CN101831491A - 一种系统置换的多重基因扩增技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种系统置换的多重基因扩增技术”，其特征在于系列待测靶基因通过预选探针置换成带系列不同探针的同一报告序列，同一报告序列单管扩增反应指示多重靶分子。所述预选探针指靶基因特异性(/保守)的短序列，并作为检测扩增模板，设置该短模板一对紧邻的探针区引物；所述报告序列指与靶不同源的长序列核酸单链，分成左右部份，其3’末端均预连探针区引物，结合靶基因模板并延伸。置换从第二轮循环开始，探针引物以延伸了的报告序列作为模板，合成包括左右的全长报告序列。再以报告序列两端引物扩增带靶探针的报告系统。通过监测报告系统扩增的不同大小或带不同编码的报告序列，间接指示多重靶分子。一套以上的报告序列可以轮换。

Description

一种系统置换的多重基因扩增技术

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域及分子检测应用领域，涉及一种靶基因扩增置换为报告序列扩增的间接聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)及其检测应用。

背景技术：

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是二十世纪80年代中后期发展起来的体外核酸扩增技术。它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于一、二小时内扩增至一百万倍以上，使肉眼能在凝胶上直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几周至几个月才能克隆得到的一个目的基因，现在用PCR几小时便可完成。

核酸研究历经100多年的探索，从1953年Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构模型后，开启了核酸的分子生物学研究时代。由于各种DNA仅编码遗传信息不同，而理化性能一样，所以微量DNA难以通过理化技术分离纯化及特异性检测。二十世纪70、80年代开发出了基于细菌单克隆筛选基因文库及转化基因的分子克隆技术，但是操作繁琐、耗时。Korana早在1971年就提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现和“链式反应”名称源于美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在1983年的一次灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。

PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～3分钟，  2～3小时就能将待扩目的基因呈指数扩增放大百万倍以上。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。  反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，  即出现“停滞效应”--平台期。Mullis经过两年的研究证实了这一技术，申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

随着ABI-PE等公司开发出各种热循环PCR仪，包括最初的水浴锅式，以及压缩机制冷式和目前广泛应用的半导体制冷式PCR仪。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被发明，包括反转录PCR(RT-PCR)，原位PCR，连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，标记PCR(Labeled primers，LP-PCR)，反向PCR(reverse PCR，扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR(recombinant PCR)，巢式PCR(nest PCR)，多重PCR(multiplex PCR，即在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(Strand displacement amplification，SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)，转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplificationsystem，TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增，滚环扩增(Rolling circleamplification，RCA)，环介导的等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)，和实时荧光PCR(Real-time PCR)等等------。PCR已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，成为现代分子生物学最核心的基础技术。目前全世界与PCR相关的专利已多达数千个以上。

但是指数式扩增的PCR极高的灵敏度易带来交叉污染的假阳性问题，并且存在陈旧性标本因靶基因降解、中间断开而扩增不出的假阴性问题。目前PCR技术仅适用于单个靶基因“点”的检测；将多个PCR系统放在一个反应管中的现存“多重PCR”方法存在非平行的、不对称竞争的扩增问题，难以进行众多靶基因并行扩增的“面”的系统检测。

截止目前，所有PCR技术及各种改进方法均是直接扩增两端已知序列之间的一段DNA的直接PCR途径，即检测A基因就扩增A基因。特异性是由两端引物序列来决定的，对于许多不需要拿到全长基因序列的临床检验、食品安检等应用检测来说，长长的中间序列部分是没有作用的。核酸探针杂交检测技术采用同位素、荧光等标记的短核酸Oligo与靶基因特异序列杂交就只需一段20至30base长的序列即可；但是，杂交探针信号相加的灵敏度远远低于PCR的指数式扩增。本发明“一种系统置换的多重基因扩增技术”检测靶基因也只选择一小段靶基因特异序列(40-60bp长)，通过探针杂交置换成带探针的与靶基因不同源的报告序列(种系最远的保守序列)，再扩增不同源的报告序列，间接指示靶基因。并且众多的靶基因A、B、C……都可置换成带不同探针的同一报告序列系统，一个报告序列PCR反应体系扩增就能同时指示多重靶分子。同一个靶基因亦可选择不同的报告序列1、2、3……，一套污染了就换一套。陈旧性标本降解的特异性短基因碎片仍可有效地系统置换并扩增，亦避免了假阴性反应。

发明内容：

为了克服常规PCR易交叉污染假阳性及靶基因降解假阴性等问题，不易进行多重靶基因并行扩增的“面”检测等的局限。本发明“一种系统置换的多重基因扩增技术”(SystemSubstitute Polymerase Chain Reaction，ssPCR)提供一种靶基因置换成报告系统PCR间接检测途径，即将靶分子DNA/RNA链置换成与靶种系不同源的报告序列DNA，再扩增报告序列间接指示靶分子。

“一种系统置换的多重基因扩增技术”，其特征在于一种或N种待测靶基因系统置换成带一种或N种不同探针的与靶不同源的同一报告序列系统，同一报告序列PCR扩增、同时指示多重靶分子。其特征还在于同一个靶基因预先选择的多个特异杂交检测区亦可置换成不同的报告序列1、2、3……，一套工作时污染了就换一套轮换使用。其特征还在于所述系统置换扩增的目的片段是短的靶预选杂交检测区，将不同源的长报告序列加在短探针检测区扩增引物外侧，扩增短检测区片段就带上了外侧长报告序列。所述探针引物是指能与靶预选杂交检测区识别杂交的引物序列。

所述一种或N种待测靶基因DNA链/RNA链通过预选它们的一小段特异序列或保守序列作为一种或N种探针杂交检测序列。所述预先选择的靶特异性杂交检测序列均分成左右两部份，即左半部分杂交区及相应互补的左半探针序列；右半部分杂交区及相应互补的右半探针序列。所述左半探针以有意义链序列接在一段与靶不同源的报告序列左半部分单链3’端后面；右半探针以反意义链序列接在同一报告序列右半部分单链3’端后面；形成带探针的左右报告序列。所述系统置换是指左右报告序列以所带的探针部分作为引物特异性识别靶基因预选杂交区并结合、延伸。采用Taq、Tth等耐热聚合酶，优选热启动聚合酶置换扩增(变性--退火--延伸反复反应)，从第二轮循环开始，带半边探针的左右(或上下游)报告序列就能以延长了的报告序列新合成链作为模板并结合、延伸，合成全长的，包括含中间左右探针序列的完整报告序列。所述报告序列扩增是指以与靶不同源的报告序列两端序列作为引物，间接PCR扩增中间带左右探针序列的报告序列，同时也扩增了其中间的探针序列，间接指示了靶基因分子。

所述靶预选特异性杂交区指靶基因特异性的或种型间最保守的短遗传序列，其序列长度为30-100base，优选40-60base左右，平均分成左右两部份。所述与靶不同源的报告序列长度为50-1000base，优选100-500base左右，所述与靶不同源报告序列是指指与靶基因同源性最小的、非特异性杂交最少的任何基因保守序列或人造核酸序列，检测动物类标本时一般采用植物源的保守基因作为报告序列，反之检测植物类标本时采用动物源的稀有序列作为报告系统。所述带探针报告序列是指不同源报告序列不对称分成左右后加在探针均分的左右部份5’端前面，优选报告基因中间分开再倒置后连接探针，进而采用报告基因中间分开处的两小段序列，其右边一段有意义链作为报告系统PCR上游引物，左边一段反意义链作为报告系统PCR下游引物，即使有报告基因污染亦不会非特异性扩增。所述带探针报告序列单链的制备选用商业化学合成，不对称PCR扩增、纯化，一端生物素标记引物PCR与链亲和素固相去除法和M13质粒产生单链等生物、理化方法。

