CN106978497A

CN106978497A - Eml4‑alk融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN106978497A
Application number: CN201710283317.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡从利; 张喆; 李丽琼; 周鹏飞
Original assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-07-25

Abstract

本发明涉及生物技术及医学领域，具体公开了EML4‑ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒，用于EML4‑ALK融合基因突变的检测。所述检测引物包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:14所示的序列，所述探针序列如SEQ ID NO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ‑MGB。所述试剂盒含有上述检测引物与探针以及质控系统等。本发明可特异性识别13种EML4‑ALK融合突变类型，且灵敏度高，可以检出5拷贝的突变，整个逆转录PCR及荧光PCR检测过程只需要80分钟即可完成。

Description

EML4-ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术及医学领域，具体地说，涉及EML4-ALK融合基因突变的检测。

背景技术

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为16.8％。根据世界卫生组织(WHO)癌症Globocan数据库，2012年我国新发肺癌患者达65.28万，居所有恶性肿瘤之首，约占全球1/3。

基于组织病理学结果，肺癌可以划分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中80％为NSCLC。多数(>70％)肺癌患者在确诊时已处晚期，全身化疗是主要治疗选择。近年来，随着分子医学的进展和靶向药物的不断涌现，非小细胞肺癌的治疗已进入到个体化分子靶向"精准"治疗的时代。间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因型肺癌已成为继表皮生长因子(EGFR)突变型肺癌之后的又一个肺癌分子亚型，具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物。

肺癌中ALK变异主要为ALK基因与其他基因发生断裂重排。其中，棘皮动物微管结合样蛋白4(EML4)-ALK融合基因变异是其主要类型。国内外大量的研究数据显示，发生ALK重排的非小细胞肺癌患者占3％～7％。EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。EML4与微管形成密切相关，ALK在肿瘤细胞信号转导起着重要的调节作用。这两个基因片段的倒位融合[inv(2)(p21p23)]可以让组织表达新的EML4-ALK融合蛋白,形成非配体依赖性二聚体引起组成性的ALK激活。ALK信号可通过激活RAS-MEK-ERK，JAK3-STAT3和PI3K-AKT信号通路导致细胞增殖和生成。

克唑替尼是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，既可特异性靶向抑制ALK，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。克唑替尼分别于2011年和2013年被美国食品与药品管理局(FDA)和中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市，用于治疗EML4-ALK表达的局部晚期或转移性NSCLC患者。临床试验显示对于ALK阳性的晚期非小细胞肺癌患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，一线单药治疗患者的中位无进展生存期(PFS)为10.9个月，有效率高达74％，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3％。2012年，据美国国家综合癌症网(NCCN)NSCLC临床指南推荐，晚期NSCLC患者开始治疗前应进行EML4-ALK检测，并建议阳性患者首先接受克唑替尼治疗。

大约40％的ALK阳性NSCLC患者对克唑替尼原发耐药。新一代ALK抑制剂色瑞替尼的I期临床研究结果显示其对克唑替尼耐药及存在中枢神经系统转移病灶的患者具有较好的疗效。基于以上令人鼓舞的试验数据，2014年4月，FDA批准色瑞替尼用于治疗ALK阳性、经克唑替尼治疗疾病进展或不能耐受的转移性NSCLC患者。Alectinib是一种强效选择性ALK抑制剂，其Ⅱ期临床研究结果显示，46例ALK阳性未经克唑替尼治疗患者的ORR为93.5％。2014年7月Aectinib在日本获批使用。

目前针对ALK融合基因检测的常用方法有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学法(IHC)和荧光PCR方法。FISH价格昂贵，操作规范要求较高，且不能区分ALK融合类型(fusionvariants)；IHC简便易行，但阳性标准不统一，也不能区分ALK融合类型。

CN102719525A公开了用于检测EML4-ALK融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒，利用荧光PCR技术可以一次同时检测EML4与ALK基因的9种融合突变。随着时间推移，新的EML4与ALK基因的融合突变类型逐渐被发现，CN102719525A检测的9种EML4-ALK融合突变已经不能满足临床需求。且其公开的方法中荧光PCR检测需要90分钟，逆转录PCR另需要65分钟，整个步骤所需时间较长。同时为保证临床试验室检测结果的准确性，最好在产品中加入防污染体系，同时引入空白对照，对检测试剂及环境进行监测，防止假阳性结果的产生，这一方面CN102719525A中未有提及。

因此需要有新的EML4-ALK检测方法来满足以下要求：1)能涵盖更多EML4-ALK融合突变类型；2)能节约检测时间；3)体系设计中增加防污染体系及空白对照，防止假阳性结果的产生，保证检测结果的准确可靠。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供EML4-ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了用于检测EML4-ALK基因融合突变的引物组合，包括SEQID NO:1-SEQ ID NO:14所示的序列。该引物组合可以特异性识别13种EML4-ALK融合突变类型。

