CN101638684A

CN101638684A - 链置换聚合酶链反应

Info

Publication number: CN101638684A
Application number: CN200810117606A
Authority: CN
Inventors: 江洪; 江必胜; 张辉
Original assignee: Beijing Tag-Array Molecular Test Co Ltd
Current assignee: Beijing Tag-Array Molecular Test Co Ltd
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2010-02-03

Abstract

本发明涉及一种“链置换聚合酶链反应”，其特征在于将待测靶基因链置换成带探针的序列不同的报告基因链间接扩增，所述探针序列为选择靶基因相邻的两小段保守或特异序列作为双探针的互补序列，所述序列不同的报告基因链指与靶基因链同源最小，或种系较远的基因序列，其首尾加上预设的双探针序列作为线性带探针报告基因。待测靶基因与报告基因预设的首尾探针序列互补杂交，从而线性报告基因首尾靠近衔接，杂交体

Description

链置换聚合酶链反应

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种体外基因扩增-聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)及其应用。

背景技术

在1983年的一个晚上，Cetus公司科学家Kary Mullis驱车于北加州的高速公路上，他的思绪仍不时在合成寡核苷酸测序研究上，孕育出了PCR技术的灵感。PCR是在试管中模拟天然的DNA复制过程，成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。以拟扩增的DNA为模板，以一对分别与模板两端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA链合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。因为新合成的DNA链也可以作模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。Mullis经过两年的努力证实了这一技术，申请了PCR发明专利(USPatent 4,683,202)。

随着PE等公司开发出各种热循环PCR仪，1988年Saiki分离出Taq耐热聚合酶以及pfu、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR广泛应用于基因克隆、测序、分子检测等众多领域，成为现代分子生物学最核心的基础技术。在以后的二十年里，多达数十种PCR改进，许多应用技术、方法不断发明，涌现，详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，全世界与PCR相关的专利已多达数千个以上。但截止目前，所有PCR技术及各种改进方法均是直接扩增待测靶分子的直接PCR途径，即检测A基因就扩增A基因。

PCR技术指数扩增的终点“链式反应”缺乏有效调节步聚，亦太过于灵敏。在临床诊断实际应用中易极度放大交叉污染导致假阳性高，不容易定量检测。良好的PCR实验操作，包括实验室分区，使用一次性材料，紫外线照射和降解PCR产物等理化措施能提高PCR质量控制，但对扩增效率百万倍以上的高灵敏度PCR技术而言，防止交叉污染难以完全有效。上世纪90年代中期后出现的实时荧光PCR，不仅闭管监测避免了扩增产物的再污染，而且使PCR定量测定切实可行。然而标本间以及加样操作仍易引起交叉污染，且RNA需要纯化、逆转录后才能定量PCR，难以精确定量。

发明内容

为了克服常规PCR缺乏调节步聚，RNA不易精确定量等的局限。本发明提供一种链置换聚合酶链反应(Strand Substitute Polymerase Chain Reaction，ssPCR)，其通过将靶分子DNA和/或RNA链置换成与靶分子不同的报告基因链，再扩增报告基因链，从而能够间接指示靶分子。

具体地说，本发明链置换聚合酶链反应包括步骤：1)以靶分子DNA链和/或RNA链上的一段或多段预选序列作为靶序列与一种或多种报告基因链的首尾预加探针杂交，使报告基因链的首尾预加探针的末端相邻，用连接酶连接，使报告基因链成环；2)反方向PCR扩增报告基因。

其中步骤1)待测靶DNA链/RNA链通过预选的一小段保守序列或特异序列作为探针杂交序列与报告基因首尾预选加上的探针序列杂交，连接酶(优选耐热连接酶)反应连接首尾，通过反向PCR扩增将待测靶分子直接扩增转换成包括一套以上的报告基因环。所述报告基因指与靶分子无关的或种系不同的核酸序列，其首尾分别预加上靶分子的两相邻的小段保守序列或特异序列互补的探针。所述报告基因环的反向PCR扩增的是无关的报告基因序列和靶分子预选的小段保守序列或特异序列互补的探针序列。即根据靶分子DNA链或RNA链上的靶序列设计合成报告基因链探针，且相应于靶序列这两个首尾预加探针的碱基序列是连续的。