所述系统置换多重基因扩增技术(ssPCR)一样适用于常规PCR应用检测领域范围。包括PCR及产物凝胶电泳检测、实时荧光PCR(Real-time fluorescence PCR)检测，PCR产物生物芯片微阵列(Micro-Array)分析，以及分子组化，分子病理原位PCR。也适合遗传变异检测、高度同源种属亚型鉴定及单核苷酸多态性SNP分析。

ssPCR最初的思想就是考虑到传统PCR扩增长的或较长的整个片段基因适合于想得到完整DNA的基因研究，而临检、安检等应用检验仅需要放大检测靶基因一小段最特异或最保守的代表性特异序列。但怎样放大这一短序列？靶基因代表性序列作为预先选择的杂交区，怎样通过某种方式的探针杂交转换？再指数扩增、放大含靶探针序列的一个替换报告系统？

由于传统PCR技术难以扩增小于100bp以下的短DNA序列，包括短Oligo探针。所以自然而然想到在探针两端加上无关的其它核酸序列(自然发展到不同源的、种系远的DNA序列)作为报告序列。短DNA代表性杂交区虽然不能PCR扩增，但仍能分成左右两半合成上下游引物并能与靶基因预选杂交区结合(退火)延伸，合成完整的杂交区新链，如此上下游引物外侧加上一些长长的序列不就可以大于100bp长，进而就可以PCR扩增了。

ssPCR基本原理(图1)：一种靶基因置换成报告系统PCR间接检测技术，采用的一条主要途径是首先以靶基因预先选择的短特异序列作为模板，以该预选序列左半、右半部分相应序列为上下游引物。由于PCR特异性由引物3’端一段决定，引物5’端可加上无关序列的特点。外侧与报告序列相联的该上下游引物仍能扩增靶基因预选的模板序列，生成中间为靶预选模板序列，两侧为与靶不同源的报告序列的长片段DNA。再以报告序列两端的序列作为第二步扩增引物，扩增够长的报告序列，间接指示靶分子。具体就是将目的靶基因预先选择的特异性杂交区序列分成左右两部份，即左半部分(靶杂交区上游序列)杂交区及相应互补的左半探针序列；右半部分(靶杂交区下游序列)杂交区及相应互补的右半探针序列。左半探针以有意义链序列接在一段与靶不同源的报告序列左半部分(或倒置报告下游序列)单链3’端后面；右半探针以反意义链序列接在同一报告序列右半部分(或倒置报告上游序列)单链3’端后面；形成带探针的左右(或上下游)报告序列。报告序列就能以所带的探针部分特异性识别靶基因预选杂交区并结合、延伸。经初次置换PCR扩增(变性--退火--延伸反复反应)，从第二轮循环开始，带半边探针的左右(或上下游)报告序列不仅能与靶模板结合、延伸，也能以延长了的报告序列新合成链作为模板并结合、延伸，合成全长的，包括含中间左右探针序列的完整报告序列。再次间接PCR扩增，以与靶不同源的报告序列两端序列作为引物，扩增全长完整的报告序列，同时也就扩增了其中间的探针序列。

“一种系统置换的多重基因扩增技术”(ssPCR)方案步骤：

带探针报告序列单链的制备：

带探针报告序列是指将靶系统置换为报告系统间接扩增分析时加入反应体系中的一对探针序列与报告序列重组的DNA单链。通常由3’末端一段预选靶杂交区的引物序列和5’末端一段与靶不同源的报告序列组成。包括设置对称短报告序列，不对称左短右长和左长右短三种报告序列方式(图2)。一对通用公式为：5’-与靶不同源的报告序列左半部分单链-左半预选杂交区有意义链序列-3’；和5’-与靶不同源的报告序列右半部分单链-右半预选杂交区反意义链序列-3’；其中不同源报告序列可以左半部分取有意义链，右半部分就取反意义链；或反之左半取反意义链，右半就取有意义链。

一种目的靶基因可以选取1段或n段作为特异性杂交区序列，每段约30-100base(优选40-60base左右)，均分成左右两部份，即左半部分(靶上游序列)杂交区以有意义链作为相应靶杂交区上游引物或探针序列；右半部分(靶下游序列)杂交区以反意义链作为相应靶杂交区下游引物探针序列。选取一段与待测基因无关不同源的，或种系较远的基因序列约50-1000base(优选100-500base左右，也包括利用电脑设计同源性最小的人造序列)作为报告序列1，另一段无关不同源的序列为报告序列2，…以此类推…n等，所有报告序列亦均分成左右两部份直接或分别倒置后加在左右探针序列或靶上下游引物序列5’端前面。特异性杂交区序列1对应报告序列1，特异性杂交区2对应报告序列2，……以此类推，等等。同一个靶基因多个特异杂交区1……n段可以按通用公式选择不同的报告序列1、2、3……生成多套不同的带探针报告序列，包括多套带左右(或上下游)探针的左右报告序列，一套工作时污染了就换一套轮换使用。

N种不同待测靶基因A、B、C……，每种均可选取1段特异性杂交区序列，按通用公式生成带N种(或N重)不同探针的同一报告序列系统，同一个报告序列PCR反应体系扩增就能同时指示N种(或N重)靶分子。而且N种不同待测靶基因A、B、C……，每种亦可以选取另1段或n段特异性杂交区序列，按通用公式生成带N种(重)不同探针的另1套或n套同一报告序列系统，同一个报告序列PCR反应体系扩增间接指示多重(种)靶分子。一套N重报告序列系统污染了亦可换成另一套N重报告序列系统指示多重靶分子。

带探针报告序列单链较短时，带左右(或上下游)探针的左右报告序列＜60base时，可以化学合成(商业寡核苷酸Oligo合成)；带探针报告序列单链较长时，左右报告序列就必需不对称分成左右两边，一边短报告序列SR(Short Report)单链＜60base就可以化学合成，另一边长报告序列LgR(Long Report)单链＞60base采用不对称PCR制备，或一端生物素标记引物PCR再链亲和素固相去除产生，或M13质粒产生单链等生物、理化方法制备。

长报告序列LgR制备生产采用常规PCR方法扩增一段长的与靶不同源报告基因片段时，利用PCR引物仅3’端决定特异性，5’端可以设置任意一段非特异性序列的特点。将左或右探针序列预先加在左或右长报告基因制备引物5’端前，即将左或右探针序列以有意义链或反意义链序列3’端加在报告基因序列外侧端制备引物5’端前面合成带有首端探针序列报告基因引物F，长报告序列LgR以左右分开处序列作为另一端PCR引物R；扩增一端带探针的报告基因。或者以带酶切位点的此对引物PCR扩增带探针的报告基因，酶切，克隆至质粒载体，产生带探针的报告基因质粒。生产带探针报告基因时，以该质粒为模板，以此对制备引物F/R及pfu等高保真聚合酶常规PCR方法扩增与靶不同源报告基因片段，产生一端带左或右半边探针序列的长报告序列DNA双链。以此凝胶电泳纯化的双链DNA十倍以上稀释后作为模板，以单引物-长报告序列左右分开处序列引物及pfu聚合酶经30-300循环(优选50-100循环)不对称PCR扩增产生3’端带左或右半边探针的长报告序列LgR单链，再三倍体积乙醇沉淀或DNA结合柱纯化。或者以生物素标记的带首端探针引物和长报告序列左右分开处序列引物常规PCR扩增，产物经95℃变性后快速冰浴冷却，固相分离如链亲和素交联的Sepharose 4B/磁珠结合去除生物素标记单链。残存的少量双链可由探针与报告序列连接处预设EcoRV等位点酶切降解。

靶系统置换报告系统反应：

系统置换反应是指将待测全长靶基因置换成仅中间部份带靶探针30-100base(优选40-60base左右)序列的与靶不同源的50-1000base(优选100-500base左右)报告序列系统的一种技术途径。本发明采用靶基因预选的短特异区左右引物外侧加上报告序列，与靶特异区结合延伸，扩增短特异区时就带上了外侧预加的报告序列。置换成与靶不同源系统可以带来最终检测系统与标本种系非特异性交叉反应最少等一系列的优点及检测系统性能包括准确性、灵敏度、多重检测等极大的提升。

