JP2015536676A - 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリｄｎａを検出するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、慢性胃炎を引き起こす細菌、即ち、ヘリコバクターピロリを、糞便サンプルから検出するための、ＰＣＲに基づく方法を提供する。本発明は、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド プライマーとオリゴヌクレオチド プローブとの使用に基づくものである。【選択図】なし

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断的アッセイの分野に属する。さらに詳しくは、本発明は、慢性胃炎を引き起こす細菌、即ち、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）を、糞便サンプルから検出するための、ＰＣＲに基づく方法を提供する。本発明は、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド プライマーとオリゴヌクレオチド プローブとの使用に基づくものである。

ヘリコバクターピロリは、グラム陰性で微好気性の細菌であり、慢性胃炎を引き起こす。世界の人口の約半分がこの細菌に感染していると見積もられている。ヘリコバクターピロリに感染している人の大部分は、胃炎であるが症状を示さず、少数の者が深刻な続発症状を示すようになる。ヘリコバクターピロリは、十二指腸潰瘍や胃潰瘍の発症の主たる因子であり、非噴門部胃癌の最も普通の単一の危険因子である。ヘリコバクターピロリ感染の除菌治療に成功すれば、消化性潰瘍性疾患の治癒につながるし（Ford et al, 2003）、潰瘍に罹っていない一部の患者においてさえ消化不良症状の長期にわたる緩和につながる（Ford et al., 2004）。ヘリコバクターピロリ感染除菌治療は、低グレードの粘膜関連リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）の一次治療としても推奨されるし、疫学調査に基けば、ヘリコバクターピロリ除菌治療の成功は、胃癌の件数を減らすことにつながる可能性がある（Kosunen et al, 2011 及び Chey and Wong, 2007）。

ヘリコバクターピロリ感染の検出のための診断方法は、侵襲的方法（胃内視鏡検査を必要とする）と非侵襲的方法とに分類することができる。いくつかの方法は高度に正確な結果を与えるが、ヘリコバクターピロリ感染の診断のための単一の至適基準は存在せず、臨床状況に合わせて方法を選択しなければならず、胃内視鏡検査を必要とすることもある。「検査−治療」戦略によると、胃癌の危険性が低い患者は、非侵襲的方法でヘリコバクターピロリの検査を行うことができ、もしヘリコバクターピロリが検出されれば治療を行うことができる。

尿素呼気試験、便中抗原試験などの非侵襲的診断方法は、一般に、高度に正確な検出率を示すけれども、これらの方法はヘリコバクターピロリ感染性単離物の抗菌物質感受性に関する情報を全然与えない。さらに、胃内視鏡検査の際に胃生検を行い、採取物を培養しても、培養物の感度が低いために、抗菌物質感受性試験の結果は、通常、すべての陽性の場合について得られるわけではない。しかし、ヘリコバクターピロリの抗菌物質感受性試験の必要性は高まっている。ヘリコバクターピロリの除菌治療は、通常、２つの異なる抗菌剤と、プロトンポンプ阻害剤とを用いる。クラリスロマイシンは、この古典的な３剤療法の重要な構成要素であるが、クラリスロマイシン耐性を有するヘリコバクターピロリの場合には、クラリスロマイシンに基づく療法は、大多数の場合において、除菌に失敗する（Fischbach and Evans, 2007）。

クラリスロマイシン耐性を有するヘリコバクターピロリの割合の増大（Malfertheiner et al., 2012）のために、最新のヨーロッパの指針では、培養物が利用できない場合には、胃生検におけるヘリコバクターピロリの検出には分子生物学的検査を利用し、また、抗菌物質感受性試験を行うよう推奨している。分子生物学的手法はヘリコバクターピロリの検出のために開発されたものであり、同時に行う抗菌物質感受性試験は単離物のクラリスロマイシン感受性の検査のために開発されたものである。ヘリコバクターピロリのクラリスロマイシン耐性は、周知であり、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のペプチジルトランスフェラーゼ領域内の点変異に起因する。

