CN102146432A - 一对部分同序引物减少其二聚体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，根据发明人的发现-没有连续互补碱基的引物对沿5’-3’方向平行配对形成多处间隔氢键的合力促使它们3’末端个别互补碱基形成氢键使末端结合延伸成二聚体；和单一引物自身不形成二聚体的现象。尽最大比例设计PCR引物对近似单一引物。其特征在于PCR引物对中间沿5’-3’方向预设一段4-10bsae同样序列，所述引物对3’末端1-5base避免间隔互补碱基，所述5’端区避免3个以上的间隔互补碱基，最好5’端完全同序。可极大减少引物二聚体形成，优化PCR质量，尤其是荧光染料实时PCR。

Description

一对部分同序引物减少其二聚体的方法

技术领域：

本发明属于分子生物学技术及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种减少引物二聚体形成的引物设计方法。

背景技术：

核酸研究从确立遗传物质基础为核糖核酸DNA起，历经半个多世纪的探索，到1953年Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构模型及阐明了其中心法则，从而开启了核酸研究的分子生物学时代。由于各种核酸DNA都是由四种碱基排列组成的仅编码遗传信息不同的线性结构，其物理化学性能基本一样，难以通过一般理化技术分离纯化微量目的基因或特异性检测微量靶基因。二十世纪70、80年代美国冷泉港(Cold Spring Harber)实验室开发出了完整系统的基于细菌单克隆筛选基因文库及转化基因的分子克隆技术，然而要得到目的基因仍是费时、繁琐的工作。检测靶基因只能通过合成探针经印迹杂交(Dot Blotting)才能检测纳克(ng)级的分子，且定量不准确，操作繁琐。

早在1971年，Korana就提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年美国PF-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis偶然的产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。

核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～3分钟，2～3小时就能将待扩目的基因呈指数扩增放大百万倍以上。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”--平台期。Mullis经过一系列研究证实了这一技术，申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

随着ABI-PE等公司开发出各种热循环PCR仪，包括最初的水浴锅式，以及压缩机制冷式和目前广泛应用的半导体制冷式PCR仪。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因 而1989年称为“PCR爆炸年”。在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被发明，包括反转录PCR(RT-PCR)，原位PCR，连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，标记PCR(Labeled primers，LP-PCR)，反向PCR(reverse PCR，扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR(recombinant PCR)，巢式PCR(nest PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(Strand displacement amplification，SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)，转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplificationsystem，TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增，滚环扩增(Rolling circleamplification，RCA)，环介导的等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)等，尤其是近年来各种实时荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman(Hydrolysisprobe)，FRETHybridition probes，and Molecular Beacons PCR，详见综述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano，BioTechniques 39：75-85，July 2005)。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cycle threshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。

核酸扩增技术极大提高了基因克隆效率及核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的许多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，成为现代分子生物学最核心的基础技术。截至目前全世界与PCR相关的专利已多达数千个以上。

所有这些核酸扩增PCR技术的质量控制及实验条件优化的核心、关键主要在于其扩增引物的质控及设计。引物对的特异性(尤其3’端)长度、GC含量、退火及融解温度、稳定性、同源互补性及二级结构等等就决定了PCR产物扩增的特异性、产物的有无、本底背景大小、检测灵敏度、是否可定量以及可重复性等等。关于引物的设计工作，现有许多商业引物设计软件如PRIDE、PRIME+、DOPRIMER、PRIMO、MEDUSA和Primer Master等，也有更多的在线引物设计网址可供应用选择，如Primer3……等等，详见综述(F.John Burpo，Biochemistry218：l-11，Aug 2001和Vinay K.Singh&Anil Kumar，Molecular Biology Today2(2)：27-32，2001)。然而这些生物信息软件只解决了以上这些一般性优化条件，采用这些原则应用软件设计的没有连续互补序列的引物对，在特异性、长度、GC含量、退火温度Tm值及二级结构上最优化的合成引物对在实际工作中总或多或少存在引物二聚体问题，且没有规律性，试验结果重复性差，优化后引物对仍形成二聚体的根本问题尚未见公开报导的解决方法。引物二聚体的形成不仅产生高噪音本底，尤其严重干扰采用荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR低拷贝(copy)样本的定量准确性或弱阳性的判断；也竞争性干扰模板的特异性扩增效率，使大多数实时荧光定量PCR技术定量不精准。