所述链置换聚合酶链反应ssPCR一样适用于常规PCR应用领域范围。包括PCR及产物凝胶电泳检测、实时荧光PCR(Real-time fluerescence PCR)定量检测，PCR产物生物芯片(MicroArray，微阵列)分析，以及分子组化，分子病理原位PCR。较常规PCR更适合遗传变异检测、高度同源种属亚型鉴定及单核苷酸多态性SNP分析。

所述报告基因链为常规PCR适宜长度80base至1000base的核酸单链，包括DNA单链、RNA链和修饰的核酸单链，或有效单链DNA。单链既可以为有意义链，也可以为反意义链，检测正链RNA分子时，一般采用反意义链。ssPCR产物凝胶电泳检测时，报告基因长度优选为200-500base长度为电泳效果最佳，其它实时荧光PCR、ssPCR产物Microarray分析等，报告基因长度以100-200base为最佳大小。所述基因序列无关是指同源性小或种系不同，特别是种系远离的基因序列。如待测动物系靶分子就选择植物系保守基因作为报告基因，反之同样原则。所述报告基因有效单链DNA是指仅一条链起有效的链置换耐热连接酶反应成环，另一条互补链仅伴随存在不能链置换反应的双链DNA分子，所述报告基因首尾所加探针序列长度为核酸杂交适宜长度：双探针20base-200base，单探针10～100base，优选20-40base。所述报告基因链的制备可以采用各种理化方法和生物学方法制造、生产，首选采用分子生物学方法，通过设计引物进行PCR扩增报告基因引入探针。所述链置换耐热连接酶反应指带末端探针的报告基因首尾与待测靶基因模板变性后杂交，连接酶(优选耐热连接酶)连接报告基因首尾成环，95℃变性，15℃-70℃(平均50℃)复性杂交，连接反应进行循环，95℃-50℃热循环数为1-50次，优选10-30次循环。

所述报告基因环反向PCR为1至多重PCR，同一套报告基因，可采用两末端不同长度或不同编码序列加上不同的首尾探针，同时与多重靶分子杂交置换成多重的报告基因，同一套引物反向PCR系统同时扩增多重大小不同的PCR产物或多重不同编码序列的PCR产物，经凝胶电泳分析，或编码序列Microarray微阵列分析，或不同编码序列多重荧光探针实时PCR，或不同编码荧光探针原位PCR，间接指示多重靶分子。

本发明在现有的PCR系统基础上，发展了一种全新概念的链置换间接PCR途径，较常规PCR终点链式反应增加了一步链置换的限速调节步聚，间接PCR扩增的是预设的报告基因，反应条件容易优化，背景干净，待测靶分子可以置换成一系列的1，2，3……n套独立报告基因，一套污染了就可换一套。

链置换聚合酶链反应ssPCR的原理及操作如下：

ssPCR基本原理(图1)是常规PCR将待测标本靶基因由两端序列特异性结合，延伸循环扩增的直接检测途径转换成待测靶基因杂交报告基因首尾预设的探针序列，耐热连接酶连接首尾，反向扩增报告基因环，间接指示靶分子的间接PCR途径。

与常规PCR选取大片段序列作为扩增模板不同，ssPCR待测标本靶基因仅需选取一小段(40base-60base左右)的保守序列或特异序列作为探针杂交互补序列，将探针杂交序列分成相邻的左半部分探针序列(L probe)和右半部分探针序列(R probe)，两相邻的探针序列碱基连续，不少一个碱基，只是它们之间没有形成磷酸二酯键。右半部分R probe序列3’端加在报告基因单链的首端；左半部分L probe序列5’端接在报告基因单链的尾端。首尾带预设探针序列的单链报告基因与待测靶基因模板互补杂交，形成

链-环结合式的杂交体，其中单链缺口通过耐热连接酶连接，线性报告基因成环，再反向PCR扩增含探针序列的报告基因环。如果没有待测靶基因模板的帮助，线性单链报告基因不能链-环结合式杂交，也就不能连接成环，反向PCR不工作。耐热连接酶对于杂交体缺口两侧双探针碱基要完全正确匹配(配对)才能连接缺口，因此，链置换反应有着极高的特异性。调节待测模板与报告基因比例、耐热连接酶反应连接温度，热循环数就可以调节链置换反应效率从而控制整个系统的效率。带探针报告基因链的制备：

