CN109706232B

CN109706232B - 用于检测人类alk基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN109706232B
Application number: CN201910160368.7A
Authority: CN
Inventors: 杨芳梅; 徐红梅; 吴晗晗; 查帮玲
Original assignee: Herfei Ocgene Biotech Co ltd
Current assignee: Herfei Ocgene Biotech Co ltd
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN109706232A

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法，引物、探针，包括：在ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列上设计多条上游引物，在ALK exon 20上设计共用下游引物和荧光检测探针；ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列包括：EML4‑exon2/6/13/14/17/20，TFG‑exon5、KIF5B‑exon15/17/24、TPR‑exon15、HIPI‑exon21、SEC31A‑exon21；试剂盒可以涵盖多达28种ALK融合形式，特异性、灵敏度高，能有效避免假阳性的试剂盒，建立的一步法逆转录检测方法，能够简化操作，避免污染。

Description

用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外分子诊断领域，特别是一种用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法。

背景技术

在我国，肿瘤的发病率快速升高，肺癌是威胁人类健康的一大杀手，死亡率高且预后不良。肺癌的驱动基因包括EGFR突变、ALK融合基因、ROS1基因重排及c-MET基因扩增等。其中，ALK融合基因是指ALK基因(间变性淋巴瘤激酶，anaplastic lymphoma kinase)与棘皮动物微管相关蛋白4(echinoderm microtubμle associated protein-like4,EML4)等基因发生融合，在肺癌患者中的发生率约为3％～7％。目前，已发现多个ALK基因融合伴侣基因，如KIF5B、TFG、KLC1、PTPN3、HIP1和TPR基因等，其中EML4-ALK融合约占所有ALK融合的81％。《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》和《CSCO原发性肺癌诊疗指南》都推荐含腺癌成分的非小细胞肺癌(NSCLC)患者常规进行ALK基因检测。携带ALK基因融合的NSCLC患者可以从ALK抑制剂中获益，如克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)和Alectinib等。

目前现有的人类ALK融合基因突变的检测方法主要是荧光原位杂交(FISH)和逆转录荧光PCR技术(RT-qPCR)。荧光原位杂交检测探针昂贵，实验步骤繁琐，假阴性率高，灵敏度低，且需要专业人员进行结果判读，尚不适用于ALK阳性患者的筛查。RT-qPCR具有操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低、结果判断简单等优点，而且适用的样本范围较广，适合于临床应用推广。但是目前现有试剂盒大多采用两步法RT-PCR，易交叉污染，且目前大多只检测EML4-ALK融合，而忽略了其他重要的融合位点，容易造成漏检，且假阳性、假阴性率较高，灵敏度低，因此临床实践中难以推广；市场需要一种ALK融合位点多，特异性、灵敏度高，能有效避免假阳性的试剂盒，检测方法能够简化操作，避免污染；本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法，试剂盒可以涵盖多达28种ALK融合形式，特异性、灵敏度高，能有效避免假阳性的试剂盒，建立的一步法逆转录检测方法，能够简化操作，避免污染。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，包括：在ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列上设计上游引物，在ALK exon 20上设计共用下游引物和荧光检测探针；ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列包括：EML4-exon2/6/13/14/17/20，TFG-exon5、KIF5B-exon15/17/24、TPR-exon15、HIPI-exon21、SEC31A-exon21。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，包括两组引物探针组合；

第一组引物探针的融合位点包括：V5a(E2；A20)，V5b(E2；ins117A20)，V3a(E6；A20)，V3b(E6ins33；A20)，E6；A19，E6；ins18A20，V1(E13；A20)，V6(E13；ins69A20)，E14ins2；ins56A20，E17del58；ins39A20，V8a(E17；ins30A20)，V8b(E17ins61；ins34A20)，E17；ins68A20，V5”(E18；A20)，V2(E20；A20)，E20；ins18A20，T5；A20，K17；A20，K24；A20，TP15；A20，H21；A20，S21；A20；

