CN107365854A - 一种tp53基因snp位点多重实时荧光pcr检测引物、探针及其试剂盒 - Google Patents

一种tp53基因snp位点多重实时荧光pcr检测引物、探针及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒。所述引物为：上游引物AC1‑F和AC1‑R、AC2‑F和AC2‑R；探针为AC1 C‑P、AC1 A‑P、AC2 A‑P、和AC2 G‑P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；其中AC1‑F，AC1‑R，AC2‑F，AC2‑R，AC1 C‑P、AC1 A‑P、AC2 A‑P、和AC2 G‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑8所示。采用本发明的引物，探针及其试剂盒进行TP53基因SNP位点检测，具有方法简单，准确，灵敏度高，成本低，通量高，适用于一般筛查的优点。

Description

一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其 试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤已成为威胁国人健康的最重要因素，是第一死亡原因。从发病率排行看，男性发病前五位分别是肺癌、肝癌、肠癌、胃癌、泌尿生殖系癌，女性发病前五位分别为乳腺癌、肺癌、生殖系癌、肠癌、胃癌。
TP53是一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)。该基因对人体有保护作用，它时刻监控基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损伤，就能够阻止细胞进入DNA合成期，抑制细胞的分裂和增殖，并且使损伤的DNA修复，即使不能修复，也能够启动细胞的程序性死亡过程，防止细胞的恶性转化。研究表明，TP53基因rs12951053和rs2078486位点的多态性能够影响该基因的保护作用。
肿瘤能否有效防治关键在于早期筛查并确诊，临床早期确诊的癌症5年存活率达80％-90％，随着医学技术的发展，可以预防的癌症还在增多，而TP53抑癌基因检测是目前最重要的普通人群癌症筛查方式之一。
目前，用于基因筛查的常见方法是Sanger测序法，该方法能对一个样品的某一段区域进行测序，但是检测通量较低，且成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒检测成本低、通量高，适用于一般筛查。
本发明的另一目的在于提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测方法。该方法建立在采用特殊的引物进行的多重PCR上，可以有效提高多重PCR反应的稳定性和均一性。
为实现上述目的，本发明提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物为：上游引物AC1-F和AC1-R、AC2-F和AC2-R；，探针为AC1 C-P、AC1 A-P、AC2 A-P、和AC2 G-P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
其中AC1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，AC1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
AC2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，AC2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
探针AC1 C-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，AC1 A-P的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；
AC2 A-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，和AC2 G-P的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示。
进一步，探针的5’端的荧光基团为ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5。
进一步，探针的3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、DBACYL、MGB。
本发明还提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物和探针。
所述引物和探针，及其所述试剂盒用于检测TP53基因SNP位点的用途。
进一步，方法为，提取待测样品的DNA作为模板，以所述引物和探针或所述试剂盒进行实时荧光PCR反应；根据扩增曲线信号进行判断即可。
进一步，实时荧光PCR反应的反应体系为，反应体系为：10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、上游引物AC1-F、AC2-F各10pmol、下游引物AC1-R、AC2-R各10pmol及FAM标记的荧光探针AC1 C-P、HEX标记的荧光探针AC1 A-P、ROX标记的荧光探针AC2 A-P、CY5标记的荧光探针AC2 G-P各5pmol，模板20ng；水补足至25μL。
进一步，实时荧光PCR反应的反应程序为，95℃5min；95℃20s；60℃20s；72℃20s，40个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号。
本发明所述引物为用于扩增TP53基因rs12951053和rs2078486位点的引物，其通过在5’末端含有一段特殊的序列抑制引物二聚体的产生，可以实现稳定高效的双重PCR反应。
本发明所述的引物由于其5’末端含有特殊序列，在扩增目的片段时如果产生了引物二聚体，会产生较稳定的发夹结构，这种结构可以抑制引物二聚体的进一步扩增，使引物二聚体保持在一个低含量的水平，从而保证特异性产物获得竞争优势。同时由于针对不同目的片度的引物都含有相同的5’末端序列，可以平衡多重PCR各个目的片段的扩增效率。最终，这种引物设计方式可以提供稳定高效的多重PCR反应。
AC1：rs12951053位点
AC2：rs2078486位点
采用本发明的引物，探针及其试剂盒进行TP53基因SNP位点检测，具有方法简单，准确，灵敏度高，成本低，通量高，适用于一般筛查的优点。
附图说明
图1为实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点质控品作为阳性对照的检测结果图；
图2为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点质控品作为阳性对照的检测结果图；
图3为实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AA样本的检测结果图；
图4是实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为CC样本的检测结果图；
图5是实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AC样本的检测结果图；
图6为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GG样本的检测结果图；
图7为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为AA样本的检测结果图；
图8为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GA样本的检测结果图；
图9为实施例1中本发明的试剂盒检测纯水样本作为阴性对照的检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：准确性检测实验
待检样本DNA的提取：用常规分子生物学方法或市售试剂盒从待检者的口腔上皮细胞提取基因组DNA。
实时荧光PCR扩增与检测：
反应体系为：10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、上游引物AC1-F、AC2-F各10pmol、下游引物AC1-R、AC2-R各10pmol及FAM标记的荧光探针AC1 C-P、HEX标记的荧光探针AC1 A-P、ROX标记的荧光探针AC2 A-P、CY5标记的荧光探针AC2 G-P各5pmol，待测样本DNA模板20ng；水补足至25μL。
其中AC1：rs12951053位点
AC2：rs2078486位点
实时荧光PCR反应在Bio-RadCFX96仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：
第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃20s；60℃20s；72℃20s，40个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号；
四个荧光检测通道分别为FAM、HEX、ROX、CY5。
结果判读：每个SNP位点不同基因型的样品在不同的荧光检测通道都有其特征扩增曲线信号，扩增曲线信号与检测位点和检测通道的关系归纳如表1：
表1 扩增曲线信号与检测位点和检测通道的关系归纳表
实验结果分析：
阴性对照：以纯水作为模板的反应管内，应无任何扩增曲线产生；
阳性对照：以经测序验证基因型的质控品DNA作为模板的反应管内，不同基因型在不同通道均有其特征的扩增信号产生；
基因型判读：不同基因型在其对应通道有特异的扩增曲线信号；
结果见图1-9。附图中，RFU为荧光强度，Cycles为循环数。
其中图1为实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点质控品作为阳性对照的检测结果图；
图2为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点质控品作为阳性对照的检测结果图；
从图1、2可以看出，不同位点不同基因型质控品的检测中，对应的荧光通道均有其特征的扩增信号产生。
图3为实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AA样本的检测结果图；
图4是实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为CC样本的检测结果图；
图5是实施例1中本发明的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AC样本的检测结果图；
从图3、4、5可以看出rs12951053位点不同的基因型在FAM及HEX通道均有其特征的扩增曲线信号产生。
图6为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GG样本的检测结果图；
图7为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为AA样本的检测结果图；
图8为实施例1中本发明的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GA样本的检测结果图；
从图6、7、8可以看出rs2078486位点不同的基因型在ROX及CY5通道均有其特征的扩增曲线信号产生。
图9为实施例1中本发明的试剂盒检测纯水样本作为阴性对照的检测结果图。
从图9可以看出采用纯水作为阴性对照时，四个荧光通道均没有扩增曲线信号产生。
由此检测结果可以看出，本发明的试剂盒对表1中列举的两个位点6种基因型都可检测出特异的扩增曲线信号，而且各个基因型间不存在交叉检出的现象。
采用本发明的技术方案的待检样本检测结果与阳性对照一致，说明采用本发明的引物，探针及方法进行检测，方法简单，结果灵敏准确。因此在检测实际样品时可对照上表中的不同检测通道的扩增曲线信号判读待检样品的基因型。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门智因互联科技有限公司
<120> 一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒
<130> ZYHL-17001-CNI
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agtccttcgc atggatgtga tgagaggtgg at 32
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agtccttcgc atcctctgct tgcctctga 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ttaccgattt cttccatact actac 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
accgatttct gccatactac t 21
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agtccttcgc atcacacagt aagagctcaa ca 32
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agtccttcgc atggtgtact tgcattaatg gagt 34
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttgttagtgc agatctgtgg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ttgttagtgc ggatctgtg 19