发明内容：

为了克服引物对二聚体造成的PCR高背景不易进行荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR对低浓度样本检测分析的局限。本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”根据任意对引物在SYBR Green I实时荧光PCR检测中总是或多或少存在引物二聚体，而任意单一引物相互间只要没有连续三个碱基以上的互补，就总是没有任何二聚体形成的实验前提，提供一种设计中间区部分序列相同的引物对，近似单一引物，从而大大减少二聚体形成的设计合成方法。

“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”其特征在于，没有任何连续互补碱基的一对引物中间区域预先设置一段4-10bas同样序列，类似于单一引物自身的同样序列，不形成二聚体的机理，从而减少引物二聚体形成的程度，优化PCR质量。其特征还在于中间部分同序引物对3’末端为1-5base靶特异性序列碱基。其一3’最末端碱与另一3’末端最后两碱基绝对避免互补也要避免间隔互补碱基，其特征还在于中间部分同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对，不要有3个以上间隔碱基互补。

所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”的引物设计，其策略原则是：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段4～10base完全相同的序列，优选设置6～8base完全相同序列；引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能在最末端两碱基；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4～10个base靶特异性序列，优选6～8base绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。

所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”优化PCR，其特征是中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行SYBR Green I实时荧光PCR。同序引物对的浓度(1-5μM)也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的SYBR Green I实时荧光PCR质量。

所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”增加PCR灵敏度，其特征是使用新型SYBR Green ER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。

所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”用于创新PCR，其特征是采用单一引物，并与靶特异性引物联用，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增，先用稀有基因靶特异嵌合引物进行长时高温退火少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板，再采用单一稀有基因序列引物，常规退火温度退火结合二次模板两侧定量PCR扩增分析。

所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”用于软件，基因检测盒，盒成份包括：核酸提取试剂，10mM dNTPs，Taq聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物F/R。

本发明“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其理论依据是基于长期的实时染料荧光PCR试验经验总结。在没有加阳性靶基因的核酸扩增系统中，最佳设计的任意引物对总是存在一定的Ct值，约在25至35循环数之间，而仅加双倍量任意单一引物的荧光值(引物延伸时读取荧光值)总是一条直线，没有高出基线的Ct读值。也就是说优化的任意引物对(序列特异)总会形成一些二聚体，其解链温度多在75℃-77℃；而单一引物在相同条件下绝对不会形成引物二聚体。见图1。这就提出了一条创新途径，如果一对引物近似单一引物就不会产生二聚体，那么引物对怎样相似或相同多少就可以像单一引物而不会形成二聚体？为什么没有互补序列及内部互补发夹二级结构的单一引物不会形成引物二聚体？分子机理是什么？沿着这条思路，从二聚体形成理论机制和检测引物二聚体最灵敏的SYBR Green I实时荧光PCR实验两个方面来破解引物二聚体形成真正原因，找出减少引物二聚体程度的正确方向。

