CN104919058B - 用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌dna的方法 - Google Patents

用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测粪样品中的慢性胃炎引起性细菌(即幽门螺旋杆菌)的基于PCR的方法。本发明基于对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因特异性的寡核苷酸引物和探针的使用。

Description

用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的方法
本发明涉及基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断测定法领域。更具体而言，本发明提供了用于检测粪样品中的慢性胃炎引起性细菌(即幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori))的基于PCR的方法。本发明基于对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因特异性的寡核苷酸引物和探针的使用。
发明背景
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性和微需氧的细菌，其引起慢性胃炎。估计约一半的世界人口被此细菌感染。尽管有胃炎，大多数幽门螺旋杆菌感染个体是无症状的，但是少数会形成重度后遗症。幽门螺旋杆菌是形成十二指肠或胃溃疡中的关键因素及非贲门胃癌的最常见单一风险因素。幽门螺旋杆菌感染的成功根除导致消化性溃疡病的治愈(Ford等,2003)，并且即使在一些没有溃疡的患者中导致消化不良症状的长期缓解(Ford等,2004)。幽门螺旋杆菌感染的根除疗法也被推荐为低级粘膜关联淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的一线治疗，并且基于流行病学研究，成功的幽门螺旋杆菌根除疗法可以导致减少的胃癌病例数目(Kosunen等,2011；Chey and Wong,2007)。
用于检测幽门螺旋杆菌感染的诊断方法可以分成侵入性(需要胃镜检查法)和非侵入性方法。虽然几种方法给出高度准确的结果，但幽门螺旋杆菌感染的诊断没有单一黄金标准，且方法的选择依赖于临床情况及在其它方面是否需要胃镜检查法。根据测试和治疗策略，可以用非侵入性方法对具有低胃癌风险的患者测试幽门螺旋杆菌，并且若检出幽门螺旋杆菌，则进行治疗。
尽管非侵入性诊断方法(诸如尿素呼吸测试和粪抗原测试)一般显示高度准确检测率，但是这些方法不给出关于幽门螺旋杆菌的感染性隔离群的抗微生物易感性的任何信息。此外，即使在胃镜检查法中采集胃活组织检查并将其发送以进行培养，由于培养物的低敏感性在所有阳性病例中通常得不到抗微生物易感性测试结果。然而，幽门螺旋杆菌的抗微生物易感性测试的需要在增加。幽门螺旋杆菌的根除疗法通常由两种不同抗微生物剂和一种质子泵抑制剂(proton pump inhibitor)组成。克拉霉素是经典三重疗法的一种重要组分，并且在克拉霉素抗性幽门螺旋杆菌的情况中，基于克拉霉素的方案导致绝大多数病例中的根除失败(Fischbach and Evans,2007)。
由于增加的克拉霉素抗性率(Malfertheiner等,2012)，最近的欧洲指南推荐若得不到培养物，则在检测胃活组织检查中的幽门螺旋杆菌和抗微生物易感性测试中使用分子测试。已经开发出用于检测幽门螺旋杆菌和隔离群的克拉霉素易感性的同时测试的分子方法。幽门螺旋杆菌的克拉霉素抗性是公知的并且由于23S rRNA基因的肽基转移酶区内的点突变所致。
胃粘膜中幽门螺旋杆菌感染的高临床相关性已经刺激检测粪样品中幽门螺旋杆菌DNA的几种基于PCR的诊断方法的开发。然而，经常出现低灵敏性的问题。这些结果可以是由于粪中缺乏完整的幽门螺旋杆菌DNA所致。与肠细菌病原体(其在粪中以高浓度以活体形式找到)相反，最可能根本不存在活体幽门螺旋杆菌，并且因此其DNA可能仅以降解形式存在，使检测变得更有挑战。虽然一些基于PCR的方法已经显示了在胃活组织检查中检测幽门螺旋杆菌和克拉霉素易感性测试中的准确结果，但是在粪样品中使用所述方法时已经出现了问题。由于一些主要限制，诸如PCR抑制剂(Monteneiro,1997)和粪样品中低浓度的通常片段化的幽门螺旋杆菌DNA，难以开发足够灵敏的方法。在对粪样品应用时，基于PCR的方法仅显示了约60％的灵敏性(Lottspeich,2007etc)。本研究的目的是开发用于在粪样品中检测幽门螺旋杆菌和伴随的隔离群克拉霉素易感性的高度准确的非侵入性方法。