第二组引物探针的融合位点包括：E14ins2；del52A20，V7(E14；del12A20)，V4(E14ins11；del49A20)，E14；del36A20，V4”(E15del19；del20A20)，K15；del14A20。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，上游引物包含一种非完全匹配的特异引物，非完全匹配的特异引物的非匹配碱基位于引物中部，包含2至4个非匹配的随机碱基。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，

上游引物的序列包括：SEQ ID.NO 01～SEQ ID.NO 16；所述SEQ ID.NO 06为非完全匹配的特异引物，所述非完全匹配的特异引物的非匹配碱基位于引物中部，包含4个非匹配的随机碱基。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，下游引物序列包括：SEQ IDNO.17～SEQ ID.NO 18。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，探针序列包括：SEQ ID.NO20～SEQ ID.NO 21。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，荧光检测探针包括：TaqMan-MGB和分子信标探针。

前述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，分子信标探针5’端标记FAM，3’端修饰DABCYL，TaqMan探针5’端标记FAM，3’端修饰MBG。

用于检测人类ALK基因融合突变的试剂盒，包括：PCR检测体系，内控基因HBB，阴性对照；

PCR检测体系，包括：反应液I，反应液II；

反应液I包括：

反应液II包括：

第一组引物包括：E2-F，E2-F-1，E6-F，E13-F，E14-F1，E17-1-F，E17-2-F，E20-F，T5-F，K17-F，K24-F，TP15-F，H21-F，S21-F，A20-R1；

第一组探针为：A20-P1；

第二组引物包括：E14-F，K15-F，A20-R2；

第二组探针为：A20-P2。

用于检测人类ALK基因融合突变的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

引物探针设计，

在ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列上设计多条上游引物，ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列包括：EML4-exon2/6/13/14/17/20，TFG-exon5、KIF5B-exon15/17/24、TPR-exon15、HIPI-exon21、SEC31A-exon21；

在ALK exon 20上设计共用下游引物和荧光检测探针；

阳性样品的制备，

合成阳性质粒标准品28种，阴性质粒1种；

标本RNA提取，

使用RNA提取试剂盒提取RNA，经紫外分光光度计检测提取质量，所提RNA的A260/A280在1.8～2.0之间；

一步法逆转录PCR进行检测，

PCR检测体系，包括：反应液I，反应液II；

反应液I包括：

反应液II包括：

第一组探针为：A20-P1；

第二组引物包括：E14-F，K15-F，A20-R2；

第二组探针为：A20-P2；

设置反应程序；

内控基因HBB和阴性对照对样本提取质量和反应体系进行质控，根据标记物指示阳性结果；a)阳性对照：FAM通道有正常平滑扩增曲线；b)阴性对照：NTC在两个通道均无扩增曲线，野生型样本HEX通道有正常曲线；

结果判读：

a)当HEX通道有扩增曲线，FAM通道有扩增曲线，则样品为ALK融合阳性；

b)当HEX通道有扩增曲线，FAM通道无扩增曲线，则为ALK融合阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合形式。

本发明的有益之处在于：

本发明试剂盒解决了ALK突变谱覆盖度低的问题，可以涵盖多达28种ALK融合形式；

本发明试剂盒建立在一步法多重RT-PCR基础上，利用新型探针分子信标技术，建立了一种目前ALK融合检测位点更全、检测快速准确、高灵敏、高特异性的ALK融合基因的筛查工具和筛查方法；

本发明引物设计了高特异性的非完全匹配引物，非完全匹配引物与普通引物相比，是在引物中引入个别无关碱基，这一设计提高了体系的特异性；

本发明引物引入了分子信标技术，分子信标通常是一个具有发卡结构的寡核苷酸序列，长度在25至40bp，包括环区域和茎区域，环区域与靶序列特异结合，茎区域自身互补形成发卡结构，探针5'端标记荧光报告基团，3'端修饰淬灭剂，室温条件下，荧光报告基团与淬灭基团接近，根据荧光共振能量转移原理，荧光基团发出的光被淬灭基团淬灭；在PCR退火阶段，根据热力学原理，信标将优先和靶序列结合，发夹结构被打开，荧光恢复，可在此阶段进行荧光检测，由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线性探针；