首先采用荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR，试验系列引物对近似度与二聚体程度的关系。荧光染料SYBR Green I是一种双链DNA结合染料，游离时不发出荧光，随着双链模板扩增，相对应结合的染料就越多，发出的荧光强度Ct值与最初靶基因浓度存在负对数关系。但是引物二聚体双链亦同样有效结合染料而发出荧光。试验选择一条特异性序列引物A，不加靶模板，仅加双倍浓度单一引物A的荧光PCR系统扩增，荧光值仅为一条直线；再人工合成另一条有四个碱基(base)以下连续不同的同一序列寡核苷酸引物B，与引物A作为引物对，A-B不加模板扩增，荧光值大多为一条直线，部分仅在Ct38才高出基线一点点，而且连续四个不同碱基在引物中的位置没有影响，说明高度近似的引物对基本没有二聚体；再人工合成另一条C有7个以上连续不同，但与A没有连续互补的同一引物，与最初A引物作为引物对，A-C不加模板扩增，其Ct值大多为30～35，甚至连续7个base以上不同位于引物5’端也会使荧光值升高，Ct值为30～35。说明不连续的碱基互补，只要足够多(4～6个以上)就能使引物对相互靠近结合，使其3’端找到互补点结合延伸形成二聚体。换句话说A-C引物对3’端6～8base以上连续相同，均为同样序列末端的引物，只要引物对哪怕是5’端有3个base以上连续互补，或4～6个base以上不连续互补就可以增加引物二聚体形成程度；再人工合成另一条D引物，5’端与A有4个base不同，同时3’端有3base不同，组成A-D引物对，荧光值仍在Ct值35以后才高出基线，也不容易形成二聚体；这就说明不连续的碱基互补，距离越近就越类似连续碱基互补，容易结合形成引物二聚体。距离越远，结合力就会越分散，不易形成引物二聚体。最后合成一与A序列完全相同但5’--3’方向相反的E引物，A-E引物对不加模板扩增，Ct值仍约30左右，与普通引物对形成二聚体无异。这就更进一步说明，一对引物高度近似性且必须都是5’-3’方向相比较高度近似性才是避免引物二聚体的唯一正确方向。结果见图2。

再由此推导出引物二聚体形成机理的理论假设：一般的高度互补引物对二聚体形成机理是以其3’末端大段连续的互补碱基对头(一条5’-3’方向，另一条3’-5’方向)方式配对结合，末端在聚合酶和底物dNTP作用下延伸，形成二聚体双链。而优化的引物对没有连续互补碱基形成的合力，其3’末端极少几个不连续互补碱基形成氢键的能力太弱，不足以抵抗引物链因大量磷酸基团负电荷所形成水化分子颗粒之间的斥力及分子热运动的阻力，即使降低引物溶液温度也不足以配对结合，还需要除3’末端外的更多个不连续互补碱基的合力才能促使3’末端极少的互补碱基氢键形成。因此，一般优化引物对形成二聚体过程是：优化引物对首先是均以5’-3’方向平行配对，以多个不连续互补碱基的合力形成多处氢键， 促使引物对3’末端靠近并使末端扭曲，以局部对头配对，将末端极少的不连续互补碱基配对形成氢键，再互为“引物”延伸形成引物二聚体。单一引物自身不能形成二聚体的机理也就清楚了：首先自身引物对以5’-3’方向平行完全不能配对，仅靠3’末端极少的不连续互补碱基不足以形成氢键，绝对形成不了二聚体。当然，单一引物其一3’末端也可以对头方式与另一引物5’区偶尔配对，其极少的互补碱基借助3’末端以外的多处不连续互补碱基合力而形成氢键，产生极少量的短二聚体，其解链温度低于65℃，基本不影响本底。

而同一反向引物对，序列完全相同，仅其中一条颠倒顺序的引物对，对头时虽完全相同，不形成二聚体；但均以5’-3’平行配对时总会形成一些多个不连续间隔的氢键，助其3’末端配对结合，延伸形成二聚体，与普通引物对无异。

引物对设计的核心关键：首先如绝大多数已发表的引物设计策略，引物对正反两个方向相比较都不能有连续的互补碱基。但是，引物对平行之间(均5’-3’方向平行对比，逐一或许平移比对)有多个相近的不连续间隔的互补碱基亦是影响引物二聚体形成的关键因素。关于这方面的实验、理论和引物设计还尚未见报导。引物设计时选择没有(排除)任何连续的互补碱基的引物较容易，但对于多数长约20个base的引物，由于仅4种碱基的排列组合很容易产生多处不连续的、间断的互补碱基，足以影响二聚体的形成。怎样将这些不连续的互补碱基数降低到数量最少和合力最小。策略是在引物对序列中间设置一段序列完全相同的部分以提高引物对的相同性，并将相同序列置于不连续的互补碱基序列中间以分散它们的合力，分散越远合力就越小。由此得出一创新引物设计原则：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段4～10base完全相同的序列，优选设置6～8base完全相同序列；引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4～10个base靶特异性序列，优选6～8base绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。接下来是怎样找到引物对中间预选的6～8个base完全相同序列？首先选择一段靶基因，将其有意义链与反意义链都从5’-3’端方向排序(Alignment)分析，有4～5base相同序列的较多，6～8base以上完全连续相同的情况少见一些，大部分基因总会有一段这样中间隔100-300bp的回文序列。再按上面的原则选优。如果机遇不佳，只能找到4～5base的相同序列，也可选择引物对的其中一条在相同序列的上游相邻处(即引物中间)突变一个碱基与另一条相同，增加一个相同碱基，达到5-6个base完全相同序列，并在这一条引物5’端和3’端，各再加1～2个base原靶序列的相应碱基以弥补中间碱基突变所造成的退火温度损失。