置换检测PCR对待测标本DNA/RNA的纯度要求不高，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，含DNA粗制品及总RNA包括临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、组织切片等均可直接作为扩增模板。根据不同的检测标准可采用不同的富集、纯化方法。待测液态标本(不含离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠[小于0.06％]，十二烷基肌氨酸钠[小于0.02％]，十二烷基硫酸钠[SDS，小于0.01％]等抑制剂)可取样2-40μl直接置换扩增。小量待测DNA标本(少于200-300μl的液态标本或小于0.5g固体标本研磨、蛋白酶K消化后)经等量酚-氯仿抽提，上清加碘化纳(N_aI)至2M于质粒小提DNA结合柱纯化，40μl dH₂O洗脱液置换扩增，标本0.5ml(0.5g固体)-25ml(25g固体研磨，蛋白酶K消化)经等量酚-氯仿抽提，上清加碘化纳(N_aI)至2M于质粒大提DNA结合柱纯化或酒精沉淀浓缩，更大体积低丰度靶分子的标本亦可采用靶基因互补Oligo固相Sepharose 4B/磁珠结合富集。

待测RNA标本少于0.1ml(或小于0.1g固体切碎、研磨)加Trizole(0.5ml 4M异硫氰酸胍，0.5ml酚，0.05ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加100μl氯仿振荡，离心分层5分钟，取上清加等量异丙醇置-20℃2小时再离心沉淀，70％乙醇洗涤沉淀一次，加40μl DEPC处理的dH₂O溶解。大体积组织标本须研碎、匀浆，经蛋白酶K消化和相应加大Trizole等试剂比例来纯化，更大量低丰度靶分子的标本亦可采用Oligo-dT或靶基因互补Oligo固相结合富集。

待测标本或纯化核酸2-40μl加入1+1μl的0.01μM-1μM(优选0.05μM-0.5μM)左加右带探针报告序列单链进行置换，以Taq等常规耐热聚合酶置换扩增，优选热启动耐热聚合酶；对于RNA靶基因，选择Tth等可以RNA为模板的耐热聚合酶，或者Taq+Tth置换扩增。首先95℃高温变性4分钟，然后经2-50个循环(优选5-20个循环)95℃变性30秒，50℃-70℃(优选60℃-65℃)置换反应1-2分钟以利于较低浓度靶分子与报告序列探针充分退火结合，再72℃充分延长30秒。带左或右探针的左或右报告序列就能与新延长了的带全长整个探针序列的左或右报告序列的新合成探针部份为模板杂交、延伸，指数式置换扩增，生成左右相加的带完整探针的全长左加右报告序列。DNA双链在60℃-65℃处于动态热平衡状态，使带探针报告序列更易于置换，且高温双探针置换模式的特异性较常规PCR技术54℃退火--延伸高很多。由于报告序列探针结合短的靶预选特异区后仅需延伸20-30base很短的长度，所以Tth聚合酶的RNA逆转录置换效率远高于常规RT-PCR的全长模板RNA逆转录；并且在N种不同待测靶基因A、B、C……并行置换为带N种或N重不同探针的同一报告序列系统时，靶基因不同种之间的高温退火-延伸很短的置换效率差异最小，保证了多重置换的平行性。

带探针报告系统间接扩增反应：

报告系统扩增反应是指中间部份带短靶探针40-60bas序列的与靶不同源的50-1000base(优选100-500base左右)报告序列系统的扩增反应，间接指示靶基因分子。以带靶探针的报告序列置换长片段为模板，选用报告基因两端序列作为上下游引物；最好优选报告基因中间分开后倒置连接探针，再采用报告基因中间分开处的两小段序列，右边一段有意义链作为报告系统间接扩增上游反向引物，左边一段反意义链作为报告系统间接扩增下游反向引物，反向PCR扩增报告基因，即使有报告基因污染亦不会非特异性扩增。由于报告序列间接扩增系统与标本种系远，非特异性交叉反应最少。报告系统反向PCR扩增在Taq等常规耐热DNA聚合酶(优选热启动聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对复制原理，从预选报告基因中间分开的反向引物处开始复制，向报告基因两侧端连接的探针处延伸，合成与中间带完整靶探针40-60bas序列的全长100-500base左右报告序列系统互补的新链。首先95℃高温变性4分钟，然后经25-50个循环(优选30-35个循环)的变性--退火--延伸三过程：95℃变性30秒，45℃-60℃(优选50℃-55℃)退火30秒，再72℃延长30秒至1分钟(根据报告系统长短不同而定)，完成30-35个循环后，最后72℃再延长10分钟，指数式反向扩增带中间探针的报告系统。

报告系统反向引物一般15-20base长，退火温度Tm值设置为45℃-60℃(优选50℃-55℃)，较置换反应温度低10℃度时，置换反应与报告系统反向扩增就可以在同一反应管中先后分两步反应，通过控制置换反应退火温度60-65℃，报告系统反向扩增退火温度50-55℃。在高退火温度60℃时先进行置换反应，随后在低退火温度50℃时再进行最终报告系统反向PCR扩增。从而可以进行靶置换和带探针报告系统反向扩增的单管反应。靶置换与报告系统反向PCR均是指数式扩增，整个系统灵敏度高于常规PCR检出率数千倍以上，类似巢式扩增(Nest PCR)。

靶置换报告系统反向扩增技术的双探针杂交特异性高，单探针序列非特异性吸附不会置换成报告系统及不会产生预设大小的报告系统扩增。但靶置换与报告系统反向PCR扩增产物仍必须采用不同的方法分析与鉴定。实时荧光监测可在上述报告系统扩增反应液中加入稀释的SYBR Green I试剂(或各种荧光标记探针)，上实时荧光PCR仪扩增，测定循环阈值(Ct)，即以扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，与起始靶DNA拷贝对数存在负线性关系。或者电泳检测：一至十几种不同待测靶基因A、B、C……置换多重系列不同大小的同一种报告序列PCR产物单向传递至一间专门独立的电泳实验室，经凝胶电泳(/毛细管电泳)分析不同大小报告片段间接指示多重靶基因分子。更多的N种不同待测靶基因A、B、C……置换带N种(重)不同探针的同样大小同一报告序列PCR产物须经靶基因预选区N种探针微阵列(Micro-array)分析；或者采用报告基因中预设的编码标签(tag)序列微阵列(Tag-array)分析。组织切片靶基因预选特异区可以置换报告序列原位荧光扩增，用荧光显微镜检测。

“一种系统置换的多重基因扩增技术”(ssPCR)操作流程：

(一)待测标本的纯化：

标本核酸DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸或商业DNA结合柱(Qiagen公司)纯化。提取的DNA即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

1.样本DNA的纯化：

(1)蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿，粪便等。有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等。

临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液(0.5％SDS与0.1-0.2mg/ml蛋白酶K的TEbuffer)200～300μl.混匀，55℃1～3小时，或37℃过夜.加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提1～2次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳N_aI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％EtOH的2M N_aI液)洗柱两次，加50μl dH₂O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。

蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本后，离心，取上清经煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于ssPCR扩增。如杂质较多，还可经酚：氯仿抽提后，即可用于ssPCR反应。

(2)直接裂解法：标本(组织细胞，分泌物)加PBS或生理盐水后，加0.5％NP-40和0.5％吐温-20裂解液200～300μl，95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞。.然后15000r/min离心5～10min，取上清2～40μl用于ssPCR扩增。血清标本可直接加等体积的消化液，加热处理离心后ssPCR扩增。亦可用5％的NP-40和1.5％2-ME做裂解液，95℃30min消化处理，离心取上清，ssPCR扩增。

(3)碱变性法：取血清200μl，加入1mol/L NaOH 20μl，37℃30min，离心，加1mol/L HCl20μl，离心后，取上清2～40μl，用于ssPCR扩增。亦可用200μl血清加NaOH至0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和离心后取上清2～40μl做ssPCR，其特异性和敏感性较前法更好。