Schabereiter-Gurtner等(2004)公开了一种用于在粪样品中检测幽门螺旋杆菌感染和同时克拉霉素易感性测试的实时PCR测定法。实际上，作者检出幽门螺旋杆菌的23SrRNA基因中与克拉霉素抗性有关的点突变。然而，Lottspeich等(2007)评估该方法，并且推断通过实时PCR检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA是一项困难的任务以及此方法不能替换用于幽门螺旋杆菌感染的准确诊断的粪抗原EIA。后来，Scaletsky等(2011)发现了该方法证明适合于幽门螺旋杆菌克拉霉素易感性测试，尽管应当考虑缺少一些阳性结果的可能性。披露对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因特异性的引物和/或探针的其它出版物是：Fontana等,2003；Noguchi等,2007；Dewhirst等,2005；Maeda等,1998；Khan等,2004；及Rimbara等,2005。
在下列出版物中披露了涉及除23S rRNA基因外的靶基因的用于检测幽门螺旋杆菌的PCR测定法：Falsafi等,2009；Singh等,2008；Monteiro等,2001；Makristathis等,1998；Mishra等,2008；及Burucoa等,1999。
在PCR测定法的开发中，最重要的因素之一是定位实现可靠物种特异性扩增、检测和量化的寡核苷酸序列。最有意义的是设计为扩增幽门螺旋杆菌的给定寡核苷酸组不与源自样品中可能存在的任何其它物种的DNA起交叉反应。至少出于下列原因，发现此类序列可以完全不是不重要的：1)许多物种是相对紧密相关的，使得定位对于每个物种独特的序列变得有挑战性；2)源自单一物种的病原体菌株可以是遗传上趋异的，使得难以定位会实现物种内所有菌株的同等有效扩增的序列；3)样品可以含有PCR抑制剂或者如在此情况中样品含有大体上片段化的靶DNA，因为幽门螺旋杆菌通常在胃粘膜中繁殖，并且在大肠中非常可能会死亡并变坏。因此，从粪样品有效扩增病原体DNA需要实现高PCR效率(最佳的是尽可能接近100％)的寡核苷酸设计。
与现有技术相比，本发明至少提供了下述主要优点：外部和内部引物的Tm差异经过优化以实现更简单的反应路径，例如可以在单一容器中实施本发明的巢式PCR反应。Rimbara等,2005及Noguchi等,2007披露了在两个分开的反应中序贯实施巢式PCR的方法。本发明的PCR反应的稳健性(robustness)还在不需要通过酚提取或样品匀浆化(其分别是Rimbara等,2005及Noguchi等,2007中进行的)从粪样品分离并纯化DNA的水平上。此外，Rimbara等,2005及Noguchi等,2007中的巢式PCR的第二反应中扩增的扩增子长度太长以至于不能在实时PCR中灵敏检出。通过本发明的内部引物扩增的扩增子的长度是143bp，而在Rimbara中，它是463bp，并且在Noguchi中，它是367bp。
Fontana等,2003，JP 2005168474及Booka等,2005的公开内容不涉及巢式PCR反应，并且因此公开的引物在不修改的情况中与巢式反应不相容。此外，Fontana等,2003中扩增的扩增子长度是991bp，并且如此太长以至于在实时PCR中不能检出。还值得注意的是，Fontana等与Noguchi等扩增23S rRNA基因的不同区域。因此，清楚的是，现有技术教导23SrRNA中存在适合作为基于PCR检测螺杆菌菌株存在的靶区域的备选区域。在JP 2005168474中，引物似乎对螺杆菌不是特异性的，而且许多还与弯曲杆菌(Campylobacter)菌株起交叉反应。
虽然已经公开了众多用于检测幽门螺旋杆菌的基于PCR的测定法，但是本领域中仍然需要能够提供高检测特异性和可靠性的PCR测定法。本发明人现在已经定位幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的DNA序列区，其令人惊讶地完全适合于特异性且灵敏性扩增来自粪的幽门螺旋杆菌DNA。为了鉴定患者中幽门螺旋杆菌的存在已经设计并确认最佳的引物和定量PCR探针。
发明概述
本发明提供了一种检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
a)实施包含自粪样品分离的DNA作为模板和寡核苷酸引物组的PCR反应，所述寡核苷酸引物组对于在扩增反应中扩增幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是特异性的，其中所述寡核苷酸引物组包含由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸；并
b)在扩增所述幽门螺旋杆菌特异性靶序列时检测所述粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA。
本发明还提供了寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸引物组扩增幽门螺旋杆菌的23S rRNA基因中的靶序列。
本发明进一步涉及用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的试剂盒，所述试剂盒包含如上文描述的寡核苷酸引物组；和用于在PCR反应中实施核酸扩增的试剂。
附图简述
图1：用保守区探针(JOE)得到的阳性幽门螺旋杆菌结果和克拉霉素抗性突变(ROX)存在的阳性结果。另外，内部对照呈阳性。检测克拉霉素易感性基因型的野生型探针(FAM)呈阴性。