选取一段与待测基因无关的，或种系较远的基因序列约80-1000base(100-500base)左右，也包括利用电脑设计同源性最小的人造序列)作为报告基因1，另一段无关序列为报告基因2，…以此类推…n等。待测靶基因选取小段的保守序列或特异序列(40-60base左右)作为探针杂交互补的序列，探针杂交互补序列1对应报告基因1，探针杂交序列2对应报告基因2，……以此类推，等等。同一套报告基因两末端可以截取不同长短产生不同大小的报告基因链；或两末端设置不同编码序列产生不同编码的报告基因链。

采用常规PCR方法扩增无关的报告基因片段，利用PCR引物仅3’端决定特异性，5’端可以设置酶切位点等非特异性序列的特点，将双探针序列分别加在报告基因PCR引物5’端，即杂交探针序列右半部分R probe以有意义链序列3’端加在报告基因PCR上游引物5’端合成带首尾报告基因上游引物；杂交探针序列左半部分L probe以反意义链序列3’端接在报告基因PCR下游引物5’端合成带首尾报告基因下游引物。以此对5’磷酸化引物和小分子标记如5’生物素标记引物，采用pfu聚合酶扩增产生平末端的带探针报告基因。或者以带酶切位点的此对引物PCR扩增带探针的报告基因，酶切，克隆至质粒载体，产生带探针的报告基因质粒。生产报告基因(检测有意义链模板)时，以该质粒为模板，以5’端小分子标记如生物素标记的R probe有意义链序列为上游引物，以5’端磷酸化的Lprobe反意义链序列为下游引物，(反之，R probe上游引物5’端磷酸化，L probe下游引物5’端生物素标记，检测反意义链模板)，PCR扩增带探针的报告基因，凝胶电泳纯化，产物经95℃变性后快速冰浴冷却，固相分离如链亲和素交联的Sepharose 4B/磁珠结合去除生物素标记单链，残存的少量双链由于5’端带生物素的单链不能置换反应，被认为有效单链。

链置换耐热连接酶反应：

待测标本靶基因经初步的DNA纯化或总RNA提取后加样1μl，液态标本可直接取样1-2μl，低丰度标本亦可采用靶基因互补Oligo固相结合富集。标本靶基因含量检测范围从微克水平(1μg/ml)、纳克水平(1ng/ml)、皮克水平(1pg/ml)到飞克水平(10fg/ml)。加入一定比例的纯化单链(或有效单链)报告基因，1μl-2μl的含量0.1ng/ml-0.5mg/ml，一般0.01μg/ml-10μg/ml(或0.1μM-1μM)左右的报告基因，首先高温95℃变性数分钟使靶基因分子和报告基因变性或单链，再低温50℃左右退火复性，杂交连接5分钟。如有阳性靶基因模板则通过其探针杂交互补序列与报告基因首尾探针杂交，使线性带首尾探针的报告基因两侧5’末端和3’末端因杂交结合待测模板而相互靠近，首尾锲合并置衔接，形成

链-环结合式杂交体，耐热连接酶连接杂交体单链缺口，使首尾共价连接，线状报告基因成环。如果没有阳性靶基因帮助杂交结合，线状单链报告基因首尾不能连接，也就不能成环，阴性标本只存在线性报告基因。耐热连接酶连接反应在高温95℃左右和低温54℃左右循环，首先95℃4分钟，然后2-50个循环(优选10-30个循环)94℃变性30秒至1分钟，54℃连接5分钟。调节连接温度和循环数及报告基因比例可能调整检测靶基因浓度范围。增加连接温度可以进一步降低非特异性反应背景。

环状报告基因反向PCR：

对于环状报告基因，采用除探针序列外的任何两小段序列均可作为反向引物，一般选用线性报告基因正中间的两小段序列，右边一段有意义链作为反向PCR上游引物，左边一段反意义链作为反向PCR下游引物。以链置换耐热连接酶反应物作为模板，Taq聚合酶催化反向PCR扩增环状报告基因，PCR扩增的是中间带一小段与待测靶基因互补的探针序列和两端大部分为报告基因序列的片段。反向PCR产物为报告基因环一样大小的DNA双链。产物可以采用凝胶电泳分析，或采用报告基因中预设的编码序列Microarray微阵列分析。反向PCR可与实时荧光PCR仪联用，或不同编码荧光探针原位PCR。

操作流程：

(一)待测标本的纯化：

(1)DNA样本的纯化：

等量酚-氯仿抽提，商业DNA纯化柱纯化(详细步骤按Qiagen说明书进行)