胃粘膜におけるヘリコバクターピロリの感染が臨床上重要であることから、糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するための、ＰＣＲに基づくいくつかの診断方法が開発されてきた。しかし、感度が低いという問題がしばしば生じた。感度の低さは、糞便サンプル中に完全なヘリコバクターピロリＤＮＡが存在しないことに起因している可能性がある。生育できる形で糞便中に高い濃度で検出される腸内細菌性病原体とは対照的に、生きているヘリコバクターピロリは全然存在しない可能性が最も高く、したがって、そのＤＮＡは分解された形でのみ存在するであろうし、このことが検出をより困難にする。ＰＣＲに基づくいくつかの方法は、胃生検におけるヘリコバクターピロリの検出とクラリスロマイシン感受性の検査とにおいて正確な結果を与えているが、これらの方法を糞便サンプルに用いた場合には問題が生じている。ＰＣＲ阻害剤（Monteneiro, 1997）、糞便サンプルにおける大抵は断片化されたヘリコバクターピロリＤＮＡの低い濃度、といったいくつかの大きな制約のために、感度が十分に高い方法を開発することは困難であった。ＰＣＲに基づく方法は、糞便サンプルに適用した場合には、約６０％の感度を示すにすぎない（Lottspeich, 2007 etc）。本研究の目的は、糞便サンプルからの単離物中の、ヘリコバクターピロリの検出と、それに付随するクラリスロマイシン感受性検査とのための、高度に正確な非侵襲的方法を開発することであった。

Schabereiter-Gurtner et al. (2004) は、糞便サンプル中の、ヘリコバクターピロリ感染の検出と、同時に行うクラリスロマイシン感受性検査とのためのリアルタイムＰＣＲアッセイを開示した。彼らは、実際に、クラリスロマイシン耐性と関係するヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の点変異を検出した。しかし、Lottspeich et al. (2007) は、その方法の評価を行い、リアルタイムＰＣＲによる糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡの検出は困難な課題であって、その方法はヘリコバクターピロリ感染の正確な診断のための糞便抗原ＥＩＡの代わりとなることはできない、と結論した。その後、Scaletsky et al. (2011) は、一部の陽性結果を見逃している可能性を考慮しなければならないけれども、その方法はヘリコバクターピロリのクラリスロマイシン感受性の検査のためには適切であることを見出した。ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマー及び／又はプローブを開示した他の文献としては、Fontana et al. ,2003、Noguchi et al., 2007、Dewhirst et al., 2005、Maeda et al., 1998、Khan et al., 2004 及び Rimbara et al., 2005 が挙げられる。

２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子以外を標的遺伝子としてヘリコバクターピロリを検出するためのＰＣＲアッセイを開示した文献としては、Falsafi et al., 2009、Singh et al., 2008、Monteiro et al., 2001、Makristathis et al., 1998、Mishra et al, 2008 及び Burucoa et al., 1999 が挙げられる。

ＰＣＲアッセイの開発において、最も重要な因子の１つは、信頼できる種特異的な増幅、検出及び定量を可能にするオリゴヌクレオチド配列の位置を突き止めることである。最も重要なことは、ヘリコバクターピロリを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドのセットは、サンプル中に存在する可能性のある他のいかなる種に由来するＤＮＡとも交差反応を起こしてはならないということである。そのような配列を発見することは、少なくとも次の理由（１）〜（３）により、決して容易ではない。
（１）多くの種は、比較的に密接に関連しており、各々の種に特有の配列の位置を突き止めることを困難にしている。
（２）単一の種に由来する病原体株は、遺伝子的に多様化している可能性があり、１つの種におけるすべての株を均等に効率的に増幅することを可能にする配列の位置を突き止めることを困難にしている。
（３）サンプルはＰＣＲ阻害剤を含む可能性があり、また、本発明の場合には、ヘリコバクターピロリは典型的には胃粘膜中に生息して大腸においては死滅して分解している可能性が高いので、サンプルに含まれるのは主に断片化した標的ＤＮＡである。
したがって、糞便サンプルから病原体ＤＮＡを効果的に増幅するためには、高いＰＣＲ効率（できる限り１００％に近いことが最適である）を可能にするオリゴヌクレオチド設計を必要とする。