图2：用保守区探针(JOE)得到的阳性幽门螺旋杆菌结果和排除克拉霉素抗性突变的野生型探针(FAM)存在的阳性结果。另外，内部对照(CY5)呈阳性。检测克拉霉素抗性(ROX)的抗性突变探针呈阴性。关于结果，参见图2。
图3：幽门螺旋杆菌阴性结果：仅内部对照呈阳性，没有检出PCR抑制。关于结果，参见图3。
发明详述
如本文中使用的，核酸样品中存在的“靶序列”是要由“引物”引发并延伸的幽门螺旋杆菌DNA链。靶序列可以是单链的或在与其互补序列的双链体中。在某些实施方案中，靶序列可以不存在于核酸样品中，但是后来可以由于自所述核酸样品中存在的另一种核酸转录而存在。基于实施的测定法的目的，靶序列可以来自众多来源。在本文中描述的扩增反应前以一定的程度纯化本发明的靶序列。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”指用作本发明的DNA扩增方法中的试剂的两个或更多个核苷酸、核苷、核碱基或相关化合物的任何多聚体。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或其类似物。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；确切地，它一般用于涵盖本文中描述的所有此类试剂。在下文更为详细描述了本发明的特定寡核苷酸。如本文中使用的，寡核苷酸可以是实际上任何长度的，仅受限于其在DNA扩增反应中的特定功能。可以通过本领域普通技术人员已知的技术，诸如通过化学或生物化学合成，以及通过从重组核酸分子(例如细菌或病毒载体)的体外或体内表达生成限定序列和化学结构的寡核苷酸。可以以任何方式修饰寡核苷酸，只要给定的修饰与给定寡核苷酸的期望功能相容。本领域普通技术人员可以容易确定给定修饰对于本发明的任何给定寡核苷酸是否是适合的或期望的。修饰包括但不限于碱基修饰、糖修饰或主链修饰。虽然本发明的寡核苷酸的设计和序列依赖于其功能，如下文描述的，但是一般必须考虑几项变量。最重要的是：长度、G/C含量、熔解温度(Tm)、吉布斯自由能(Gibb free energy,G)、特异性、自身互补性和与系统中的其它寡核苷酸的互补性、多嘧啶(T,C)或多嘌呤(A,G)段、和3’端序列。这些和其它变量的控制是寡核苷酸设计的一个标准且公知方面，并且多种计算机程序容易可用于对大量潜在寡核苷酸筛选最佳的寡核苷酸。
如本文中使用的，术语“PCR扩增”一般指采用与互补链杂交的引物循环聚合酶介导的核酸指数扩增，如记载于例如Innis等,PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press(1990)的。已经开发出可以实施用含有能够发射规定波长的光束的荧光指示剂的组合物进行的热循环反应，读出荧光染料的强度，并且在每个循环后展示荧光强度的热循环反应的装置。扩增产物含有与靶核酸序列或其互补物具有序列同一性的序列，并且可以例如用嵌入染料或对靶核酸序列或其互补物的区域具有特异性的检测探针检测。优选地，以实时PCR测定法实施本发明的PCR反应。如本文中使用的，术语“探针”指指示扩增的多种发信号分子之任一种。例如，Green及其它DNA结合染料是检测剂探针。一些检测剂探针可以是基于序列的，例如5’核酸酶探针。多种检测剂探针是本领域中已知的，例如探针(参见美国专利No.5,538,848)。可以通过添加经修饰的核苷酸提高探针的熔解温度Tm。一种探针中的经修饰核苷酸的量是1、2、3、4或更多。经修饰的核苷酸可以是LNA核苷酸(Exiqon A/S)、小沟结合剂(MGBTM)、SuperBase、或肽核酸(PNA)或提高探针Tm的任何其它修饰。
由于幽门螺旋杆菌是上肠道病原体，幽门螺旋杆菌DNA仅以低水平存在于粪中。因此，高度特异性和灵敏性引物的正确选择具有重大意义以从自粪样品分离的DNA模板的基于PCR的测定法获得准确结果。本发明提供了用于扩增幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的至少一种靶序列的方法和寡核苷酸引物组。开发的测定法可以以高灵敏性检测幽门螺旋杆菌感染，并且同时评估克拉霉素抗性。本发明的效果与外部引物(即SEQ ID NO:1和2)的靶位点的选择特别相关。
因而，本发明涉及检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
a)实施包含自粪样品分离的DNA作为模板和寡核苷酸引物组的PCR反应，所述寡核苷酸引物组对于在扩增反应中扩增幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是特异性的，其中所述寡核苷酸引物组包含由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸；并
b)在步骤a)中扩增所述幽门螺旋杆菌特异性靶序列时检测所述粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA。