最高相似度引物设计策略就是PCR上下游扩增引物干脆采用单一引物，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。也就是人造单一引物与靶基因特异性引物相结合的方法。首先在一对长达25base的靶特异性上下游引物5’端前面都加上同一个12～13base长的稀有基因序列，并合成一对长约35～40base的杂合引物对。单管两步法扩增，先加常规量1/20-1/50浓度的这对杂合引物(二聚体量少)，利用其3’端的靶特异性进行长时高温退火结合靶模板，预先少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板，再合成同一稀有基因序列3’端后面加上3-5base的靶特异性引物对5’首端序列而合成的高达90％相同的引物对，常规退火温度退火结合二次模板两侧，最后定量PCR扩增分析。

采用中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行SYBR Green I实时荧光PCR。同序引物对的浓度也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的SYBR Green I实时荧光PCR质量。常规SYBR Green I定量实时荧光PCR最小检出灵敏度可达50拷贝(copy)/次反应，如果需要进一步增加检测灵敏度，既可使用新型SYBR GreenER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。

一、引物对相似度与二聚体形成的实时PCR实验：

采用SYBR Green I荧光染料的实时PCR，在开始的1-15个循环中，靶基因扩增量还不是增加很多，SYBR Green I染料结合双链DNA发出荧光的值很低，到15个循环后DNA增加进入对数期，每个循环产量增加一倍；很快DNA合成的底物和聚合酶急剧消耗，对数后期每一个循环产量不到理论的一倍；最后产量不再增加，进入平台期。所以对数早期定量是最精准的，因此，以最初的1-15个循环平均荧光值作为基线，人为设置高于基线10倍荧光值的循环数作为循环阈值Ct(Cycle threshold)值。初始靶分子稀一倍，扩增达到同样量(同样荧光值)的循环数Ct值就要多一个，反之靶分子浓一倍，Ct值就少一个，为负对数关系。

染料实时荧光PCR定量靶分子Ct值一般在15-30之间定量较准确。问题是一对引物不加靶模板扩增时Ct值往往在30-35之间，甚至在30左右，干扰低浓度靶分子的测定。而双倍量的单一引物不将模板扩增荧光值为一直线，不升高进入对数期，没有Ct读值，也就说单一引物没有二聚体双链形成。

因此选择乙型肝炎病毒HBV靶基因的一条引物HBVR2作为实验，以HBVR2基准引物为人为设计合成系列逐步变异(变异部位以下划线表示)不同的引物作为引物对不加模板扩增，来测试引物对相似程度与二聚体形成之间的关系。

HBVR2：5’-c atg gtg ctg gtg aac-3’

Bia3F3：5’-c atg gtg ctg gtg tct-3’

Bia5F4：5’-g gct gtg ctg gtg aac-3’

BiamF：5’-c atg gtc gag gtg aac-3’

Bia53F：5’-g gac gtg ctg gtg tct-3’

Bia5F7：5’-g gct tca ctg gtg aac-3’

和一条完全倒置反向的HBVR2：

DHBVF：5’-caa gtg gtc gtg gta c-3’

设置6组变异引物对PCR反应：

变异引物作为上游引物F(5μM)             0.5μl

下游HBVR2反向引物(5μM)                 0.5μl

10mM dNTP                               0.5μl

10×Taq buffer                          2.5μl

Taq                                     0.5μl

SYBR Green I                            1.5μl

dH₂O                                    19μl

                                              

25μl

和单一引物HBVR2对照：

下游HBVR2反向引物(5μM)                 1μl

10mM dNTP                               0.5μl

10×Taq buffer                          2.5μl

Taq                                     0.5μl

SYBR Green I                            1.5μl

dH₂O                                    19μl

                                                