従来技術と比較すると、本発明は少なくとも次の主要な利点を有する。外部プライマーと内部プライマーとにおける融解温度（Ｔｍ）の差が最適化され、より簡単な反応ルーチンを達成する。たとえば、本発明のネステッドＰＣＲ反応は、単一の容器を用いて行うことができる。一方、Rimbara et al, 2005 及び Noguchi et al., 2007 は、ネステッドＰＣＲ反応を順次に２つの別の反応で行う方法を開示している。本発明のＰＣＲ反応の堅牢性は、また、Rimbara et al, 2005 で行われたようなフェノール抽出や Noguchi et al., 2007 で行われたようなサンプルのホモジナイゼーションによって糞便サンプルからＤＮＡを単離し精製する必要がないという水準にある。さらに、Rimbara et al, 2005 や Noguchi et al., 2007 におけるネステッドＰＣＲの第２反応において増幅されるアンプリコンの長さは、長過ぎて、リアルタイムＰＣＲにおいて高感度に検出されるものではない。内部プライマーによって増幅されるアンプリコンの長さは、本発明では１４３ｂｐであるのに対し、Rimbara では４６３ｂｐ、Noguchi では３６７ｂｐである。

Fontana et al., 2003、JP 2005-168474 及び Booka et al., 2005 による開示は、ネステッドＰＣＲ反応に関するものではなく、したがって、開示されているプライマーは、修飾を施さない限り、ネステッドＰＣＲ反応に用いることはできない。さらに、Fontana et al., 2003 において増幅されるアンプリコンの長さは、９９１ｂｐであって、リアルタイムＰＣＲにおいて検出するには長過ぎる。また、Fontana et al. は、Noguchi et al. とは、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅される領域が異なることにも注意すべきである。したがって、従来技術は、明らかに、ヘリコバクター株の存在のＰＣＲに基づく検出のための標的領域として適切な２３Ｓ ｒＲＮＡの領域については、複数の選択肢がある、ということを教示している。JP 2005-168474 においては、プライマーはヘリコバクターに特異的ではなく、カンピロバクター株との交差反応をも示すようである。

ヘリコバクターピロリを検出するための、ＰＣＲに基づく数多くのアッセイが既に開示されているけれども、依然としてこの分野において、検出のための高い特異性及び信頼性を提供することができるＰＣＲアッセイが必要とされている。本発明者らは、この度、糞便から得たヘリコバクターピロリＤＮＡの特異的で高感度の増幅に驚くべきほどよく適する、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列領域の位置を突き止めた。本発明において、患者におけるヘリコバクターピロリの存在の同定のために最適なプライマーと定量的ＰＣＲプローブとが、設計され、その有効性が示される。

本発明は、糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するための方法であって、以下の工程を包含することを特徴とする方法を提供する。
（ａ）糞便サンプルから単離したＤＮＡをテンプレートとし、増幅反応においてヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のヘリコバクターピロリ特異的標的配列の増幅に特異的なオリゴヌクレオチド プライマー セットを用いるＰＣＲ反応を行い、ただし、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むものであり、そして
（ｂ）該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が増幅されると該糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出する。

本発明は、また、配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチド プライマー セットであって、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチド プライマー セットを提供する。

本発明は、さらに、糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するためのキットであって、上記のオリゴヌクレオチド プライマー セットと、ＰＣＲ反応において核酸の増幅を行うための試薬とを含むことを特徴とするキットに関する。