使用了非完全匹配引物和分子信标探针进行检测，使试剂盒具有高灵敏度，可以检测出低至5-10拷贝的阳性模板，而且特异性高，能有效避免假阳性；

本发明的探针引物被分为2组，分2管反应体系，管1检测22种ALK融合，管2检测6种ALK融合，分两管检测的目的是缩短扩增产物长度，提高扩增效率和检测灵敏度，反应液II中检测的6种ALK融合突变均为ALK基因20号外显子存在碱基缺失，缺失范围为12-52bp，而其他22种ALK融合突变的ALK基因20号外显子上不存在碱基缺失，因此考虑到固定组织样本常存在核酸降解严重问题，本发明需要尽量缩短检测片段，提高检测灵敏度，因此选择在ALK基因20号外显子的缺失范围内部和缺失范围外围分别设计两条检测探针。

本发明建立的一步法逆转录检测方法，简化了操作、避免了污染。

附图说明

图1、图2为实验一分管检测对比考察结果图；

图3为实验二检测28种阳性质粒的扩增曲线图；

图4为实验二普通引物对E14-F/A20-R1扩出的一个非特异实验结果图；

图5为实验二将线性探针更改为分子信标探针后扩出的一个非特异实验结果图；

图6为实验二非完全匹配引物对E14-F1/A20-R1特异性验证结果图；

图7为实验二灵敏度分析扩增曲线图。

图8为临床样本突变阳性V1、V2扩增曲线图；

图9为临床样本野生型扩增曲线图；

图10为临床阳性样本V1融合测序图；

图11为临床阳性样本V2融合测序图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针，包括：在ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列上设计多条上游引物，在ALK exon 20上设计共用下游引物和荧光检测探针；ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列包括：EML4-exon2/6/13/14/17/20，TFG-exon5、KIF5B-exon15/17/24、TPR-exon15、HIPI-exon21、SEC31A-exon21。

上游引物包含一种非完全匹配的特异引物，非完全匹配的特异引物的非匹配碱基位于引物中部，包含2至4个非匹配的随机碱基。

上游特异引物可以是表4中的SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.16与ALK融合基因上游6种基因对应的引物及其组合，下游特异引物可以是表4中SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18与ALK基因20号外显子对应的引物及其组合，探针可以是表4中SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.21与ALK基因20号外显子对应的探针及其组合。内控基因引物探针可以是表4中SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.24对应的引物探针及其组合。

表1本发明覆盖的28种ALK基因融合突变

PCR反应体系配制

按表2用量配制反应液I、II，每个反应管检测的目标融合如表3。

表2：PCR体系组成

补充DEPC水至25～100μl。

本发明分2管反应体系，如表3所示28种融合位点分管检测情况，管1检测22种ALK融合，管2检测6种ALK融合，将引物探针分成两组；

PCR检测体系，包括：反应液I，反应液II；

反应液I包括：

反应液II包括：

第一组探针为：A20-P1；

第二组引物包括：E14-F，K15-F，A20-R2；

第二组探针为：A20-P2。

表3：28种融合位点分管检测情况

荧光检测探针包括：TaqMan-MGB和分子信标探针；分子信标探针5’端标记FAM，3’端修饰DABCYL，TaqMan探针5’端标记FAM，3’端修饰MBG。分子信标通常是一个具有发卡结构的寡核苷酸序列，长度在25至40bp，包括环区域和茎区域，环区域与靶序列特异结合，茎区域自身互补形成发卡结构，探针5'端标记荧光报告基团，3'端修饰淬灭剂，室温条件下，荧光报告基团与淬灭基团接近，根据荧光共振能量转移原理，荧光基团发出的光被淬灭基团淬灭；在PCR退火阶段，根据热力学原理，信标将优先和靶序列结合，发夹结构被打开，荧光恢复，可在此阶段进行荧光检测，由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线性探针。