(4)煮沸法：经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量生理盐水或PBS，混匀后，100℃煮沸10～15min，15000r/min 10min，取上清2～40μl做ssPCR。

2.RNA样本的纯化：

异硫氰酸胍一步法提取总RNA(Chomczynski，P.et，al.1987 Anal.Biochem.Vol 162，156)。

样本于EP管中加1ml的Trizole(0.5ml 4M异硫氰酸胍，0.5ml水饱和酚，0.05ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加100μl氯仿振荡，离心10分钟，取上清加等量0.5ml异丙醇置-20℃2小时再离心沉淀，75％冷乙醇洗涤一次，加50μlDEPC处理的dH₂O溶解。一般没有必要纯化mRNA。待测靶基因低丰度标本亦可采用靶基因互补的短Oligo固相结合富集。

或者～100mg组织/10⁷细胞先加1ml变性消化液(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5％十二烷基肌酸钠和0.1M β-巯基乙醇)匀浆，及吸管抽吸10-20次后，再加0.1体积的2M乙酸钠(pH4.0)和1ml水饱和酚混匀，加入0.1体积的49∶1氯仿/异戊醇，离心，上清加等量异丙醇沉淀。

(二)带探针报告序列单链的制备：

带探针报告序列是一对由3’末端一段预选靶杂交区的引物序列和5’末端一段与靶不同源的报告序列组成的两条重组序列单链。较长报告序列常不对称分成左右两边，一边短的报告序列SR(Short Report)单链40-60base化学合成，另一边长的报告序列LgR(Long Report)单链＞60base采用不对称PCR制备。

根据一对通用公式：5’-与靶不同源的报告序列左半部分倒置反意义链-左半预选杂交区有意义链引物序列-3’；

和5’-与靶不同源的报告序列右半部分倒置有意义链-右半预选杂交区反意义链引物序列-3’。

(1)化学合成短的带探针报告序列单链：

按以上通用公式设计序列5’-短边报告序列-半个预选杂交区引物序列-3’，

采用自动化固相亚磷酰胺三酯法化学合成短报告(Short Report)SR单链，并PAGE凝胶电泳纯化。

(2)不对称PCR扩增长的报告基因并琼酯电泳纯化：

按以上通用公式的设计序列5’-长半边报告序列-另半预选杂交区引物序

列-3’，商业合成长报告序列(Long Report)LgR引物F/R。

第一步常规PCR产生双链DNA：

带探针不同源长报告基因质粒      1μl

带探针端报告基因引物F(5uM)      1μl

中间分开处报告基因引物R(5uM)    1μl

10×pfu buffer                  5μl

10mM dNTP                       1μl

pfu                             1μl

dH₂O                            40μl

                                         

                                50μl

首先变性94℃5分钟，再25个循环，95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒。

经25个循环后72℃10分钟。PCR产物琼酯糖凝胶1.5％Agarose电泳，透析袋回收沉淀或DNA回收试剂盒纯化，重新50μl dH₂O溶解DNA。

第二步不对称PCR产生报告序列单链：

第一步纯化双链DNA               1-5μl

中间分开处报告基因引物R(5uM)    0.5μl

10×pfu buffer                  10μl

10mM dNTP                       0.5μl

pfu                             1μl

dH₂O                            83-87μl

                                              

                                100μl

首先变性94℃5分钟，再50-100个循环，优选60个循环，95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒。单链PCR产物加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和3倍无水乙醇沉淀或DNA结合柱试剂盒纯化，重新100μl dH₂O溶解报告序列单链。

(三)合成报告系统反向PCR引物：

取报告基因序列中间分开相邻处的两段约～17+～17base长的序列，右半部分15-20base长的有意义链序列作为上游反向PCR引物RevF，左半部分15-20base长的反意义链作为下游反向PCR引物RevR。实时荧光PCR反向引物最好经PAGE凝胶电泳纯化。

(四)靶置换及带探针报告系统反向扩增的单管反应：

靶系统置换报告系统的置换探针退火温度Tm值设置较最终报告系统上下游反向引物退火温度Tm值高于摄氏10℃度时，置换反应与报告系统反向扩增就可以在同一反应管中先后分两步反应，通过控制置换反应退火温度60-65℃，报告系统反向扩增退火温度50-55℃。在高退火温度60℃时先进行置换反应，随后在低退火温度50℃时再进行最终报告系统反向PCR扩增。

待测液体样本                  2μl

左右带探针报告基因单链        1+1μl

上游反向引物RevF(10uM)        2μl

下游反向引物RevR(10uM)        2μl

10mM dNTP                     2μl

10×Taq buffer                5μl

Taq                           2μl

dH₂O                          33μl

                                        

                              50μl

第一步置换反应：变性94℃4分钟，10-20个循环，95℃30秒，60℃1-2分钟，72℃30秒。第二步终报告系统反向扩增：置换步骤后直接进行30-35个循环，95℃30秒，50℃30秒，72℃30-60秒。反向扩增35个循环后72℃10分钟。

(五)终报告系统反向PCR产物分析：

靶置换报告系统反向扩增产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须进行进一步的分析与鉴定，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

(1)实时荧光PCR分析：采用热启动聚合酶减少引物二聚体延伸的高背景。当报告系统较短(～100bp)时，在上述报告系统扩增反应液中加入1-2μl 10³倍的SYBR Green I贮存液，并做融解曲线；或者报告系统较长时，加入Taqman、Molecular beacon、Dual hybridization probes andScorpion probe等任一种荧光标记探针，经实时荧光PCR仪(激发光494nm，发射光波长530+-15nm)扩增，荧光强度对循环数作荧光动态曲线。测定循环阈值(Ct)，即以扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，与起始靶DNA拷贝对数存在负线性关系。

(2)凝胶电泳分析：PCR产物经双链DNA荧光染料溴乙锭EB预染琼脂电泳(或电泳后SYBR Gold染色)及紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致。

琼脂糖凝胶电泳：一至十几种不同待测靶基因A、B、C……置换多重系列不同大小的同一种报告序列PCR产物单向传递至一间专门独立的电泳实验室，经1.2％-2％琼脂糖凝胶电泳分析不同大小报告片段间接指示多重靶基因分子。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

(3)分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。包括Southern印迹杂交，斑点杂交，和生物芯片(Micro-array)杂交。更多的N种不同待测靶基因A、B、C……置换带N种(重)不同探针的同样大小同一报告序列PCR产物须经靶基因预选区N种探针微阵列(Micro-array)分析。

(4)原位PCR分析：组织切片中的靶基因预选特异区可以置换报告序列原位荧光扩增，用荧光显微镜检测。

本发明主要优点集中表现在：

(1)常规直接PCR，标本基因太复杂，非特异性背景高。ssPCR扩增的置换报告基因是预选的，单一，背景干净。双探针杂交模式准确性好，两步指数式扩增灵敏度高。标本不用DNA/RNA提取纯化，粗制品就可直接PCR检测。

(2)多种不同待测靶基因A、B、C……可置换成带多重不同探针的同一报告序列PCR扩增，高通量的单管单系统多重PCR技术(“面”的PCR)。适合多重探针微阵列(Micro-array)分析。