不仅如此，本发明还提供了与所述引物组合配合使用的特异性探针，其序列如SEQID NO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

第二方面，本发明提供了用于检测EML4-ALK基因融合突变的试剂盒，其含有前述的引物组合与特异性探针。

为了提高所述试剂盒的检测准确度，所述试剂盒还含有质控系统，阳性对照液和空白对照液。

所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQ ID NO:16和SEQID NO:17所示，所述质控探针的序列如SEQ ID NO:18所示，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

所述阳性对照液为含有4种质粒DNA的混合液，所述4种质粒DNA分别含有EML4-ALK-M1、EML4-ALK-M5、EML4-ALK-M7和B2M序列，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

进一步地，所述试剂盒还包括本领域其他荧光PCR试剂盒的必要成分，如PCR缓冲液，HotStart Taq酶和UNG酶。

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)提取检测样本中的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液；

(2)将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；

(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和VIC/HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于38：阴性；Ct值小于38：阳性。

其中，PCR扩增反应的反应体系如下：

RNA逆转录为cDNA的方法涉及反转录体系以及如下操作步骤：

反转录体系包括如下成分：

逆转录混合液(含逆转录酶) 2μL

RNA 3μL

加DNase/RNase-free ddH2O 10μL。

操作步骤为：

a)将逆转录反应混合液混匀，置于冰上，取2μL逆转录反应混合液加入无菌无酶的离心管中，混匀。

b)加入待测样品RNA 3μL，RNA总量在0.1～5μg范围内，补水至10μL。

c)37℃保温15分钟。

d)85℃保温5秒后冰上冷却，得到cDNA模板。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明采用ARMS引物特异性识别13种EML4-ALK融合突变类型，基于Taqman探针法收集荧光信号，特异性得到很好保障。本发明的试剂盒具有以下优点：(1)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测EML4-ALK基因13种融合突变，与CN102719525A发明中3个反应体系检测9种突变类型相比，本发明需要在一个反应体系中涵盖更多检测位点，对引物和探针的设计要求更高；(2)灵敏度高，5拷贝的突变可以检出；(3)仅使用14条引物、1条探针便实现13个位点的检测，而CN102719525A中使用14条引物、5条探针实现9个位点的检测，相比较而言，本发明的原材料组分更少，生产成本更低；(4)检测速度快，本发明中逆转录PCR仅需15分钟，荧光PCR仅需60分钟，整个逆转录PCR及荧光PCR检测过程只需要80分钟即可完成；(5)样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；(6)本发明体系中引入UNG酶-dUTP防污染体系及空白对照系统，能更好的防止假阳性结果的产生，确保检测结果准确可靠。

附图说明

图1为本发明非融合突变样本检测示意图。

图2为本发明融合突变样本检测示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明实施例是这样实现的，一种用于EML4-ALK融合基因检测的试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，13组特异性引物，1条特异性探针和质控系统，HotStart Taq酶，UNG酶。

所述PCR缓冲液中含有1.0～5.0mM的MgCl2，1.0～5.0mM的dNTPs，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0～5.0mM。

所述13组特异性引物序列的正向引物为SEQ ID NO:1-13，反向引物序列为SEQ IDNO:14。其中SEQ ID NO:1-13为ARMS引物，可以特异性识别13种对应的EML4-ALK融合突变类型，其中SEQ ID NO:14是普通PCR引物。13条ARMS引物分别在3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。