1)：加100-200μl样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。

2)：上清100-200μl转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。

3)：上清加4倍的Qiagen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50μl dH₂O洗脱收集纯化的样本。

(2)RNA样本的纯化：

异硫氰酸胍一步法提取总RNA(Chomczynski，P.et，al.1987Anal.Biochem.Vol 162，156)。

样本于EP管中加1ml的Trizole(1ml 4M异硫氰酸胍，1ml酚，0.1ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加200μl氯仿振荡，离心5分钟，取上清加等量0.5ml异丙醇置-20℃2小时再离心沉淀，70％乙醇洗涤一次，加50μl DEPC处理的dH₂O溶解。一般没有必要纯化mRNA。

待测靶基因低丰度标本亦可采用靶基因互补的短Oligo固相结合富集。

(二)加首尾报告基因DNA的PCR制备：

a)合成报告基因PCR引物：

5’端引物：首先待测模板探针杂交序列右半部分有意义链15-25base，再加报告基因5’端最开始的20base有意义链序列。

3’端引物：首先待测模板探针杂交序列左半部分反意义链15-25base，再加报告基因3’端最开始的20base反意义链序列。

一端引物5’生物素标记，另一端引物5’磷酸化。

b)PCR扩增报告基因并凝胶电泳纯化。

种系无关的报告基因模板 1μl

5’端报告基因引物(5uM) 1μl

3’端报告基因引物(5uM) 1μl

10×pfu buffer 5μl

10mM dNTP 1μl

pfu 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

变性95℃5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。经25个循环后72℃10分钟。

首先琼酯糖凝胶agarose电泳纯化试剂盒纯化。回收产物经95℃变性后快速冰浴冷却，采用固相的链亲和素交联Sepharose 4B/磁珠结合，去除生物素标记单链，制备带探针报告基因单链或有效单链。

(三)合成反向PCR引物：

取报告基因序列正中间相近的两段约20+20base长的序列，右半部分20base长的有意义链序列作为5’端反向PCR引物，左半部分20base长的反意义链作为3’端反向PCR引物。

(四)链置换耐热连接酶反应：

待测液体样本 2μl

纯化的带探针报告基因单链 2μl

10X Tth连接酶缓冲液 5μl

dH ₂ O 40μl

50μl

首先95℃变性4分钟，加入Tth连接酶1μl，再10-20个循环，94℃30秒，52℃5分钟，经10-20个循环后，反应产物经95℃变性2分钟后快速冰浴冷却。

(五)环状报告基因反向PCR：

杂交连接酶反应液 1μl

5’端反向引物Primer 1μl

3’端反向引物Primer 1μl

10mM dNTP 1μl

10×Taq buffer 5μl

Taq 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

变性94℃5分钟，20-30个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃30秒。25个循环后72℃10分钟。

(六)反向PCR产物分析：

(1)产物可以采用1.5％-2％agarose凝胶电泳分析；(2)采用报告基因中预设的编码序列Microarray微阵列分析；(3)反向PCR可与实时灾光PCR仪联用；(4)不同编码荧光探针原位PCR。

根据本发明的方法可以设计一种DNA或RNA单链用于检测试剂盒，包括所述报告基因，在所述报告基因首尾两端具有探针，该探针能够与靶分子DNA或RNA链杂交，并且使得报告基因首尾两端探针的末端相邻。该试剂盒还可包括Taq连接酶及其缓冲液、dNTPs、Taq聚合酶及其缓冲液、依据报告基因产生设计合成反向引物和凝胶电泳试剂中的一种或多种。

本发明中所述的报告基因是一段核苷酸序列，通过扩增该序列从而能够间接指示靶分子，这里的核苷酸序列可以是DNA或RNA，也可以是经修饰后的DNA或RNA序列。本领域技术人员应理解本发明中所述的与靶分子无关或不相同是指所述报告基因链与靶分子同源性低(越低越好)，在热循环中不与靶分子杂交，报告基因可以是人工设计合成的，或者是从种系不同特别是种系远离的物种中获得。

本发明ssPCR主要优点表现在：

(1)直接PCR，标本基因太杂，非特异性背景高。ssPCR扩增的置换报告基因可以通过预选不同于靶分子DNA或RNA，从而扩增结果单一，背景干净，尤其荧光定量，或分子组化，或微阵列分析时优越。

