAACCGTTCTGAGATGAATTAG3’
ACTBF:5’CTGGCATTGCCGACAGGA3’
ACTBR:5’AGGAGCAATGATCTTGATCTTC3’
所述探针包括如下序列：
metE14Taqman:5’-FAM-CCTAATTCATCTCAGAACG-MGB-3’
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB。
2. 根据权利要求1所述的一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其特征在于，通过所述的检测试剂盒提取RNA样本，并在RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应，所述的RT-PCR反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
dNTP 0.5mM
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
3.根据权利要求1所述的一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的RNA样本来自于新鲜血液样本。
4.根据权利要求1所述的一种用于MET基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的RNA样本的重量为10ml。
CN201710603545.5A 2017-07-23 2017-07-23 一种用于met基因14外显子跳跃缺失突变的试剂盒 Pending CN107400710A (zh)

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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105713987A (zh) * 2016-04-25 2016-06-29 北京福安华生物科技有限公司 一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒
CN108929908A (zh) * 2018-07-17 2018-12-04 张丽英 一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法
CN110791556A (zh) * 2019-12-06 2020-02-14 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司 Met基因外显子14跳跃突变检测的引物组、检测方法和试剂盒
CN111235272A (zh) * 2020-01-10 2020-06-05 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN113046437A (zh) * 2021-03-19 2021-06-29 嘉兴允英医学检验有限公司 一种检测met e14跳跃突变的方法
CN114622018A (zh) * 2022-04-15 2022-06-14 上海观合医药科技有限公司 用于检测met基因14号外显子跳跃突变的引物及方法
CN117187395A (zh) * 2023-11-06 2023-12-08 神州医疗科技股份有限公司 一种met基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105713987A (zh) * 2016-04-25 2016-06-29 北京福安华生物科技有限公司 一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒
CN106811517A (zh) * 2016-03-22 2017-06-09 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106811517A (zh) * 2016-03-22 2017-06-09 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒
CN105713987A (zh) * 2016-04-25 2016-06-29 北京福安华生物科技有限公司 一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AWAD ET AL.: "MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression", 《JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105713987A (zh) * 2016-04-25 2016-06-29 北京福安华生物科技有限公司 一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒
CN108929908A (zh) * 2018-07-17 2018-12-04 张丽英 一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法
CN110791556A (zh) * 2019-12-06 2020-02-14 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司 Met基因外显子14跳跃突变检测的引物组、检测方法和试剂盒
CN111235272A (zh) * 2020-01-10 2020-06-05 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN111235272B (zh) * 2020-01-10 2023-07-07 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN113046437A (zh) * 2021-03-19 2021-06-29 嘉兴允英医学检验有限公司 一种检测met e14跳跃突变的方法
CN114622018A (zh) * 2022-04-15 2022-06-14 上海观合医药科技有限公司 用于检测met基因14号外显子跳跃突变的引物及方法
CN117187395A (zh) * 2023-11-06 2023-12-08 神州医疗科技股份有限公司 一种met基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统

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