(3)待测靶基因可置换成一系列的不同报告基因，一套污染了就可立即换一套系统，规避了一套系统的常规PCR易交叉污染。换系统而不用换污染实验室。

(4)遗传变异基因、降解短DNA片段、各种RNA均可直接置换成报告基因序列DNA扩增，无需常规逆转录步聚，适用范围广泛，不易漏检。

附图说明：

图1.基本原理示意图：

靶基因以横线代表，其中粗直线为有意义链，细直线为反意义链，中间为一段预选短探针区。

报告序列以斜线代表，分成左右部份，其3’末端均预连探针区引物，结合靶基因模板并延伸。

置换从第二轮循环开始，探针引物以延伸了的报告序列作为模板，合成包括左右的全长报告序列。短箭头表示一对报告序列引物，最后扩增全长报告序列。

图2.报告序列的三种设置方式：

A.代表对称的短报告序列；

B.代表左边短，右边长的一对报告序列；

C.代表左边长，右边短的一对报告序列。

图3.实时荧光PCR代表性结果：

曲线从左至右分别为A₆管：置换PCR强阳性扩增；A₈管：常规PCR阳性扩增；A₁₀与A₁₂管均为阴性对照。

图4.食品安检致病菌凝胶电泳结果：

M为DNA Markers；泳道No.1-4为阳性质粒对照，No.5为四种阳性模板混合的四重PCR，No.6为阴性pUC₁₉对照；泳道No.7-9是样品测试，7号为霉菌污染，8号为金葡菌污染，9号为疑似污染。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一.食品安检致病菌核酸置换多重PCR

食品安全检测(以下简称食品安检)尤其分子检验是有效解决食品卫生安全“把关性”的技术手段。“民以食为天”，“病从口入”等谚语形象的表达了食品安全在人民健康生活以及社会安定和谐方面的重要性。由于快速的工业化及全球化，食品已从小农经济生产转向大工业化加工为主，港澳、韩、日等发达地区食物主要依赖从大陆进口。在食品原料采购、生产加工、包装存储、运输流通、贸易销售等所有环节都有污染微生物的可能，尤其常见的沙门氏菌、霉菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，对人体健康危害较大。这类人畜致病微生物的检测主要依赖培养检测纸片法如美国3M公司的PF(Petrifilm)培养试纸。但仍存在培养费时，分菌种操作繁琐，不能确证、鉴别分型，尤其检测不出热加工了的食物污染。免疫学方法检测食品也繁琐，灵敏度不够，比较不成熟。确证还有赖于核酸扩增检测PCR技术尤其实时荧光PCR(Real time PCR)技术的应用。

食品安检致病菌的核酸扩增检测是以各菌种菌属特异性遗传物质——高度保守的核酸序列为扩增模板，以两端序列设计引物，对提取的细菌核酸片段进行扩增，实时荧光PCR仪监测，或用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。PCR指数方式扩增理论上一个污染细菌(单个拷贝)就可以放大检测，但其极高的灵敏度亦会带来易交叉污染，安检实验室进行反复同样的标本操作，不久就会带来难以根除的假阳性污染问题。而且食物烹煮、煎炸、烘烤、焙制等加工会降解破坏污染的细菌基因组，其基因碎片常规PCR从两端扩增基因片段的方法因中间断开而扩增不出，常导致安检食品假阴性结果。本发明“一种系统置换的多重基因扩增技术”同时用于食品安检多种致病菌，只检测每种菌特异基因的一段45-60base短保守区，基因降解部位往往是随机的，总会留下许多待测短片段相对完整，不致漏检假阴性。四种致病菌通过短保守区探针的杂交置换，产生带四种中间短保守区探针的同一报告序列，同一报告系统的扩增同时指示了四种致病菌的污染。这对食品污染众多的可能病菌、变异亚型的单管多重检测应用极大的提高了检测效率，降低了系统成本。况且，每种致病菌可另选一系列的短保守区作为检测置换靶探针，置换成带相应靶探针的一系列报告系统。一套报告系统扩增时，如阴性对照污染了就换一套系统，而不用更换污染了的实验室、设备及人员，为最有效地防止交叉污染的新概念途径。

“食品安检致病菌核酸置换多重PCR”是单管PCR可同时检测食物中四种常见污染致病菌的置换报告系统扩增技术。分别选取致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和霉菌的特异性序列各约45-60base作为靶探针。与这些致病菌种系远的植物拟南芥LFY一段保守区作为检测报告序列。将四种靶基因置换成带四种靶探针的同一(但大小不一)LFY报告序列，即置换为仅中间部份不同的带大肠杆菌探针的约200bp指示片段、带金葡菌探针的约250bp片段、带沙门菌探针的约300bp片段、带霉菌探针的约350bp片段。同一管置换PCR扩增生成大小不同的报告基因片段。经凝胶电泳，不同大小条带就指示不同致病菌的污染情况。

(一)报告基因的制备：

选取与食品常见污染菌霉菌、沙门氏菌、金葡菌和致病大肠杆菌等种属很远的植物拟南芥LFY基因一段序列(CDS nt62-362)作为整个四重系统置换共同的报告基因序列。其部分有意义链(Sense chain)序列如下：

AGCACCACCTCCGGTTCCACCTCCGCTGCAGCAACAGCCGGTGACACCGCAGACGGCTGCTTTTGGGATGCGACTTGGTGGTTTAGAGGGACTATTCGGTCCGTACGGTATACGTTTCTACACGGCGGCGAAGATAGCGGAGTTAGGTTTTACGGCGAGCACGCTTGTGGGTATGAAGGACGAGGAGCTTGAAGAGATGATGAATAGTCTCTCTCATATCTTTCGTTGGGAGCTTCTTGTTGGTGAACGGTACGGTATCAAAGCTGCCGTTAGAGTTGAAC-GGAGACGATTGCAAGAAGAG

截取该序列片段长度300base加上霉菌预选探针50base产生350bp片段，取该序列截短一点长度近250base加沙门氏菌探针50base产生300bp片段，取该序列再截短一点长度近200base加金葡菌探针50base产生250bp片段，再取该序列更短一点长度近150base加致病大肠杆菌探针50base产生长约200bp片段。从以上LFY序列“-”处不对称分成左右两部份，分别取短有意义(sense)链、长反意义(antisense)链加在靶基因预选探针杂交区上下游引物前面。但为易于重复规模化生产，最便捷的途径是将靶探针序列与报告基因预连接的重组带探针报告序列克隆至质粒载体，可以长期贮存、随时制备阳性重组质粒，并以该提取质粒作为不对称PCR模板扩增生产长的带探针报告序列。四种不同截短的报告序列都可以从一端逐渐后退截短，但考虑到一对带探针报告序列既可以取左边短右边长报告序列，也可以设置左长右短报告序列，为便于从同一阳性质粒既可以制备左边长报告序列，又能够制备右边长报告序列，四种不同长短的报告序列都是从中间逐渐截掉一段序列，再在其两端加上左右探针序列。即将右侧探针序列以sense链加在扩增LFY上游引物前面，将左侧探针序列以antisense链加在扩增LFY下游引物前面，重组片段克隆至质粒载体。从中间逐渐截短的另外三种不同大小LFY片段列于下面：

近250base的LFY序列

AGCACCACCTCCGGTTCCACCTCCGCTGCAGCAACAGCCGGTGACACCGCAGACGGCTGCTTTTGGGATGCGACTTGGTGGTTTAGAGGGACTATTCGGTC--GAGCACGCTTGTGGGTATGAAGGACGAGGAGCTTGAAGAGATGATGAATAGTCTCTCTCATATCTTTCGTTGGGAGCTTCTTGTTGGTGAACGGTACGGTATCAAAGCTGCCGTTAGAGTTGAAC-GGAGACGATTG CAAGAAGAG

近200base的LFY序列

AGCACCACCTCCGGTTCCACCTCCGCTGCAGCAACAGCCGGTGACACCGCAGACGGCTGCTTTTGGGATGCGACTTGGTGGTTTAGAGGGACTATTCGGTC----GTCTCTCTCATATCTTTCGTTGGGAGCTTCTTGTTGGTGAACGGTACGGTATCAAAGCTGCCGTTAGAGTTGAAC-GGAGACGATTGCAAGAAGAG

近150base的LFY序列

AGCACCACCTCCGGTTCCACCTCCGCTGCAGCAACAGCCGGTGACACCGCAGACGGCTGCTTTTGGGA------CGTTGGGAGCTTCTTGTTGGTGAACGGTACGGTATCAAAGCTGCCGTTAGAGTTGAAC-GGAGACGATTGCAAGAAGAG