由于巢式PCR一般提高灵敏性，所述PCR反应优选是巢式PCR反应。因而，可以在所述PCR反应中使用第二寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。所述第二寡核苷酸引物组涉及与某些幽门螺旋杆菌菌株的克拉霉素抗性有关的点突变位点的扩增。如此，方法还进一步涉及幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中与幽门螺旋杆菌中的克拉霉素抗性有关的突变的检测。可以通过一种或多种探针检测所述突变的存在，所述探针检测所述基因中突变的存在，优选在与SEQ ID NO:13(GenBank:U27270.1)的位置2514和/或2512对应的位置。优选地，通过由如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针和/或由如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针进一步检测所述突变。此外，为了检测所述突变，可以使用一种或多种由如SEQ ID NO:5和/或6中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成或包含或组成为SEQ ID NO:5和/或6中所列的序列的探针。
本发明的最优选实施方案之一是在单一容器中实施方法的步骤a)和b)(例如如由Strauss等,2000描述的)。此方法降低污染风险。为了实现此目的，必须设计第一和第二寡核苷酸引物组的熔解温度，从而组间的温度差异是至少3摄氏度，优选3.5或4摄氏度。
幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中由SEQ ID NO:1和2组成的第一寡核苷酸引物组针对的靶序列对应于SEQ ID NO:13的位置1937-2793。
幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中由SEQ ID NO:3和4组成的第二寡核苷酸引物组针对的靶序列对应于SEQ ID NO:13的位置2482-2624。
优选地，使用DNA芯片、凝胶电泳、放射测量、荧光测量、或磷光测量实施在扩增幽门螺旋杆菌特异性靶序列时粪样品中幽门螺旋杆菌DNA的检测。本领域技术人员也可以在利用PCR的其它方法和平台中使用本发明的引物和探针。
本发明还提供了寡核苷酸引物组，其包含由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸，其中寡核苷酸引物组扩增幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中的靶序列。优选地，寡核苷酸引物组包含或组成为如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列和如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列。
优选地，寡核苷酸引物组进一步包含由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸和由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸。更优选地，所述寡核苷酸引物组包含或组成为如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列和如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列。
寡核苷酸引物组可以进一步包含由如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针和/或由如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针。更优选地，所述寡核苷酸引物组包含或组成为如SEQ IDNO:7中所列的核苷酸序列和如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列。最优选地，所述寡核苷酸引物组进一步包含或组成为如SEQ ID NO:5中所列的核苷酸序列和如SEQ ID NO:6中所列的核苷酸序列。
本发明还提供了用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种如上文描述的寡核苷酸引物组；和用于实施PCR反应中的核酸扩增的试剂。优选地，所述试剂选自下组：DNA聚合酶、dNTP、和缓冲液。
本文中用于例示本发明的背景以及特别用于就其实施而言提供额外详情的出版物和其它材料通过提及并入本文。本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例并不意图限制本发明的范围。
实施例
设计阶段中的目的是开发不会扩增其它紧密相关物种的幽门螺旋杆菌高度特异性PCR。使用经测序确认的具有和没有克拉霉素抗性突变的幽门螺旋杆菌菌株开发并优化新测定法。然后，针对50种临床相关病原性和非病原性细菌物种(包括革兰氏阴性和革兰氏阳性物种)测试分析特异性。没有检出显著的交叉反应性。对于阳性重复具有95％置信度的分析灵敏性是10fg，其对应于2个基因组拷贝或1个细菌。使用胃活组织检查、组织学和螺杆菌培养物及抗微生物易感性测试作为黄金标准参照法分析临床灵敏性和特异性。研究的总共80份患者样品中，实现94％样品中的正确鉴定和90％中的正确抗微生物易感性。作为对照，使用来自稻(Oryza sativa)的模板顶生花(terminal flower)基因Ory。