保存領域プローブ（ＪＯＥ）により、ヘリコバクターピロリ陽性という結果を得、また、クラリスロマイシン耐性変異の存在についても陽性という結果を得た（ＲＯＸ）。さらに、内部対照は陽性である。クラリスロマイシン感受性遺伝子型を検出する野生型のプローブ（ＦＡＭ）は、陰性である。 保存領域プローブ（ＪＯＥ）により、ヘリコバクターピロリ陽性という結果を得、また、クラリスロマイシン耐性変異のないものの存在についても、野生型のプローブ（ＦＡＭ）により、陽性という結果を得た。さらに、内部対照（ＣＹ５）は陽性である。クラリスロマイシン耐性変異を検出する耐性変異プローブ（ＲＯＸ）は、陰性である。 ヘリコバクターピロリについては陰性という結果を得た。内部対照のみが陽性であり、ＰＣＲ阻害は検出されなかった。

本願明細書において、核酸サンプル中に存在する「標的配列」とは、「プライマー」によってプライムされ伸長されるヘリコバクターピロリＤＮＡの鎖を言う。標的配列は、一本鎖でもよいし、相補的な配列との二本鎖でもよい。一定の態様においては、標的配列は、核酸サンプル中には存在せず、該核酸サンプル中に存在する他の核酸からの転写によって後の段階において生ずるものであってもよい。標的配列は、実施するアッセイの目的に応じて、任意の数の起源から取ってよい。本発明の標的配列は、本願明細書に記載される増幅反応の前に或る程度精製される。

本願明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、又は、本発明のＤＮＡ増幅方法において試薬として用いる関連化合物が、２個又は３個以上結合してなるポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよいし、それらのアナログでもよいし、これらのいずれか２つ以上の混合物でもよい。「オリゴヌクレオチド」という用語は、試薬としての特定の機能を有することを意味するものではなく、本願明細書に記載される試薬を総称的に表すものである。以下、本発明の特異的オリゴヌクレオチドについてさらに詳しく説明する。本願明細書において、オリゴヌクレオチドは、実質的にどんな長さのものであってもよく、単に、ＤＮＡ増幅反応における特異的な機能によって限定されるだけである。一定の配列と化学構造とを有するオリゴヌクレオチドは、当業者に知られている技術、たとえば、化学的・生化学的合成、組み換え核酸分子（細菌ベクター、ウイルスベクターなど）を用いた in vitro 発現又は in vivo 発現などの技術によって製造することができる。オリゴヌクレオチドは、その望ましい機能が損なわれない限り、どのような修飾を施してもよい。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドに施される修飾が適切ないし望ましいものであるかどうかを容易に判断することができる。修飾の例として、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計及び配列決定は、以下に説明する機能に応じてなされるものであるが、一般にはいくつかの変数を考慮しなければならない。これらの変数の中で最も重要なものは、長さ、Ｇ／Ｃ含有量、融解温度（Ｔｍ）、ギブス自由エネルギー（Ｇ）、特異性、自己相補性、システム中に存在する他のオリゴヌクレオチドとの相補性、ポリピリミジン伸長（Ｔ、Ｃの場合）又はポリプリン伸長（Ａ、Ｇの場合）、３'−末端配列、などである。上記の変数及び他の変数を制御することは、オリゴヌクレオチドの設計において標準的で周知な操作であって、容易に入手できる各種のコンピュータープログラムを用いて、必要とされる条件を満たす可能性のある多数のオリゴヌクレオチドのスクリーニングを行って最適のものを選び出すことができる。