(1)引物探针设计

根据COSMIC数据库和相关文献报道的28种ALK融合形式，分别在EML4-exon2/6/13/14/17/20，TFG-exon5、KIF5B-exon15/17/24、TPR-exon15、HIPI-exon21、SEC31A-exon21上设计多条上游引物，在ALK基因外显子20上设计下游共用引物、TaqMan-MGB和分子信标探针，5’端标记FAM荧光基团。以人类HBB基因为内控基因，设计特异性引物和TaqMan检测探针，5’端标记HEX荧光基团。上游引物可以是表4中的SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.16对应于ALK融合上游6种基因外显子序列的引物及其组合，下游引物可以是表4中SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18对应于ALK的20号外显子的引物及其组合，探针可以是表4中SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.21对应于ALK的20号外显子序列的探针及其组合。内控基因HBB的引物探针可以是表4中SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.24对应的序列及其组合。引物和探针均由专业公司合成并纯化，合成好的引物和探针使用Tris-HCl(pH8.3)进行溶解，并用NanoReady紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定，最后稀释至50μM，分装并保存在-20℃冰箱。

表4：引物探针序列信息

注：小写碱基为非匹配碱基，黑色加粗的碱基为分子信标的茎结构。

(2)基因组RNA提取

新鲜病理组织使用TIANGEN的RNA提取试剂盒进行提取；石蜡包埋组织或切片，建议采用Qiagen公司的FFPE组织RNA提取试剂盒(RNeasy FFPE Kit)进行提取。经紫外分光光度计检测提取质量，所提RNA的A260/A240应在1.8～2.0之间，提取后的RNA应立即进行检测，或溶于0.1％DEPC水中，若暂时不用请于-70℃以下保存。

(3)PCR反应体系

按表5、表6的用量配制PCR反应液I、II，每个反应管检测的目标融合如表3。

表5 PCR体系各成分组成(反应液I)

表6 PCR体系各成分组成(反应液II)

各组分名称	终浓度
		10x Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	1×
PCR增强剂	1.2μl
		dNTPs	0.25mM
E14-F	0.2μM
		K15-F	0.2μM
A20-R2	0.2μM
		A20-P2	0.1μM
HBB-F	0.4μM
		HBB-R	0.4μM
HBB-P	0.2μM
		酶混合液	0.6μl
模板	5μl
		总体积	25μl

(4)反应程序设定

表7 PCR程序

注：66℃时采集FAM、HEX通道的荧光。

(5)结果判读规则

质控标准：

a)阳性对照：FAM通道有正常平滑扩增曲线；

b)阴性对照：NTC在两个通道均无扩增曲线，野生型样本HEX通道有正常曲线。

结果判读：

实验一：引物探针分组进行反应和混合反应的对比实验

实验过程：

表8中列出了28种ALK融合突变的分管情况和各管检测的位点扩增产物长度，对比2管检测和1管检测的扩增效率，选择E6；A19、V6、E14ins2；ins56A20、E17del58；ins39A20、V8b、V5”、E14ins2；del52A20、V7、V4、E14；del36A20、V4”和K15；del14A20作为考察对象，使用其阳性质粒作为模板，浓度使用10^3copies/μl。

表8分管检测中各融合位点扩增产物长度

注：括号内为扩增产物长度。

实验设置两组，第一组为以上12种融合突变位点放在一管内检测，使用各上游引物、A20-P2探针和A20-R2引物；第二组为分两管检测，其中管1使用缺失范围内设计的探针A20-P和引物A20-R1，管2使用缺失范围外围的探针A20-P2和引物A20-R2，体系各成分按照表2的用量进行配置。

实验结果：

实验结果如图1和图2，图1中黑色曲线表示分两管检测时E6；A19、V6、E14ins2；ins56A20、E17del58；ins39A20、V8b和V5”6种阳性质粒的扩增曲线，灰色曲线为一管检测时的扩增曲线；图2中黑色曲线表示分两管检测时E14ins2；del52A20、V7、V4、E14；del36A20、V4”和K15；del14A206种阳性质粒的扩增曲线，灰色曲线为一管检测时的扩增曲线。

实验分析：

图1表明E6；A19、V6、E14ins2；ins56A20、E17del58；ins39A20、V8b和V5”6种阳性质粒在一管检测的Ct值比分两管检测时要靠后，说明扩增产物太长不利于检测灵敏度的提高。图2表明E14ins2；del52A20、V7、V4、E14；del36A20、V4”和K15；del14A206种阳性质粒在与其他位点混合检测时会影响自身扩增效率，Ct值稍靠后。对于固定包埋组织样本而言，扩增片段应尽量短，有助于提高阳性检出率，因此，本发明使用两管检测。