核酸提取
使用bioMerieux NucliSens试剂盒和用于提取的半自动化easyMAG仪提取总核酸。成功测试通用和特定B方案两者。特定B方案在qPCR性能上略好，并且选择它进行所有实验。根据制造商的用法说明，将1环粪(约10％溶液)接种入2mL试剂盒裂解缓冲液中，精确混合5s，并在室温中温育至少15分钟。提取体积是25μl。
PCR设置和寡核苷酸
对于用Stratagene MxPro 3005P实施的所有测定法利用以下PCR程序和寡核苷酸组：
1.95℃ 13min
2.94℃ 60
3.68℃ 90s
4.2-3 x5个循环
5.94℃ 30s
6.68℃ 60s
7.2-3 x 15个循环
8.94℃ 25s
9.64℃ 25s
10.8-9 x40
引物
外部引物：
Hpy_sel_003_F GCTAGTCTAAGGGCGTAGATTGGAGGGAAG(SEQ ID NO:1)
Hpy_sel_003_R GCTTGTGCCATTACACTCAACTTGCGATTTC(SEQ ID NO:2)
内部引物：
F_Hpyin_06 GGTGAAAATTCCTCCTACC(SEQ ID NO:3)
R_Hpyin_06 CAAGGATGGCTCCATAAG(SEQ ID NO:4)
对照：
F_ORY_004 CTAATCCCAGCAACCCAACC(SEQ ID NO:9)
R_ORY_004 CTAATCAATGTGAGACATATGATAGAAATC(SEQ ID NO:10)
探针
P_Hpy2142wt_02_FAM CAAGACGGAAAGACCC(SEQ ID NO:5)
P_Hpyall_02_JOE CAAAGCCTCCCACCTATCCTGCG(SEQ ID NO:6)
P_Hpy2143G_06_TEX CAAGACGGAGAGACCC(SEQ ID NO:7)
P_Hpy2142GG_05_TEX CAAGACGGGAAGACCC(SEQ ID NO:8)
P_Ory_4_Cy5 CCTGCACTGGTAAGCTATG(SEQ ID NO:11)
上述列表中加下划线的核苷酸是提高探针的Tm的LNA核苷酸(ExiqonA/S)。
合成的Ory模板
TGCTCCTAATCCCAGCAACCCAACCTTGAGGGAATACCTGCACTGGTAAGCTATGCTCTTGCAATTGTTGTGATTTCTATCATATGTCTCACATTGATTAGTGATCTA(SEQ ID NO:12)
反应混合物
在初始变性和聚合酶活化后，利用5个循环的长延伸时间改善从不太理想的基因组DNA的扩增效力。在生成少数初始拷贝后，将长特异性扩增阶段再继续15个循环，但是不再继续以使后续步骤(即8.-10.)中的扩增效力最大化。令人惊讶地，比20(5+15)个循环更长的第一阶段降低灵敏性，并且引起克拉霉素抗性突变检测阶段中过早扩增的风险，导致关于数据分析的大问题。对于所有探针注意将退火温度优化为类似，从而能够检测单一核苷酸突变。由于相当低的熔解温度要求而难以设计高灵敏性探针，这是避免在较早的高温度特异性扩增阶段中推定的不想要探针结合必需的。
实施例1
用保守区探针(JOE)得到的阳性幽门螺旋杆菌结果和克拉霉素抗性突变(ROX)存在的阳性结果。另外，内部对照呈阳性。检测克拉霉素易感性的野生型探针(FAM)呈阴性。关于结果，参见图1。
FAM(绿色)：克拉霉素突变热点内的野生型基因型。在呈阳性时，不存在抗性突变。用基于克拉霉素的组合治疗可能获得成功。
JOE(黄色)：滞后链中的高度保守区指示样品中幽门螺旋杆菌的存在，不管抗性突变存在与否。
注意：若出现新的或双重的突变，则在内部对照外JOE是唯一的阳性探针＝存在克拉霉素抗性基因型。
ROX(红色)：与克拉霉素抗性有关的A2142G或A2143G位置中的突变。检出最常见的类型。
CY5(远红)：抑制对照。
实施例2
用保守区探针(JOE)得到的阳性幽门螺旋杆菌结果和排除克拉霉素抗性突变的野生型探针(FAM)存在的阳性结果。另外，内部对照(CY5)呈阳性。检测克拉霉素抗性(ROX)的抗性突变探针呈阴性。关于结果，参见图2。
实施例3
幽门螺旋杆菌阴性结果：仅内部对照呈阳性，没有检出PCR抑制。关于结果，参见图3。
参考文献
Booka等,2005,Helicobacter,10:205-213
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Claims (8)

1.对在扩增反应中扩增幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的幽门螺旋杆菌特异性靶序列特异的第一和第二寡核苷酸引物组在制备用于检测幽门螺旋杆菌DNA试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的方法，所述方法包括：