1.霉菌(Mold/Mould)报告基因的制备

霉菌属丝状真菌，种类较多，常见有青霉、镰刀菌、赤霉、根霉、毛霉、木霉、孢霉、曲霉及黄曲霉等，食物在阴湿环境下易发霉并产生霉毒素。根据各种霉菌相对保守的18SrRNA编码基因，对比寻找到一小段共同保守区域，即(Aspergillus niger B5株18S rRNA nt636-679)作为霉菌预选探针序列。

CCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGT-CCGGCTGGACCTTTCCTTCTTCTGGGGA其右半部分有意链3’端加在300bp LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在300bpLFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游MolF；下游MolR：

上游：CCGGCTGGACCTTTCCTTCTTCTGGGGA与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与CCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGT其反意

义链：ACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGG与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物并加上BamHI/EcoRI酶切位点，设计如下：

H1MolF：5’-cg gga tccCCGGCTGGACCTTTCCTTCTTCTGGGGAAG-3’

MolF₁：5’-CTTTCCTTCTTCTGGGGAAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1Mol R：5’-cg gaa ttcACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCTC-3’

Mol R₁：5’-GTGAGGCGGACCGGCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

以拟南芥提取核酸为模板，引物H1MolF∶MolF₁(9∶1)/Mol R₁∶R1Mol R(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规分子克隆方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-Mol，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列可以根据两端带探针的全长报告序列质粒模板进行取舍，本实施例取左短(ShortMol)右长(LongMol)报告序列设置。ShortMol：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGT-3’

LongMol：以引物LgMou F：5’-CCGGCTGGACCTTTCC-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链引物LgFood R：5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’和pUC-Mol模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-Mol                1μl

LgMolF(5μM)           1μl

LgFood R(5μM)         1μl

10mM dNTPs             1μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu聚合酶              1μl

dH₂O                   40μl

                                   

                       50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                    5μl

LgFood R                   0.5μl

10mM dNTPs                 0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液        5μl

pfu酶                      1μl

dH₂O                       88μl

                                   

                           100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因LongMol。

2.沙门氏菌(Salmonella)报告基因的制备

沙门氏菌是引起食物中毒最常见肠杆菌。尽管血清型繁多，但沙门氏菌表面普遍存在的侵袭蛋白A(Invasion protein A，inv A)最具代表性，其基因在沙门氏菌属相当保守。Malorny等利用inv A基因对364个菌株，得出以inv A基因为目的基因检测沙门氏菌的检出率为99.6％，排除率为100％的实验结果。4个欧洲实验室联合对435个天然样品的检测结果表明以inv A基因为目的基因检测沙门氏菌的特异度和准确度高达97.5％。因此，我们选取侵袭蛋白A(invA)基因中的一段共同保守序列作为沙门氏菌预选探针杂交区，即Pullorum1794株nt52-90，ACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGA-TCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTAC。

其右半部分有意链3’端加在近250bp(中间截掉一段)的LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在近250bp LFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游SalF；下游SalR：

上游：TCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTAC与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与ACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGA其反意

义链：TCATCACCATTAGTACCAGAATCAGT与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物如下：

H1SalF：5’-cg gga tccTCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACAG-3’

SalF₁：5’-GTTCGTCATTCCATTACAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1SalR：5’-cg gaa ttcTCATCACCATTAGTACCAGAATCAGTCTC-3’

Sal R₁：5’-TTAGTACCAGAATCAGTCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

从中间截掉一段序列的近250bp LFY模板是采用中间去掉一段后左右部分重叠片段重组PCR拼接而成，即以pUC-Mol为模板，以引物H1MouF(/M₁₃R)和LFY250R(5’-GCGTGCTCGACCGAATAGTCCCTC-3’为中间截掉处引物)PCR左片段；以引物LFY250F(5’-CTATTCGGTCGAGCACGCTTGTGGGTATG-3’为中间截掉处引物)和R1Mou R(/M₁₃F)PCR右片段。部分重叠的左右片段互为模板扩增几个循环，产生250bp片段。再以该重组片段为模板，引物H1SalF∶SalF₁(9∶1)/Sal R₁∶R1Sal R(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-Sal，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列取左短(ShortSal)右长(LongSal)报告序列设置，ShortSal：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAG ACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGA-3’

LongSal：以引物LgSalF：5’-TCATTTCTATGTTCGTCATTC-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链作为公共引物LgFood R：

5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’；和pUC-Sal模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-Sal                  1μl

LgSal F(5μM)            1μl

LgFood R(5μM)           1μl

10mM dNTPs               1μl

10×pfu聚合酶缓冲液      5μl

pfu聚合酶                1μl

dH₂O                     40μl

                                   

                         50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                5μl

LgFood R               0.5μl

10mM dNTPs             0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu酶                  1μl

dH₂O                   88μl

                               

                       100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因LongSal。

3.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)报告基因的制备

金黄色葡萄球菌分布广、低抗力强，不仅是临床感染主要传染源，也是食品污染常见致病菌。其耐热去氧核糖核酸酶(Thermostable nuclease，nuc或deoxyribonulcas Dnase)为产毒金葡菌之典型特征，常与血浆凝固酶检测都作为进出口食品鉴定金黄色葡萄球菌的方法。因此对比了Genebank数株nuc基因序列，选择了其一段共同保守区(S.auR15株nt483-533)CTGATAAATATGGACGTGGCTTAGC-GTATATTTATGCTGATGGAAAAATGG，其右半部分有意链3’端加在近200bp(中间截掉一段)的LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在近200bp LFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游SauF；下游SauR：

上游：GTATATTTATGCTGATGGAAAAATGG与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与CTGATAAATATGGACGTGGCTTAGC其反意

义链：GCTAAGCCACGTCCATATTTATCAG与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物如下：

H1 SauF：5’-cg gga tccGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGAG-3’

SauF₁：5’-TGCTGATGGAAAAATGGAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1 SauR：5’-cg gaa ttcGCTAAGCCACGTCCATATTTATCAGCTC-3’

SauR₁：5’-CGTCCATATTTATCAGCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

从中间截掉一段序列的近200bp LFY模板是采用中间去掉一段后左右部分重叠片段重组PCR拼接而成，即以pUC-Mol为模板，以质粒序列引物M₁₃R和LFY200R(5’-GAGAGAGACGACCGAATAGTCCCTC-3’为中间截掉处引物)PCR左片段；以引物LFY200F(5’-ATTCGGTC GTCTCTCTCATATCTTTC-3’为中间截掉处引物)和质粒引物M₁₃F扩增右片段。部分重叠的左右片段互为模板扩增几个循环，产生200bp片段。再以该重组片段为模板，引物H1SauF∶SauF₁(9∶1)/SauR₁∶R1SauR(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-S.au，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列取左短(ShortSau)右长(LongSau)报告序列设置，ShortSau：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAG CTGATAAATATGGACGTGGCTTAGC-3’

LongSau：以引物LgSauF：5’-GTATATTTATGCTGATGGAAA-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链作为公共引物LgFood R：

5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’；和pUC-Sau模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-Sau                1μl

LgSauF(5μM)           1μl

LgFood R(5μM)         1μl

10mM dNTPs             1μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu聚合酶              1μl

dH₂O                   40μl

                               

                       50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                5μl

LgFood R               0.5μl

10mM dNTPs             0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu酶                  1μl

dH₂O                   88μl

                                 

                       100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因LongSau。

4.致病性大肠杆菌(Escherichia coli)报告基因的制备

埃稀菌属俗称大肠杆菌，共分为5类，大部分是人类和动物肠道正常寄生菌群，不引起肠道内感染。其中主要有致病性大肠杆菌EPEC(包括出血性大肠杆菌EHEC)和产毒性大肠杆菌ETEC(由质粒导入毒素基因)两类导致肠炎腹泻。目前研究中只检测这两类对食品重要的大肠杆菌，肠致病性和出血性大肠杆菌EPEC/EHEC检测其共同的毒力因子紧密素的eae基因；产毒性大肠杆菌ETEC长期以来检测不耐热肠毒素LT和耐热肠毒素ST。分别选取大肠杆菌eae基因、不耐热肠毒素LT基因、耐热肠毒素ST基因的保守序列约50-60base作为探针，三种探针分别将其左半、右半探针部分加在同一近150bp大小的拟南芥序列首尾，制备带不同末端探针的同一大小报告基因系统，最后所有致病性大肠杆菌都置换产生200bp同一大小片段。