25μl

另设一有HBV模板阳性对照：

pUCHBV+P                                0.5μl

上游HBVF2正向引物(5μM)                 0.5μl

下游HBVR2反向引物(5μM)                 0.5μl

10mM dNTP                               0.5μl

10×Taq buffer                          2.5μl

Taq                                     0.5μl

SYBR Green I                            1.5μl

dH₂O                                    18.5μl

                                                  

25μl

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)。首先变性94℃4分钟，然后40个循环，95℃30秒，52℃30秒，74℃30秒。于74℃读取荧光值，并设置52℃-95℃融解曲线分析。

实验结果见图2：除Bia5F7和DHBVF的Ct值明显提前外，其它组Ct值较双倍单一引物实验组对照变化不是很大。

二、引物设计公式和SYBR Green I实时荧光PCR定量：

实时荧光PCR中间部分同序引物对F/R的设计公式为：首先排除任何连续互补碱基序列。

L(LeftTerminal 5’区)+M(Middle中间同序区)+R(Right End 3’端)＝长度16-24base。

L：F/R比对至少不能有3个以上间隔互补碱基的靶特异序列，或F/R为完全同样碱基序列。

M：F/R都为4-10base同样碱基序列并为靶特异序列。

R：F/R为1-5base靶特异序列，其一3’最末端不与另一3’末端最后两碱基互补，亦不能有间隔互补碱基。

SYBR Green I实时荧光PCR定量单个反应：

模板(Template)                       10μl

上游正向引物F(5μM)                  0.5μl

下游反向引物R(5μM)                  0.5μl

10mM dNTP                            0.5μl

10×Taq buffer                       2.5μl

Taq                                  0.5μl

SYBR Green I                         1.5μl

dH₂O                                 9μl

                                            

25μl

实际操作时，每个样本取40μl，加入30μl A液(包括：上游正向引物F 2μl，10mM dNTP 2μl，SYBR Green I 6μl，dH₂O 20μl)和30μl B液(含：下游反向引物R 2μl，10×Taq buffer 10μl，Taq 2μl，dH₂O 16μl)。然后每个样本分取3份X 25μl平行检测，分析统计结果。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)。首先变性94℃4分钟，然后40-45个循环，95℃20-30秒，52℃20-30秒，74℃20-30秒。于74℃读取荧光值，并设置52℃-95℃融解曲线分析。

附图说明：

图1.为三对典型引物对二聚体和三个单一引物实时荧光PCR荧光值图，单一引物荧光值为一直线。

图2.为引物对相似度与二聚体形成的实时荧光PCR循环数Ct值分析，Bian5F7/HBVR₂的循环数Ct28.3，DHBF/HBVR₂的循环数Ct26，其余都约Ct37-38。

图3.为HBV实时荧光PCR定量双份间的平行性和图4的线性分析。

图5.为HBV实时荧光PCR精确定量和图6的线性分析。

具体实施例：乙型肝炎病毒载量实时荧光PCR检测

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR定量法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒载量，对感染者病毒复制水平的判断，病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。

选取乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)X区(1545-1887)序列如下：加粗部分为保守区，划线部分为实时荧光PCR扩增引物。将全长该序列克隆到pUC₁₉载体作为乙肝阳性对照序列。

AB493827X区(1545-1887)

A 

A

G 

G 

A G 

G CAC

CAGGTCT A 

GTC AC 

C 

CTCA 

CA 

G 

ACC 

G CA 

A

A 

AAA G 

G GG 

G 

ATT GT 

A 

G 

C TT G C 

A 

T 

T 

(343bp)

HBV实时荧光PCR定量引物采用以上公式原则设计，引物对序列如下：

HBVQF₁：5’-ctt cgc ttc acc tct g-3’

QHBVR₁：5’-t gcc tac agc ctc cta-3’

因为引物对中间部分同样序列cctc太短，中间突变一个碱基的引物为：

QHBVF₁：5’-ca ctt cgc ttc gcc tct gca-3’

(1)临床血标本DNA提取：取全血200μl.，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳N_aI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％EtOH 的2M N_aI液)洗柱两次，加40μl dH₂O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。