a)实施包含自粪样品分离的DNA作为模板和对于在扩增反应中扩增幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中的幽门螺旋杆菌特异性靶序列特异性的第一和第二寡核苷酸引物组的巢式PCR反应，
其中所述第一寡核苷酸引物组包含以下寡核苷酸：包含如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸引物和包含如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸引物，
其中所述第二寡核苷酸引物组包含以下寡核苷酸：包含如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸引物和包含如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列或由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的寡核苷酸引物，
其中所述第一寡核苷酸引物组的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中与SEQ ID NO:13的位置1937-2793对应的核苷酸区，并且通过所述第一寡核苷酸引物组在PCR反应中仅扩增所述核苷酸区，且
其中所述第二寡核苷酸引物组的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中与SEQ ID NO:13的位置2482-2624对应的核苷酸区，并且通过所述第二寡核苷酸引物组在PCR反应中仅扩增所述核苷酸区；并
b)在扩增所述幽门螺旋杆菌特异性靶序列时检测所述粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA。
2.根据权利要求1的用途，其中通过由如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的第一探针和由如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的第二探针进一步检测与幽门螺旋杆菌中的克拉霉素抗性有关的幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的突变或其中所述第一探针包含如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列，并且所述第二探针包含如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2的用途，其中使用DNA芯片、凝胶电泳、放射测量、荧光测量、或磷光测量实施在扩增所述幽门螺旋杆菌特异性靶序列时粪样品中幽门螺旋杆菌DNA的检测。
4.根据权利要求1或2的用途，其中在单一容器中实施步骤a)和b)。
5.根据权利要求1或2的用途，其中以实时PCR测定法实施所述方法。
6.寡核苷酸引物组，其包含第一寡核苷酸引物组和第二寡核苷酸引物组，
所述第一寡核苷酸引物组由以下组成：
由如SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，和
由如SEQ ID NO:2中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，
所述二寡核苷酸引物组由以下组成：
由如SEQ ID NO:3中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，和
由如SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列组成的寡核苷酸，
其中所述寡核苷酸引物组扩增幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中的靶序列，使得所述第一寡核苷酸引物组的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是幽门螺旋杆菌23S rRNA基因中与SEQ IDNO:13的位置1937-2793对应的核苷酸区，并且通过所述第一寡核苷酸引物组在PCR反应中仅扩增所述核苷酸区，且
其中所述第二寡核苷酸引物组的幽门螺旋杆菌特异性靶序列是幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中与SEQ ID NO:13的位置2482-2624对应的核苷酸区，并且通过所述第二寡核苷酸引物组在PCR反应中仅扩增所述核苷酸区。
7.根据权利要求6的寡核苷酸引物组，其进一步包含由如SEQ ID NO:7中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针和由如SEQ ID NO:8中所列的核苷酸序列中存在的至少10个连续核苷酸组成的探针。
8.用于检测粪样品中的幽门螺旋杆菌DNA的试剂盒，所述试剂盒包含：权利要求6或7的寡核苷酸引物组；和用于在PCR反应中实施核酸扩增的试剂，其中所述试剂选自下组：DNA聚合酶、dNTP、和缓冲液。
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