本願明細書において、「ＰＣＲ増幅をする」又は「ＰＣＲ増幅」という用語は、相補鎖にハイブリダイズするプライマーを用いた、サイクル的な、ポリメラーゼに媒介される核酸の指数関数的な増幅を意味する。これについては、たとえば、Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) を参照することができる。特定の波長の光線を放出することができる蛍光指示薬を含む組成物との熱サイクル反応を行い、蛍光色素の強度を読み取り、各サイクル後の蛍光強度を表示することができる装置が開発されている。増幅産物は、標的核酸配列又はその相補体との配列同一性を有する配列を含み、その検出は、たとえば、当該標的核酸配列又はその相補体の或る領域に対して特異性を有する挿入色素（intercalating dye）又は検出プローブを用いて行うことができる。本発明のＰＣＲ反応は、好ましくは、リアルタイムＰＣＲアッセイとして行う。本願明細書において、「プローブ」という用語は、増幅の表示となるシグナル分子を意味する。このような分子は数多くあり、どのようなものでもよい。検出プローブの例として、SYBR（登録商標）Green や、他の核酸結合色素を挙げることができる。検出プローブは、配列に基づくプローブ（５'−ヌクレアーゼプローブなど）であってもよい。多様な検出プローブが当分野において知られており、例として、TaqMan（登録商標）プローブが挙げられる（米国特許第 5,538,848 号を参照）。プローブの融解温度（Ｔｍ）は、修飾ヌクレオチドの付加によって上昇させることができる。１つのプローブにおける修飾ヌクレオチドの数は、１、２、３、４又は５以上である。修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド（Exiqon A/S）、小溝結合剤（MGB（登録商標））、超塩基（SuperBase）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、プローブの融解温度を上昇させる他の修飾物であってもよい。

ヘリコバクターピロリは上部腸管に存在する病原体であるから、ヘリコバクターピロリＤＮＡは糞便においては低い濃度でのみ存在する。したがって、糞便サンプルから単離したＤＮＡをテンプレートとして用いるＰＣＲアッセイによって正確な結果を得るためには、高度な特異性と感度とを有するプライマーを正しく選択することが決定的に重要である。本発明は、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも１つの標的配列を増幅するための方法及びオリゴヌクレオチド プライマー セットを提供する。本発明において開発されたアッセイは、ヘリコバクターピロリ感染を高い感度で検出することができ、同時にクラリスロマイシン耐性の評価を行うことができる。本発明の効果は、外部プライマー（即ち、配列番号１の配列及び配列番号２の配列）の標的部位の選択に、特に関係する。

したがって、本発明は、糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するための方法であって、以下の工程を包含することを特徴とする方法に関する。
（ａ）糞便サンプルから単離したＤＮＡをテンプレートとし、増幅反応においてヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のヘリコバクターピロリ特異的標的配列の増幅に特異的なオリゴヌクレオチド プライマー セットを用いるＰＣＲ反応を行い、ただし、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むものであり、そして
（ｂ）工程（ａ）において該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が増幅されるときには該糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出する。

ネステッドＰＣＲ反応は、通常、感度を高めるので、本発明におけるＰＣＲ反応はネステッドＰＣＲ反応であることが好ましい。したがって、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含む第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットを、該ＰＣＲ反応に用いてもよい。該第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットは、或るヘリコバクターピロリ株のクラリスロマイシン耐性に関連する点変異の部位の増幅に関わる。したがって、本発明の方法はさらに、ヘリコバクターピロリのクラリスロマイシン耐性に関連する、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の変異の検出にも関する。該変異の存在は、該遺伝子、好ましくは配列番号１３（GenBank: U27270.1）の第２５１４番及び／又は第２５１２番の位置における変異の存在、を検出する１又は２以上のプローブによって検出することができる。好ましくは、該変異は、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブ及び／又は配列番号８のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブによって検出する。さらに、該変異の検出のために、配列番号５及び／又は６のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなる１又は２以上のプローブ、又は、配列番号５及び／又は６の配列を含み若しくは該配列からなる１又は２以上のプローブを用いることができる。

本発明の方法の最も好ましい態様の１つは、工程（ａ）及び（ｂ）を単一の容器を用いて行うことである（たとえば、Strauss et al., 2000 を参照）。この手法は、汚染の危険度を下げる。この目標を達成するためには、第１及び第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットの融解温度を、両者の融解温度の差が少なくとも３℃、好ましくは少なくとも３．５℃又は４℃となるように設計しなければならない。

配列番号１の配列と配列番号２の配列とからなる第１のオリゴヌクレオチド プライマー セットの、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子における標的配列は、配列番号１３の第１９３７番〜第２７９３番の位置にある配列である。