实验二，体系性能考察，实验验证非完全匹配引物提高了体系的特异性，实验验证分子信标进一步提高了体系的特异性；

以合成的28种阳性质粒和1份野生型石蜡包埋组织切片提取的RNA样品为模板，验证阳性质粒标准品，同时考察检测体系的特异性、灵敏度和重复性。

a)模板准备：将合成的阳性质粒用Tris-HCL溶解，定量稀释到40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个浓度梯度；提取野生型人类基因组RNA样品。

b)PCR检测体系的配制：单重体系按表2推荐用量配制，用于各对引物的特异性验证；多重体系，反应液I、II按表5、表6用量分别配制，两管检测的ALK融合形式如表3。

c)反应程序设置：95℃5min，1个循环；50℃30min，1个循环；95℃5min，1个循环；95℃15s，63℃40s，10个循环(不采光)；95℃15s，66℃40s(采光：FAM、HEX通道)，45个循环。

d)加样

阳性质粒验证：取40copies/μl浓度的各阳性质粒，各取5μl验证，设置NTC(无模板对照)。

特异性实验：考察各对引物的特异性，以野生型人类基因组RNA样品为模板，每管反应各做40个平行管，每反应孔加5μl，并设置阳性对照(质粒混合液)和NTC。

灵敏度实验：取40copies/μl、20copies/μl、10copies/μl、5copies/μl、2copies/μl、1copies/μl六个梯度质粒进行检测，单个反应加入5μL模板，每个浓度做4个复管，设置NTC对照。

重复性实验：取40copies/μl、20copies/μl作为模板，每个浓度重复检测10次，计算10次Ct值的重复性，设置NTC对照。

e)上机：选择ABI 7500或SLAN96P荧光PCR仪，按c)步骤中的程序运行实验。

f)结果分析：

阳性质粒验证：28种ALK阳性质粒均能出现良好的扩增曲线，NTC无信号，结果如图3。

特异性分析：引物对E14-F/A20-R1的40个平行管中出现了2个假阳性，其他各对引物均未出现假阳性。由于分子信标的杂交特异性明显高于常规的线性探针，将检测探针A20-P改为分子信标A20-P1，并重复实验，结果出现1个假阳性，但是扩增很靠后，说明分子信标进一步提高了体系的特异性。为了完全消除非特异，本发明采用特异性非完全匹配引物E14-F1，序列5’-ATCTGAATCCTGAgccgAAGAGAAATAG-3’，重复特异性实验，结果40个平行中均未出现非特异。结果如图4、图5和图6，其中，图4为普通引物对E14-F/A20-R1扩出的一个非特异，图5为将检测探针改为分子信标之后出现的一个非特异，图6为进一步将普通引物E14-F改成特异性非完全匹配引物E14-F1之后的特异性验证结果，无非特异。

灵敏度：使用了特异性非完全匹配引物并改用分子信标后的检测体系灵敏度较高，应管I和反应管II的灵敏度均可以做到1％，低至5-10拷贝，部分结果如图7。

重复性：10次Ct值的CV值小于5％，体系重复性好。

实验三，临床样本检测；

应用本试剂盒筛查临床非小细胞肺癌石蜡包埋组织样本720份，新鲜病理组织60份，男性459例，女性321例，年龄在29-71岁。

临床样本检测步骤如下：

a)肿瘤组织RNA的提取：使用专业试剂盒，按照说明书步骤进行RNA提取，经紫外分光光度计检测提取质量，所提RNA的A260/A240应在1.8～2.0之间。

b)PCR检测体系的配制：按表5、表6用量分别配制反应液I、II，各管检测的ALK融合形式如表3。

c)反应程序：95℃5min，1个循环；50℃30min，1个循环；95℃5min，1个循环；95℃15s，63℃40s，10个循环(不采光)；95℃15s，66℃40s(采光：FAM、HEX)，45个循环。