(1)致病大肠杆菌EPEC/EHEC报告基因：选取EPEC/EHEC致病株毒力因子eae基因，共同保守序列(77E5株nt264-1315)绝对保守序列作为探针序列，即

ACTCCGATTCCTCTGGTGACGATGGGGA-TCGATTACCGTCATGGTACGGGTAATG，其右半部分有意链3’端加在近150bp(中间截掉一段)的LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在近150bp LFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游eaeF；下游eaeR：

上游：TCGATTACCGTCATGGTACGGGTAATG与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与ACTCCGATTCCTCTGGTGACGATGGGGA其反意

义链：TCCCCATCGTCACCAGAGGAATCGGAGT与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物如下：

H1eaeF：5’-cg gga tccTCGATTACCGTCATGGTACGGGTAATGAG-3’

eaeF₁：5’-TCATGGTACGGGTAATGAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1eaeR：5’-cg gaa ttcTCCCCATCGTCACCAGAGGAATCGGAGTCTC-3’

SauR₁：5’-CAGAGGAATCGGAGTCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

从中间截掉一段序列的近150bp LFY模板是采用中间去掉一段后左右部分重叠片段重组PCR拼接而成，即以pUC-Mol为模板，以质粒序列引物M₁₃R和LFY150R(5’-CTCCCAACGTCCCAAAAGCAGCCGTC-3’为中间截掉处引物)PCR左片段；以引物LFY150F(5’-CTTTTGGGACGTTGGGAGCTTCTTGTTG-3’为中间截掉处引物)和质粒引物M₁₃F扩增右片段。部分重叠的左右片段互为模板扩增几个循环，产生150bp片段。再以该重组片段为模板，引物H1eaeF∶eaeF₁(9∶1)/eaeR₁∶R1eaeR(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-Eae，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列取左短(ShortEae)右长(LongEae)报告序列设置，ShortEae：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAG ACTCCGATTCCTCTGGTGACGATGGGGA-3’

LongSau：以引物LgEaeF：5’-TCGATTACCGTCATGGTAC-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链作为公共引物LgFood R：

5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’；和pUC-Eae模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-Eae                1μl

LgEaeF(5μM)           1μl

LgFood R(5μM)         1μl

10mM dNTPs             1μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu聚合酶              1μl

dH₂O                   40μl

                              

                       50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                5μl

LgFood R               0.5μl

10mM dNTPs             0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu酶                  1μl

dH₂O                   88μl

                                 

                       100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因LongEae。

(2)产毒性大肠杆菌ETEC报告基因：目前依据其产生的肠毒素进行检测，有些ETEC产生耐热肠毒素(heat stable enterotoxin，ST)，也有些产生不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin，LT)，因此为了检测结果的不遗漏，我们对其两种肠毒素基因均置换成同一大小报告基因，都产生200bp大小片段检测。

LT报告基因：

选取ETEC的不耐热毒素LT的一段保守序列，即(195株nt1064-1109)5’CAACATTTCAGGTCGAAGTCCCG-GGCAGTCAACATATAGACTCCCA3其右半部分有意链3’端加在近150bp(中间截掉一段)的LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在近150bp LFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游LT F；下游LT R：

上游：GGCAGTCAACATATAGACTCCCA与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与CAACATTTCAGGTCGAAGTCCCG其反意

义链：CGGGACTTCGACCTGAAATGTTG与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物如下：

H1LTF：5’-cg gga tccGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAG-3’

LTF₁：5’-TCAACATATAGACTCCCAAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1LTR：5’-cg gaa ttcCGGGACTTCGACCTGAAATGTTGCTC-3’

LTR₁：5’-CGACCTGAAATGTTGCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

采用同上的从中间截掉一段近150bp LFY左右部分重组片段作为模板，用引物H1LTF∶LTF₁(9∶1)/LTR₁∶R1LTR(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-LT，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列取左短(ShortLT)右长(LongLT)报告序列设置，Short LT：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAG CAACATTTCAGGTCGAAGTCCCG-3’

LongLT：以引物LgLTF：5’-GGCAGTCAACATATAGACTC-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链作为公共引物LgFood R：

5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’；和pUC-LT模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-LT                 1μl

LgLTF(5μM)            1μl

LgFood R(5μM)         1μl

10mM dNTPs             1μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu聚合酶              1μl

dH₂O                   40μl

                               

                       50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                5μl

LgFood R               0.5μl

10mM dNTPs             0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu酶                  1μl

dH₂O                   88μl

                                

                       100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因Long LT。

ST报告基因：

选取产毒性大肠杆菌ETEC的耐热肠毒素ST1的一段相对保守序列作为探针序列，即(O25：H42株nt128-178)

GAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAAT-TGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGG。其右半部分有意链3’端加在近150bp(中间截掉一段)的LFY报告基因扩增上游引物前面；左半部分以反意链3’端加在近150bp LFY报告基因扩增下游引物前面。生成首尾带探针的LFY片段的克隆质粒。即LFY上游ST F；下游ST R：

上游：TGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGG与AGCACCACCTCCGGTTC

下游：GAGACGATTGCAAGAAGAG与GAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAAT其反意

义链：ATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC与CTCTTCTTGCAATCGTCTC

由于上下游引物过长，化学合成容易引入突变，故合成有部分重叠的F/F₁及R/R₁各两条尾首重叠搭桥引物如下：

H1STF：5’-cg gga tccTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGGAG-3’

STF₁：5’-TCCTGCTTGTACCGGAGCACCACCTCCGGTTC-3’

R1STR：5’-cg gaa ttcATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTCCTC-3’

STR₁：5’-AGCAGTAATTGCTACTATTCCTCTTCTTGCAATCGTCTC-3’

采用同上的从中间截掉一段近150bp LFY左右部分重组片段作为模板，用引物H1STF∶STF₁(9∶1)/STR₁∶R1STR(1∶9)常规PCR扩增，片段经BamHI/EcoRI酶切，常规方法克隆至pUC19质粒载体产生pUC-ST，并测序鉴定。

因此，一对带探针报告序列取左短(ShortST)右长(LongST)报告序列设置，ShortST：(化学合成)

5’-GAGACGATTGCAAGAAGAG GAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAAT-3’

LongST：以引物LgSTF：5’-TGTGTTGTAATCCTGCTTG-3’和LFY“-”分开处序列CTGCCGTTAGAGTTGAAC反意链作为公共引物LgFood R：

5’-GTTCAACTCTAACGGCAG-3’；和pUC-ST模板两步不对称PCR产生长的带探针报告序列反意义单链。

第一步以此对引物制备长片段双链：

pUC-ST                 1μl

LgSTF(5μM)            1μl

LgFood R(5μM)         1μl

10mM dNTPs             1μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu聚合酶              1μl

dH₂O                   40μl

                                    

                       50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于50μldH₂O。

第二步再用PCR产物进行不对称PCR，即单引物LgFood R PCR，得到单链。

PCR产物                5μl

LgFood R               0.5μl

10mM dNTPs             0.5μl

10×pfu聚合酶缓冲液    5μl

pfu酶                  1μl

dH₂O                   88μl

                                 