(2)通过置换步聚将常规“核爆”式的终点反应PCR加了一步可调节步聚，成为可控的“链式反应”，系统反应条件容易优化、控制。

(3)“双探针”杂交置换方式特异性极高，所以待测标本无需纯化、预处理，可直接加样检测。

(4)点突变基因、降解短DNA片段，各种RNA均可直接置换成报告DNA扩增，无需逆转录步聚，适用范围广泛，不易漏检。

(5)靶基因可置换成一系列的不同报告基因，一套污染了就可立即换一套系统，规避了一套系统的易交叉污染。

附图说明

图1为本发明原理示意图

两段序列相邻的探针(与待测模板互补的序列)分别连接在一段无关序列的首尾末端构成报告基因，报告基因可通过首尾与待测模板互补杂交，从而其首尾末端靠近衔接，杂交体单链缺口被连接酶连接，使报告基因成环，再反向PCR扩增报告基因环。如果没有待测模板的存在，报告基因不能成环，反向PCR不扩增。其中图示：粗直线代表待测模板有意义链，细直线代表待测模板反意义链；环线代表与待测模板无关的序列，短直线代表探针序列，短箭头代表反向PCR引物。

图2为本发明实施例检测样本肠道病毒的结果

图中，M电泳道：DNA标准品；1.电泳道：阳性对照，共有360bp，300bp，200bp三条带，2.电泳道：空白阴性对照；3.样品道：产生300bp主带，同时出现200bp条带则为EV71型肠道病毒阳性；4.样品道：仅一条300bp主条带则为EV71、CoxA16以外其它型肠道病毒感染。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1手足口病肠道病毒的置换报告基因多重扩增：

目前传染病源包括肠道病毒的诊断一般采用分离培养法、基因克隆测序法、免疫血清学等诊断法和分子检测的实时荧光PCR方法。前两种方法检测结果最为可靠，但耗时很长，依赖一定的实验技术条件。后两种为临床检验广泛使用的临检诊断方法。

人肠道病毒为小RNA病毒科致病株，包括肠道病毒(EV)A、B、柯萨病毒(COX)A16，埃可病毒(echorirus30)和EVA新血清型EV71，EV71又包括BrCr、B1、2、3、4、5和C1，2，3，4亚型。亚洲常年散发流行，以6、7月份高峰，病毒易高度变异，几年一小流行，每九年一次大流行。最近，安徽阜阳一次大的流行将肠道病毒诊断研究提到一个高度重要位置。肠道病毒象流感病毒一样高度变异，几乎没有两个基因相同的肠道病毒，所以免疫学诊断方法的建立象流感病毒疫苗研究一样困难。更重要的是5岁以上的人口50％以上肠病毒抗体阳性，只有定量测定抗体增加4倍以上才能疑似感染。实时荧光PCR不仅仪器昂贵，荧光探针(外国专利)更贵，更困难的是在EV所有致病株中找不出一段合适的两端保守基因序列来作为共同的靶基因扩增，目前报道的肠道病毒PCR引物序列只对少量肠道病毒株特异性配对，必然存在大量漏检。

本实施例“手足口病肠道病毒的置换报告基因多重扩增”的基本原理是将原来检测肠道病毒就扩增其一段基因的直接PCR旧观念创新为待测基因通过一小段保守序列杂交带探针的无关报告基因，再扩增报告基因间接检测病源的新概念间接PCR方法。即将特异性高的探针杂交技术与极其灵敏度的PCR技术整合，将PCR扩增信号代替常规的探针同位素、荧光等物理标记信号的检测。其技术概要：将肠道病毒共同的一段5’-NTR非编码区约50bp 98％高度同源的保守区(BrCr株：nt441-491)作为探针序列，其探针序列分成相邻的右、左探针分别加在一段无关的报告基因首尾末端，带探针的报告基因就可通过其首尾特异的互补序列与待测肠道病毒保守区杂交，从而带首尾报告基因通过预设的杂交排列方式，其首尾末端靠近衔接，杂交体单链缺口被耐热连接酶连接，使报告基因成环，采用报告基因正中间的序列作为引物反向PCR扩增环状的报告基因。如果没有待测特异性基因的帮助，报告基因不能成环，反向PCR因报告基因模板末端断开也就不能扩增。(原理示意图1)。