各引物序列列举如下：

EML4-ALK-M1-F：CCTGGGAAAGGACCTAAAGAGT(SEQ ID NO:1)；

EML4-ALK-M2-F:AACTCGGGAGACTATGAAATATTGTACTAG(SEQ ID NO:2)；

EML4-ALK-M3-F：CATAAAGATGTCATCATCAACCAAGTCT(SEQ ID NO:3)；

EML4-ALK-M4-F：TCGCGAAAAAAACAGCCAAGTAT(SEQ ID NO:4)；

EML4-ALK-M5-F：GAAAGAGAAATAGAGATATGCTGGATGTG(SEQ ID NO:5)；

EML4-ALK-M6-F：CGAGGAACATTTAATGATGGGTG(SEQ ID NO:6)；

EML4-ALK-M7-F：CAGTGAAAAAATCAGTCTCAAGTAAAGAG(SEQ ID NO:7)；

EML4-ALK-M8-F：TGACCACCCACCTGCAGTCT(SEQ ID NO:8)；

EML4-ALK-M9-F：CTCTGTGATGCGCTACTCAATAGTCT(SEQ ID NO:9)；

EML4-ALK-M10-F：TGACCACCCACCTGCAGAG(SEQ ID NO:10)；

EML4-ALK-M11-F：ATGATCTGAATCCTGAAAGAGAAATAGATC(SEQ ID NO:11)；

EML4-ALK-M12-F：GAACGCACTCAGGCAGTCC(SEQ ID NO:12)；

EML4-ALK-M13-F：CATTAAAAAATGTGGAATGCTGCTA(SEQ ID NO:13)；

EML4-ALK-M-R：CTCCATCTGCATGGCTTGC(SEQ ID NO:14)。

所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，特异性更强。

优选地，所述1条特异性探针序列为SEQ ID NO:15，可特异性识别ALK基因20号外显子上的一段序列。

探针序列列举如下：

EML4-ALK-M-P：CGCCGGAAGCACCAG(SEQ ID NO:15)。

本发明实施例中，使用质控系统监测样本质量。RNA容易降解，对样本制备与保存、RNA提取及逆转录过程要求较高。采用表达量稳定的基因构建质控系统，可以有效监测样本质量，避免产生假阴性结果。因此本发明实施例中采用质控系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该质控系统包含质控引物和质控探针，本发明实施例中可采用本领域技术人员熟知的其它质控系统。优选地，所述质控系统包含质控引物和质控探针。质控引物序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述质控探针序列为SEQ ID NO:18，所述质控探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

优选地，本发明实施例中的质控系统针对人B2M基因设计。其中包含的质控引物序列如下所示：

B2M-F：ATGAGTATGCCTGCCGTGTG(SEQ ID NO:16)；

B2M-R：GCTTACATGTCTCGATCCCACT(SEQ ID NO:17)。

本发明实施例中的质控探针5′端标记有报告基团，如FAM、VIC等，3′端标记有不发光荧光淬灭基团，如NFQ-MGB等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

优选地，所述质控探针为：

B2M-P：CCATGTGACTTTGTCACAGC(SEQ ID NO:18)。

优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。

优选地，本发明实施例中的检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有EML4-ALK-M1、EML4-ALK-M5、EML4-ALK-M7和B2M序列，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这4种质粒浓度相同，均为2000copies/μL；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明实施例的另一目的在于提供一种EML4-ALK融合基因的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测EML4-ALK融合基因的引物组合和探针组合；制备本发明的EML4-ALK融合基因检测试剂盒。

(2)获得待测样品总RNA；

(3)将RNA逆转录为cDNA；

(3)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增：每个样本分四个反应管检测13种EML4-ALK融合突变类型，将上述获得的cDNA先后取相同的量加入所述四个反应管中并同时进行PCR反应。

优选地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在上述25μL反应体系中，所述各对引物包括上述步骤(1)中的13对特异性引物，1对质控引物及质控引物，所述各条探针包括上述步骤(1)中的特异性探针，所述样品为cDNA。

具体地，在步骤(3)中的荧光定量PCR反应条件为：

37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

40个循环：95℃15秒，60℃35秒并收集荧光信号。

在上述PCR反应后，所得结果按以下步骤进行结果判定：

根据弱阳性对照和空白对照，对试剂盒有效性判定：

根据质控体系结果，进行样本有效性的判定，质控PCR反应液：FAM通道Ct值≤30，样本RNA质量较好，加量适中。

对样本检测结果进行判定，确定样本是否存在融合。

样本检测Ct值≥38或无Ct值，则该样本为非融合突变或为本试剂盒检测范围外融合突变；

样本检测Ct值＜38，则样本为该反应管对应的融合突变。

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在80分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

制备本发明的EML4-ALK融合基因检测试剂盒，包括以下步骤：

1、引物及探针合成：

设计并合成13组特异性引物，其中正向引物为SEQ ID NO:1-13，公用反向引物为SEQ ID NO:14，特异性探针为SEQ ID NO:15，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。

2、制备质控系统：

设计并合成针对人B2M基因的1对质控引物，该引物对序列为SEQ ID NO:16和SEQID NO:17；设计并合成质控探针，该探针为SEQ ID NO:18。将该质控引物和探针分别配制成100μM的母液储存。

3、制备其他试剂：

制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl2，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml。

4、制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有EML4-ALK-M1、EML4-ALK-M5、EML4-ALK-M7和B2M序列，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2000copies/μL；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

5、PCR反应液配制：

按照下表进行四个不同体系PCR反应液配制

表1：PCR反应液配制

6、组装试剂盒：

试剂盒中包含4管PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算20人份规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