                       100μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过60个循环后，最后72℃10分钟。

PCR产物此时为单链，经三倍体积乙醇沉淀后重溶于100μl dH₂O。至此得到我们需要的单链长链报告基因Long ST。

(二)合成报告系统反向PCR引物：

取LFY报告基因序列中间分开相邻处的两段约～17+～17base长的序列，右半部分15-20base长的有意义链序列作为上游反向PCR引物ssRevF，左半部分15-20base长的反意义链作为下游反向PCR引物ssRevR。

ssRevF：5’-gga gac gat tgc aag aag-3’

ssRevR：5’-tt cag ctc taa cgg cag-3’

(三)待测食品标本的预处理：

食品标本1-25克(或1-25毫升)(具体依国家行业标准而定)无菌水溶解后可直接加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再氯仿抽提一次。上清加3X的DNA结合缓冲液(6M碘化纳N_aI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％EtOH的2M N_aI液)洗柱两次，加50μl dH₂O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。食品标本亦可预加蛋白酶K消化液(0.1-0.2mg/ml蛋白酶K的TE buffer与0.5％SDS)于55℃1～3小时或37℃过夜，再经酚：氯仿抽提。

经典标准食品样本预处理：称量食品25克(25毫升)放人盛有9倍体积基础肉汤培养基的无菌均质杯中，以8000r/min-10000r/min均质1min-2min，调节pH至6.8士0.2后无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，于37℃摇床200r/min培养增菌过夜。取增菌液(或预增菌后二次增菌液)1mL于EP管中台式离心机最高速离心5min，沉淀菌体加50μl的DNA提取液(0.1％Chelex，使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴5min，高速离心5min，上清2μl用于ssPCR扩增。或者1mL增菌液离心沉淀菌体用离心后残留的少量液体混匀后2μl直接加样ssPCR扩增。

(四)靶置换及带探针报告系统反向扩增的一步法反应：

靶系统置换报告系统的置换探针退火温度Tm值预设为60℃多度，而最终报告系统上下游反向引物退火温度Tm值预设仅50℃度，通过控制置换反应退火温度60-65℃，报告系统反向扩增退火温度50℃。置换反应与报告系统反向扩增就可以在同一反应管中先后分两步反应，在高退火温度60℃时先进行置换反应，随后在低退火温度50℃时再进行最终报告系统反向PCR扩增。反应体系总体积为25μl-50μl或50μl总体积分成双份平行扩增。以霉菌18SrRNA编码基因，沙门菌inv A基因，金葡菌nuc基因及大肠杆菌eae、LT、ST基因克隆质粒作为阳性对照，单独pUC₁₉质粒作为阴性对照。

样本DNA提取液               2μl

带探针报告序列混合物        1+1μl

上游ssRevF(10uM)            2μl

下游ssRevR(10uM)            2μl

10mM dNTP                   2μl

10×Taq buffer              5μl

热启动Taq                   2μl

dH₂O                        33μl

                                    

                            50μl

第一步置换反应：变性94℃4分钟，10个循环，95℃30秒，62℃1-2分钟，72℃30秒。第二步终报告系统反向扩增：置换步骤后直接进行35-40个循环，95℃30秒，50℃30秒，72℃30-60秒。反向扩增35-40个循环后72℃5分钟。

(五)终报告系统反向PCR结果分析：

靶置换报告系统反向扩增首选上实时荧光PCR仪扩增，闭管检测可以减少扩增产物的再污染，实时荧光监测Ct值。四种致病菌任一或一个以上污染都会阳性，Ct值都小于35，则PCR产物需琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，确定污染种类。

较经济的检测途径是采用普通热循环PCR仪扩增，PCR产物单向传递至一间专门独立的电泳实验室电泳，也可以起到扩增产物封闭的效果。

(1)实时荧光PCR分析：在上述报告系统扩增反应液25μl中加入1μl荧光标记探针(采用长报告序列一段Oligo)，经实时荧光PCR仪扩增，荧光强度对循环数作荧光动态曲线。前10个置换循环不计荧光循环数，从报告系统反向扩增起计数，测定循环阈值(Ct)，即以反向扩增过程前3-15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，与起始靶DNA拷贝对数存在负线性关系。Ct值小于35时检测结果阳性，小于25时强阳性。Ct值大于35时为阴性结果。同样标本当常规PCR阳性时，系统置换PCR往往强阳性(图3)。

(2)琼脂糖凝胶电泳：报告系统PCR产物25μl加电泳上样缓冲液5μl，经预加荧光染料溴乙锭EB(或GelRed/GelGreen^TM)的1.2％-2.0％琼脂糖凝胶电泳，或者电泳后凝胶进行SYBRGold染色。显示不同大小报告片段指示多重靶基因分子。片段长度200bp大小条带指示致病大肠杆菌污染，片段250bp大小指示金黄色葡萄球菌污染，片段300bp大小指示沙门氏菌污染和片段350bp大小指示霉菌污染。四种阳性质粒无论单独或四种混合作为检测模板均能有效扩增，见图4泳道No.1-5条带；初步的食品样本检测亦能检出污染细菌。

Claims (14)

1.“一种系统置换的多重基因扩增技术”，其特征是将靶基因DNA/RNA置换成与靶种系不同源的报告基因序列，再扩增报告系统间接指示靶分子。

2.根据权利要求1所述的系统置换扩增技术，系统置换特征在于待测模板靶DNA/RNA通过预选特异性的短探针杂交区分成两小段相邻序列合成短模板区扩增引物，同时将一段与靶不同源的长报告基因分成左右部份分别加在短模板区扩增引物5’端前面。带报告基因的短模板区引物扩增短模板时就带上了长报告基因序列，再用报告序列引物扩增中间带探针的长报告基因，两步指数式扩增间接放大指示靶分子。

3.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，其特征在于一种至N种待测靶基因系统置换成带一至N种不同探针的与靶不同源的同一报告序列系统，同一报告序列PCR扩增、同时指示多重靶分子。

4.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，其特征在于一种至N种靶基因每种选取另外2、3……n段特异杂交区并相应置换成带一至N种不同探针的另外报告序列2、3……，一套工作时污染了就换一套轮换使用。

5.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述预选特异性的短探针杂交区指靶基因特异性的、最保守的短遗传序列，长度为30-100base。

6.根据权利要求5所述的系统置换扩增技术，所述预选特异性的短探针杂交区长度优选为40-60base。

7.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述与靶种系不同源的报告基因序列指与靶基因同源性最小的、非特异性杂交最少的核酸序列、人造修饰核酸。其长度为50-1000base。

8.根据权利要求7所述的系统置换扩增技术，所述与靶种系不同源的报告基因序列长度优选为100-500base。

9.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述两步指数式扩增指靶置换扩增和报告系统扩增分两步PCR反应，反应条件与常规PCR相同，也可两步合并。所述扩增采用的耐热聚合酶指Taq、Tth、pfu、Vent等耐热聚合酶。

10.根据权利要求9所述的系统置换扩增技术，所述两步指数式扩增合并是指两步的退火温度差10℃以上时，两步合并于单管反应。所述扩增采用的耐热聚合酶优选热启动聚合酶。

11.根据权利要求1所述的“一种系统置换的多重基因扩增技术”，一样适用于所有常规PCR应用领域，实时荧光PCR(Real-time PCR)检测，PCR产物生物芯片(Micro-Array，微阵列)分析，分子组化，分子病理原位PCR。

12.一种带靶探针的报告基因序列，其特征是指一对与靶不同源的报告序列末端与靶探针序列首端重组的单链核酸。使用化学合成、不对称PCR、M₁₃质粒、固相分离方法生产。一对该报告序列以一端探针引物与靶基因结合、延伸，置换为带靶探针的报告系统，报告系统再扩增间接指示靶分子。

13.根据权利要求12所述系统置换扩增的一种带靶探针的报告基因序列单链可以是修饰碱基、类似碱基组成的人造核酸序列，采用各种理化方法小规模制备和工业自动化生产。

14.所述系统置换的多重基因扩增试剂盒成份包括：样本核酸提取试剂，带探针报告序列核酸，10mM dNTPs，Taq、Tth聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，报告系统引物F/R，凝胶电泳试剂和Oligos杂交芯片。

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