配列番号３の配列と配列番号４の配列とからなる第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットの、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子における標的配列は、配列番号１３の第２４８２番〜第２６２４番の位置にある配列である。

好ましくは、該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が増幅されるときの該糞便サンプル中のヘリコバクターピロリの検出は、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射線測定、蛍光測定又は燐光測定を用いて行う。当業者は、本発明のプライマー及びプローブを、ＰＣＲを利用する他の方法及びプラットフォームに用いてもよい。

本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチド プライマー セットであって、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチド プライマー セットを提供する。好ましくは、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のヌクレオチド配列とを含み又は該２つの配列からなる。

好ましくは、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとをさらに含む。さらに好ましくは、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のヌクレオチド配列とを含み又は該２つの配列からなる。

該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブ、及び／又は、配列番号８のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブをさらに含んでもよい。さらに好ましくは、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号７のヌクレオチド配列と配列番号８のヌクレオチド配列とを含み又は該２つの配列からなる。最も好ましくは、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号５のヌクレオチド配列と配列番号６のヌクレオチド配列とをさらに含み又は該２つの配列からなる。

本発明はまた、糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するためのキットであって、上記のオリゴヌクレオチド プライマー セットのうち少なくとも１つと、ＰＣＲ反応において核酸の増幅を行うための試薬とを含むことを特徴とするキットを提供する。好ましくは、該試薬はＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びバッファーからなる群より選ばれる。

本発明の背景を説明するために（特に、本発明の実施に関して追加的な詳細を提供するために）本願明細書で用いられた刊行物及び他の資料は、言及によって本願明細書に組み入れられたものとする。以下の実施例において本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

実験
設計における目的は、ヘリコバクターピロリに高度に特異的なＰＣＲであって他の密接に関連する種を増幅しないものを開発することであった。配列を確認済のヘリコバクターピロリ株（クラリスロマイシン耐性変異を有するものと、クラリスロマイシン耐性変異を有しないものとの両方）を用いて、新規なアッセイを開発し最適化した。次に、臨床的に関連のある病原性の細菌種と、非病原性の細菌種との合計５０種（グラム陰性の種とグラム陽性の種とを含む）について、分析特異性を検査した。有意の交差反応は検出されなかった。陽性と判定される増幅産物についての９５％信頼区間の分析感度は１０ｆｇであった。これは、ゲノムの２コピー又は１つの細菌に対応する。胃生検、組織学及びヘリコバクター培養物を用いて、至適基準の参照方法である抗菌物質感受性検査を含め、臨床上の感度及び特異性を分析した。検査した患者サンプル（全部で８０）のうち、９４％のサンプルにおいて正しい同定がなされ、９０％のサンプルにおいて正しい抗菌物質感受性が測定された。対照として、Oryza sativa の頂生花遺伝子 Ory から得たテンプレートを用いた。

核酸抽出
キット（bioMerieux NucliSens Kits）と、抽出用の半自動化 easyMAG 器具とを用いて、全核酸を抽出した。包括的Ｂプロトコルと特異的Ｂプロトコルとの両方を検査して成功した。特異的Ｂプロトコルは、定量ＰＣＲ性能においてやや良好であり、すべての実験において選択した。製造者の説明書に従い、白金耳量の糞便（約１０％の溶液）をキットの細胞溶解バッファーの２ｍＬに入れ、５秒間強く掻き混ぜ、少なくとも１５分間、室温でインキュベートした。抽出量は２５μｌであった。

ＰＣＲのセットアップとオリゴヌクレオチド
下記のＰＣＲプログラムとオリゴヌクレオチドのセットとを、Stratagene MxPro 3005P を用いて行うすべてのアッセイにおいて使用した。

１ ９５℃で１３分間
２ ９４℃で６０
３ ６８℃で９０秒
４ 工程２〜３を５サイクル
５ ９４℃で３０秒
６ ６８℃で６０秒
７ 工程２〜３を１５サイクル
８ ９４℃で２５秒
９ ６４℃で２５秒
１０ 工程８〜９を４０サイクル