(2)SYBR Green I实时荧光PCR定量反应：

标本DNA(Template)                 10μl

HBVQF₁(5μM)                      0.5μl

QHBVR₁(5μM)                      0.5μl

10mM dNTP                         0.5μl

10×Taq buffer                    2.5μl

Taq                               0.5μl

SYBR Green I                      1.5μl

dH₂O                              9μl

                                       

25μl

实际操作时，每个样本取40μl，加入30μl A液(包括：上游正向引物F 2μl，10mM dNTP 2μl，SYBR Green I 6μl，dH₂O 20μl)和30μl B液(含：下游反向引物R 2μl，10×Taq buffer 10μl，Taq 2μl，dH₂O 16μl)。然后每个样本分取3份X 25μl平行检测，分析统计结果。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)。首先变性94℃4分钟，然后40-45个循环，95℃20-30秒，52℃20-30秒，74℃20-30秒。于74℃读取荧光值，并设置52℃-95℃融解曲线分析。

(3)实验结果(见图3，图4和图5，图6)分析：

图3与图5为不同次HBV实时荧光PCR定量实验结果，样本HBV浓度与测量Ct值线性关系，重复性非常好。

12         15           18          21          24           27           30           33

3.75×10^-6  3.75×10^-7  3.75×10^-8  3.75×10^-9  3.75×10^-10  3.75×10^-11  3.75×10^-12  3.75×10^-13

1.15×10⁷   1.15×10⁶   1.15×10⁵   1.15×10⁴   1.15×10³    1.15×10²    1.15×10     1.15

序列说明

SEQ ID NO.1为检测的靶序列，SEQ ID NO.2～8依次为试验引物HBVR2、Bia3F3、Bia5F4、BiamF、Bia53F、Bia5F7、DHBVF，SEQ ID NO.9～11依次为检测引物HBQF1、QHBR1、QHBF1。

序列表

<110>北京泰格瑞分子检验有限公司

<120>一对部分同序引物减少其二聚体的方法

<160>11

<210>1

<211>343

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒基因组序列

<400>1

ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctgcacgt  60

agcatggaga ccaccgtgaa cgcccaccag gtcttgccca aggtcttaca caagaggact  120

cttggactct cagcaatgtc aacgaccgac cttgaggcat acttcaaaga ctgtttgttt  180

aaagactggg aggagttggg ggaggagatt aggttaaagg tctttgtact aggaggctgt  240

aggcataaat tggtctgttc accagcacca tgcaactttt tcccctctgc ctaatcatct  300

catgttcatg tcctactgtt caagcctcca agctgtgcct tgg                    343

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catggtgctg gtgaac                                                  16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catggtgctg gtgtct                                                  16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggctgtgctg gtgaac                                                16

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

catggtcgag gtgaac                                                16

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggacgtgctg gtgtct                                                16

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggcttcactg gtgaac                                                16

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

caagtggtcg tggtac                                                16

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cttcgcttca cctctg                                                16

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tgcctacagc ctccta                                                    16

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cacttcgctt cgcctctgca                                                20

Claims (6)

1.“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是设计PCR的一对扩增引物最基本原则是尽最大比例的近似单一引物。所述PCR引物对中间区域沿5’-3’方向设置一段4-10BASE同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力；所述引物3’末端预留1-5base，其一3’最末端与另一条3’末端最后两个碱基绝对避免互补，也要避免有间隔的碱基互补。所述中间部分同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对，不要有3个以上间隔碱基互补，从而优化PCR质量。

2.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其设计原则是：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段4～10base完全相同的序列，优选设置6～8base完全相同序列；引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4～10个base靶特异性序列，优选6～8base绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。

3.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行SYBR Green I实时荧光PCR。同序引物对的浓度也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的SYBR Green I实时荧光PCR质量。

4.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是使用新型SYBR Green ER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。

5.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征采用单一引物，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增，先进行长时高温退火少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板，再采用单一稀有基因序列引物，常规退火温度退火结合二次模板两侧定量PCR扩增分析。

6.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”基因扩增试剂盒，成份包括：样本核酸提取试剂，10mM dNTPs，Taq聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物F/R。

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