Claims (8)

1.一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物为：上游引物AC1-F和AC1-R、AC2-F和AC2-R；，探针为AC1C-P、AC1A-P、AC2A-P、和AC2G-P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
其中AC1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，AC1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
AC2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，AC2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
探针AC1C-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；AC1A-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
AC2A-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；和AC2G-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，探针的5’端的荧光基团为ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5。
3.权利要求1所述的引入和探针，其特征在于，探针的3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、DBACYL、MGB。
4.一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述的引物和探针。
5.权利要求1所述引物和探针，及其权利要求2所述试剂盒用于检测TP53基因SNP位点的用途。
6.权利要求5所述的用途，其特征在于，方法为，提取待测样品的DNA作为模板，以权利要求1-3任一项所述引物和探针或权利要求4所述试剂盒进行实时荧光PCR反应；根据扩增曲线信号进行判断即可。
7.权利要求5所述的用途，其特征在于，实时荧光PCR反应的反应体系为，反应体系为：10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、上游引物AC1-F、AC2-F各10pmol、下游引物AC1-R、AC2-R各10pmol及FAM标记的荧光探针AC1C-P、HEX标记的荧光探针AC1 A-P、ROX标记的荧光探针AC2A-P、CY5标记的荧光探针AC2G-P各5pmol，模板20ng；水补足至25μL。
8.权利要求5所述的用途，其特征在于，实时荧光PCR反应的反应程序为，95℃5min；95℃20s；60℃20s；72℃20s，40个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号。
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