プライマー
外部プライマー
Hpy_sel_003_ F GCTAGTCTAAGGGCGTAGATTGGAGGGAAG（配列番号１）
Hpy_sel_003_ R GCTTGTGCCATTACACTCAACTTGCGATTTC（配列番号２）

内部プライマー
F_Hpyin_06 GGTGAAAATTCCTCCTACC（配列番号３）
R_Hpyin_06 CAAGGATGGCTCCATAAG（配列番号４）

対照
F_ORY_004 CTAATCCCAGCAACCCAACC（配列番号９）
R_ORY_004 CTAATCAATGTGAGACATATGATAGAAATC（配列番号１０）

プローブ
P_Hpy2142wt_02_ FAM CAAGACGGAAAGACCC（配列番号５）
P_Hpyall_02_JOE CAAAGCCTCCCACCTATCCTGCG（配列番号６）
P_Hpy2143G_06_TEX CAAGACGGAGAGACCC（配列番号７）
P_Hpy2142GG_05_TEX CAAGACGGGAAGACCC（配列番号８）
P_Ory_4_Cy5 CCTGCACTGGTAAGCTATG（配列番号１１）

上記のリストにおいて下線を付したヌクレオチドは、プローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させるＬＮＡヌクレオチド（Exiqon A/S）である。

合成 Ory テンプレート

TGCTCCTAATCCCAGCAACCCAACCTTGAGGGAATACCTGCACTGGTAAGCTATGCTCTTGCAATTGTTGTGATTTCTATCATATGTCTCACATTGATTAGTGATCTA（配列番号１２）

反応ミックス

dH2O ２．８５μｌ
Qiagen NoRox マスターミックス １２．５μｌ
Hpy_sel_003_ F ０．１２５μＭ ０．１５μｌ
Hpy_sel_003_ R ０．１２５μＭ ０．１５μｌ
F_Hpyin_06 ０．８μＭ １μｌ
R_Hpyin_06 ０．８μＭ １μｌ
F_ORY_004 ０．１２５μＭ ０．１５μｌ
R_ORY_004 ０．１２５μＭ ０．１５μｌ
P_Hpy2142wt_02_
FAM ０．２μＭ ０．２５μｌ
P_Hpyall_02_JOE ０．２８μＭ ０．３５μｌ
P_Hpy2143G_06_TEX ０．２８μＭ ０．３５μｌ
P_Hpy2142GG_05_TEX ０．２８μＭ ０．３５μｌ
P_Ory_4_Cy5 ０．２μＭ ０．２５μｌ
合成 Ory テンプレート １０ｅｘｐ−１１ ０．５μｌ
テンプレート ５μｌ
プレミックス合計量 ２５μｌ

初めの変性及びポリメラーゼ活性化の後、長い伸長時間の５サイクルは、最適でないゲノムＤＮＡからの増幅効率を向上させるために利用した。少しばかりの初めのコピーを得た後、長い特異的増幅段階をさらに１５サイクル続けたが、後続する工程（即ち、工程８〜１０）では増幅効率を最大化するためのことはもう行わなかった。驚くべきことに、２０（即ち、５＋１５）回のサイクルよりも長く最初の段階を行うと、クラリスロマイシン耐性変異検出段階において、感度を下げ、早過ぎる増幅の危険を生じたのであって、これはデータ分析における大きな問題につながるものである。アニーリング温度は、すべてのプローブが単一のヌクレオチド変異を検出することができるように、注意深く同様に最適化した。融解温度がかなり低いという条件（この条件は、初めの方で行う高温特異的増幅段階において生ずると推定される意図しないプローブ結合を避けるために必要であった）のために、高感度のプローブを設計することは困難であった。

保存領域プローブ（ＪＯＥ）により、ヘリコバクターピロリ陽性という結果を得、また、クラリスロマイシン耐性変異の存在についても陽性という結果を得た（ＲＯＸ）。さらに、内部対照は陽性である。クラリスロマイシン感受性を検出する野生型のプローブ（ＦＡＭ）は陰性である。結果については、図１を参照。