用实施例1制备的EML4-ALK融合基因检测试剂盒对待侧样品进行检测。

本实施例中收集300例肺癌患者的FFPE样本，从其中提取RNA，逆转录成cDNA后，用实施例1中得到的EML4-ALK融合基因检测试剂盒检测待检样品的EML4-ALK融合突变情况。

1、FFPE样本RNA提取

(a)取上述各肺癌样本，分别加入1ml二甲苯，混匀，室温下13000rpm离心2分钟，弃上清液，加入1ml无水乙醇到沉淀中，震荡混匀(去除二甲苯)，室温下13000rpm离心2分钟弃上清液，打开离心管盖，37℃放置10分钟，使残留的乙醇蒸发干净；

(b)在离心管中加240μL Buffer PKD及10μL蛋白酶K，震荡混匀，56℃孵育15分钟，80℃孵育15分钟，冰上孵育3分钟，然后13,000rpm离心15分钟，将上清转移到一个新的离心管。往上清中加入25μL DNase Booster Buffer和10μL DNase I原液，室温孵育15分钟，后加入500μL Buffer RBC，混匀；

(c)往上清液加入1200μL无水乙醇，混匀，取700μL样品包括前面生成的沉淀转移到带有2ml收集管的RNA minElute离心柱里，大于10,000rpm离心15s，弃废液，重复上一步直到样品转移到RNA minElute离心柱里。

(d)打开盖子加入500μL Buffer RPE，盖紧盖子，大于10000rpm离心2分钟，重复本步骤一次后，将柱子转移到收集管中，向吸附膜中间部位滴加14-30μL RNase-free water，离心1分钟后收集RNA。

2、RNA逆转录成cDNA：

用紫外分光光度计检测RNA提取质量及浓度，确定其浓度OD260/OD280为1.8-2.0。取0.1～5μg的RNA作为其cDNA合成的模板，采用武汉友芝友医疗科技股份有限公司的试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下：

逆转录混合液(含逆转录酶) 2μL

RNA 3μL

加DNase/RNase-free ddH₂O 10μL。

(a)将逆转录反应混合液混匀，置于冰上，取2μL逆转录反应混合液加入无菌无酶的离心管中，混匀。

(b)加入待测样品RNA 3μL，RNA总量在0.1～5μg范围内，补水至10μL。

(c)37℃保温15分钟。

(d)85℃保温5秒后冰上冷却，得到cDNA模板。

3、样本的荧光定量PCR检测

取2μL步骤2中得到的cDNA，加入四个反应体系中，使反应体系总体积均为25μL，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

95℃5分钟；

95℃15s，60℃35s，40个循环；每个循环后收集FAM和VIC/HEX的荧光信号。

4、样本的检测结果分析:

检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于38：阴性；Ct值小于38：阳性。

检测结果表明所检测300例肺癌样本中有23例发生有EML4-ALK融合突变，突变率为7.6％，同时对上述所有样本进行IHC对比检测，IHC结果表明突变有23例，两种检测方法的符合率为100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表4。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改

进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表2EML4-ALK基因13种融合突变

表3试剂盒的组成

表4临床样本检测结果对比

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> EML4-ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒

<130> KHP171112142.0TQ

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgggaaag gacctaaaga gt 22

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactcgggag actatgaaat attgtactag 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cataaagatg tcatcatcaa ccaagtct 28

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgcgaaaaa aacagccaag tat 23

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaagagaaa tagagatatg ctggatgtg 29

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgaggaacat ttaatgatgg gtg 23

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagtgaaaaa atcagtctca agtaaagag 29

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgaccaccca cctgcagtct 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctctgtgatg cgctactcaa tagtct 26

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgaccaccca cctgcagag 19

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgatctgaa tcctgaaaga gaaatagatc 30

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaacgcactc aggcagtcc 19

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cattaaaaaa tgtggaatgc tgcta 25

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctccatctgc atggcttgc 19

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgccggaagc accag 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgagtatgc ctgccgtgtg 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcttacatgt ctcgatccca ct 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccatgtgact ttgtcacagc 20

Claims

1.用于检测EML4-ALK基因融合突变的引物组合，其特征在于，包括SEQ ID NO:1-SEQID NO:14所示的序列。

2.与权利要求1所述引物组合配合使用的特异性探针，其特征在于，其序列如SEQ IDNO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

3.用于检测EML4-ALK基因融合突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有质控系统，所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示，所述质控探针的序列如SEQ ID NO:18所示。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液为含有4种质粒DNA的混合液，所述4种质粒DNA分别含有EML4-ALK-M1、EML4-ALK-M5、EML4-ALK-M7和B2M序列，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

8.根据权利要求3-6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶和UNG酶。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其使用方法包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增反应的反应体系如下：