d)加样，每次临床样本检测中均做阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为质粒混合液，含有各个基因阳性对照品的序列；阴性对照是指无菌无核酸酶超纯水和野生型人类基因组RNA。

e)上机：选择AB 7500或SLAN96P荧光PCR仪，按c)程序运行。

f)结果判读：

体系质控标准：

阳性对照FAM通道有典型扩增曲线，阴性对照野生型RNA样本在HEX通道有扩增曲线，NTC在两个通道均无信号。

临床样本结果判读：

若临床样本FAM、HEX通道均有扩增曲线，则为ALK融合突变阳性；

若HEX通道有扩增曲线而FAM通道无扩增曲线，则为ALK阴性或低于本试剂盒的检测下限或标本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他稀有融合形式。

g)临床样本检测结果：740例非小细胞肺癌样本中有26例为ALK融合突变阳性，阳性率为3.3％，其中有18份为V1，4份为V2，4份为V3，其他均为野生型。以Sanger测序法为对照方法，将26份阳性样本进行测序验证，同时抽取40份野生型临床样本进行测序验证，得到的测序结果与本试剂盒检测结果一致率为100％。图8和图9为临床样本检测的典型结果图，其中，图8为V1、V2融合突变临床样本扩增结果图，图9为一份临床野生型样本的扩增结果图。图10为临床阳性样本V1测序结果图，图11为临床阳性样本V2测序结果图，黑色箭头处指示融合断裂点。

本发明提供一种用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法，试剂盒可以涵盖多达28种ALK融合形式，特异性、灵敏度高，能有效避免假阳性的试剂盒，建立的一步法逆转录检测方法，能够简化操作，避免污染。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 合肥欧创基因生物科技有限公司

<120> 用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法

<141> 2019-03-04

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 1

tggctgatgt tttgaggcgt cttg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 2

ccaggccatg ttgcagctga 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 3

accaaaactg cagacaagca taaaga 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 4

ccacacctgg gaaaggacct a 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 5

atctgaatcc tgaaagagaa atag 24

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial gene

<220>

<221> allele

<222> (14)..(17)

<223> gccg为非匹配碱基

<400> 6

atctgaatcc tgagccgaag agaaatag 28

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 7

gcaggtgtgc ctgtggaact c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 8

ggccatagga acgcactcag 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 9

ttgactggtc cccagacaac aagt 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 10

gcgtttggct taacagatga tcaggt 26

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 11

agacagttgg aggaatctgt cgatg 25

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 12

gcaaacgcta tcagcaagaa gtagatc 27

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 13

gaccttgcag aaataggaat tgctgtg 27

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 14

acaacaggag ttgccattcc attac 25

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 15

ctgcctcaga gccccacct 19

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 16

aggtaccacc ttatccacag cca 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 17

cagcttgtac tcagggctcg ca 22

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 18

cagtagttgg ggttgtagtc ggtc 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial gene

<220>

<221> mRNA

<222> (0)..(1)

<223> FAM

<220>

<221> mRNA

<222> (21)..(22)

<223> MGB

<400> 19

caagccatgc agatggagct g 21

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial gene

<220>

<221> mRNA

<222> (0)..(1)

<223> FAM

<220>

<221> mRNA

<222> (33)..(34)

<223> DABCYL

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(6)

<223> CGCACC为分子信标的茎结构

<220>

<221> mRNA

<222> (28)..(33)

<223> GGTGCG为分子信标的茎结构

<400> 20

cgcaccgcaa gccatgcaga tggagctggt gcg 33

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial gene

<220>

<221> mRNA

<222> (0)..(1)

<223> FAM

<220>

<221> mRNA

<222> (15)..(16)

<223> MGB

<400> 21

ctccgcacct cgacc 15

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 22

gaacgtggat gaagttggtg gtg 23

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial gene

<400> 23

cccaaaggac tcaaagaacc tctg 24

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial gene

<220>

<221> mRNA

<222> (0)..(1)

<223> HEX

<220>

<221> mRNA

<222> (21)..(22)