ＦＡＭ（緑）：クラリスロマイシン変異ホットスポット中の野生型の遺伝子型。陽性であるときは、クラリスロマイシン耐性変異は存在しない。クラリスロマイシンと組み合わせた治療は、成功する可能性が高い。

ＪＯＥ（黄）：ラギング鎖における高度保存領域で、クラリスロマイシン耐性変異が存在するかどうかに関わり無く、サンプル中にヘリコバクターピロリが存在することを示す。
注意： もし新規な、又は二重の変異が現れれば、ＪＯＥは内部対照（存在するクラリスロマイシン耐性遺伝子型）を別とすれば唯一の陽性プローブである。

ＲＯＸ（赤）：クラリスロマイシン耐性に関連するＡ２１４２Ｇ又はＡ２１４３Ｇの位置における変異。最もよく見られる型が検出される。

ＣＹ５（極赤）：阻害対照。

保存領域プローブ（ＪＯＥ）により、ヘリコバクターピロリ陽性という結果を得、また、クラリスロマイシン耐性変異のないものの存在についても、野生型のプローブ（ＦＡＭ）により、陽性という結果を得た。さらに、内部対照（ＣＹ５）は陽性である。クラリスロマイシン耐性変異を検出する耐性変異プローブ（ＲＯＸ）は陰性である。結果については、図２を参照。

ヘリコバクターピロリについては陰性という結果を得た。内部対照のみが陽性であり、ＰＣＲ阻害は検出されなかった。結果については、図３を参照。

文献
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Claims (19)

1. 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するための方法であって、以下の工程を包含することを特徴とする方法。
   （ａ）糞便サンプルから単離したＤＮＡをテンプレートとし、増幅反応においてヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のヘリコバクターピロリ特異的標的配列の増幅に特異的なオリゴヌクレオチド プライマー セットを用いるＰＣＲ反応を行い、ただし、該オリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むものであり、そして
   （ｂ）該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が増幅されると該糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出する。
2. 該ＰＣＲ反応がネステッドＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットを該ＰＣＲ反応に用い、ただし、該第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットは、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むものであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 該オリゴヌクレオチド プライマー セットが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 該第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
6. 該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が配列番号１３の第１９３７番〜第２７９３番の位置にあるヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド領域であり、該ヌクレオチド領域の少なくとも一部が該ＰＣＲ反応によって増幅されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 該第２のオリゴヌクレオチド プライマー セットの該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が配列番号１３の第２４８２番〜第２６２４番の位置にあるヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド領域であり、該ヌクレオチド領域の少なくとも一部が該ＰＣＲ反応によって増幅されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. ヘリコバクターピロリのクラリスロマイシン耐性に関連するヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の変異を、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなる第１プローブと、配列番号８のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなる第２プローブとによってさらに検出することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 該第１プローブが配列番号７のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなり、該第２プローブが配列番号８のヌクレオチド配列を含み又は該配列からなることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 該ヘリコバクターピロリ特異的標的配列が増幅されるときの該糞便サンプルからのヘリコバクターピロリＤＮＡの検出を、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射線測定、蛍光測定又は燐光測定を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 工程（ａ）及び（ｂ）を単一の容器を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. リアルタイムＰＣＲアッセイとして行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチド プライマー セットであって、ヘリコバクターピロリの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチド プライマー セット。
14. 配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドとをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド プライマー セット。
15. 配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブと、配列番号８のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドからなるプローブとをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド プライマー セット。
16. 配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のヌクレオチド配列とを含み又は該２つの配列からなることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド プライマー セット。
17. 配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のヌクレオチド配列とを含み又は該２つの配列からなることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド プライマー セット。
18. 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリＤＮＡを検出するためのキットであって、請求項１３〜１７のいずれかのオリゴヌクレオチド プライマー セットと、ＰＣＲ反応において核酸の増幅を行うための試薬とを含むことを特徴とするキット。
19. 該試薬がＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びバッファーからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。

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