<223> BHQ1

<400> 24

aggctgctgg tggtctaccc t 21

Claims

1.用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针组合，其特征在于，包括：在ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列上设计上游引物，在ALK exon 20上设计共用下游引物和荧光检测探针；ALK融合基因中6种伴侣基因断裂外显子序列包括：EML4-exon2/6/13/14/17/20、 TFG-exon5、KIF5B-exon15/17/24、TPR-exon15、HIPI-exon21和SEC31A-exon21；包括两组引物探针组合；

第一组引物探针的融合位点包括：V5a(E2;A20)，V5b(E2;ins117A20)，V3a(E6;A20)，V3b(E6ins33;A20)，E6;A19，E6;ins18A20，V1(E13;A20)，V6(E13;ins69A20)，E14ins2;ins56A20，E17del58;ins39A20，V8a(E17;ins30A20)，V8b(E17ins61;ins34A20)，E17;ins68A20，V5”(E18;A20)，V2(E20;A20)，E20;ins18A20，T5;A20，K17;A20，K24;A20，TP15;A20，H21;A20和S21;A20；

第二组引物探针的融合位点包括：E14ins2;del52A20，V7(E14;del12A20)，V4(E14ins11;del49A20)，E14;del36A20，V4”(E15del19;del20A20)和K15;del14A20；

上游引物的序列如SEQ ID .NO 01~SEQ ID .NO 16所示；所述SEQ ID .NO 06为非完全匹配的特异引物，所述非完全匹配的特异引物的非匹配碱基位于引物中部，包含4个非匹配的随机碱基；

下游引物序列如SEQ ID NO. 17~SEQ ID .NO 18所示；

探针序列如SEQ ID .NO 20~SEQ ID .NO 21所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针组合，其特征在于，荧光检测探针包括：TaqMan-MGB和分子信标探针。

3.根据权利要求2所述的用于检测人类ALK基因融合突变的引物、探针组合，其特征在于，分子信标探针5’端标记FAM，3’端修饰DABCYL，TaqMan探针5’端标记FAM，3’端修饰MBG。

4.用于检测人类ALK基因融合突变的试剂盒，其特征在于，包括：PCR检测体系，内控基因HBB，阴性对照；

PCR检测体系，包括：反应液

，反应液

；

反应液

包括：

10x Taq缓冲液 1×，

PCR增强剂 0.8-1.2μl，

dNTPs 0.2-0.3 mM，

第一组引物 0.1-0.4 μM，

第一组探针 0.1-0.2 μM，

酶混合液 1-4U，

模板 5-25μl，

补充DEPC水至 25-100μl；

反应液

包括：

10x Taq缓冲液 1×，

PCR增强剂 0.8-1.2μl，

dNTPs 0.2-0.3 mM，

第二组引物 0.1-0.4 μM，

第二组探针 0.1-0.2 μM，

酶混合液 1-4U，

模板 5-25μl，

补充DEPC水至 25-100μl；

第一组引物包括：E2-F，E2-F-1，E6-F，E13-F，E14-F1，E17-1-F，E17-2-F，E20-F，T5-F，K17-F，K24-F，TP15-F，H21-F，S21-F和A20-R1；

第一组探针为：A20-P1；

第二组引物包括：E14-F，K15-F和A20-R2；

第二组探针为：A20-P2；

所述引物和探针序列如下表所示：

序列引物、探针名称 SEQ ID NO.01 E2-F SEQ ID NO.02 E2-F-1 SEQ ID NO.03 E6-F SEQ ID NO.04 E13-F SEQ ID NO.05 E14-F SEQ ID NO.06 E14-F1 SEQ ID NO.07 E17-1-F SEQ ID NO.08 E17-2-F SEQ ID NO.09 E20-F SEQ ID NO.10 T5-F SEQ ID NO.11 K17-F SEQ ID NO.12 K24-F SEQ ID NO.13 K15-F SEQ ID NO.14 TP15-F SEQ ID NO.15 H21-F SEQ ID NO.16 S21-F SEQ ID NO.17 A20-R1 SEQ ID NO.18 A20-R2 SEQ ID NO.19 A20-P SEQ ID NO.20 A20-P1 SEQ ID NO.21 A20-P2

。