利用同一套只是大小不同的报告基因(两末端不同延伸长度，中间大部份相同)，不同大小Report1，2，3加上不同的首尾探针，在同一反向系统中就可同时检测几种不同的保守靶序列。肠道病毒5’-NTR保守序列gtagtcctccggcccctgaatgcggct-aatcctaactgcggagcacat在致病株中98％高度同源，保守区探针加在序列无关的植物拟南芥LFY基因(260bp片段)首尾生成带首尾的报告基因，反向PCR产生一约300bp片段间接指示总的肠道病毒感染指标。同时在肠道病毒EV71型编码区衣壹蛋白VP1选取一段EV71所有亚型高度同源的相对保守序列(不与coxA16等其它型杂交)gagcta------gttgcg，并参考EV71亚型同源变异作为探针加在两端各缩短50bp的同一LFY基因片段的首尾，生成EV71亚型的报告基因，反向PCR产生一约200bp大小的间接指示肠道病毒EV71型的感染。肠道病毒Coxsackirirms A16 Vp1的一段特异序列gaccca------gccagt加在两段各延长30bp的同一LFY基因片段的首尾，生成CoxA16的报告基因，反向PCR产生一约360bp大小的间接指示肠道病毒CoxA16的感染。将三种报告基因混合，同时与待测标本杂交-耐热连接酶反应，再采用同一对反向引物，反向PCR报告基因，结果分析，产生300bp主带诊断肠道病毒感染，如果同时出现200bp条带则为EV71型，如果同时出现360bp条带则为CoxA16型。仅一条300bp条带则为EV71、CoxA16以外其它型肠道病毒感染。

技术及操作步聚：

本项目肠道病毒的报告基因扩增检测法较常规的肠道病毒基因直接PCR法，只增加了报告基因制备及杂交-耐热连接酶反应，但没有了常规PCR繁琐的标本处理及纯化逆转录步聚。而且报告基因可以大批量厂家预先生产好。

(1)带首尾探针的报告基因制备：

选取与肠道病毒种属很远的植物似南芥LFY两段约300bp左右的片段分别作为第一套和第二套(备用)报告基因，报告基因长度标准以反向PCR效率最佳为主要考虑。

第一套带首尾探针的报告基因(Report I)制备：

Report I又包括三种不同首尾探针的不同大小LFY报告基因。总的策略思路是将CoxA16VP1编码区特异性片段作为探针序列加在第一套约320bp大小LFY序列，生成CoxA16型特异的360bp大小报告基因；将所有肠道病毒致病株共同5’-NTR非编码区(BrCr株nt441-491)保守序列作为探针序列加在同一套但两端各缩短30bp(约260bp)的LFY序列，生成总的肠道病毒指示感染的300bp大小报告基因；再将EV71型中高度同源的相对保守序列(参考各亚型变异后)作为探针序列加在同一套但两端各再缩短50bp(约160bp)的LFY序列，生成EV71型指示的200bp大小报告基因。

合成报告基因引物时，将待测的三对双探针序列分别加在三段不同大小(320bp，260bp和160bp)同一段LFY序列上、下游引物外侧，即右边探针序列(约20base)以有意义链加在LFY 5’端引物前面；左边探针序列(约20base)以反意义链接在LFY3’端引物后面。使用此三对引物(上游引物5’端生物素标记，下游引物5’端磷酸化)和pfu酶分别扩增LFY生成三条加首尾的报告基因，琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的报告基因DNA分别重溶于dH₂O。

第二套带首尾探针的报告基因(Report II)制备：

Report II以肠道病毒致病株EVA，CoxA16，EV71，也包括poliovirus共同的protein 2C保守序列作为探针序列，其右左部分分别加在另一段约260bp LFY片段首尾形成第二套备用报告基因。在阴性对照组假阳性反应后，替换第一套报告基因系统工作一段时间，待实验室自净后或第二套亦对照组出现假阳性后才换回第一套系统。

(2)杂交-耐热连接酶反应：

将第一套三种不同大小的报告基因DNA混合，与待测标本杂交，如有阳性模板则通过其预选保守序列与加首尾报告基因DNA两侧末端互补探针序列杂交，使加首尾报告基因DNA 5’末端和3’末端因结合待测模板保守杂交序列而相互首尾靠近衔接，并经Taq连接酶连接，缺口修复而生成环状报告基因DNA。并且可以进行95℃×5mins-50℃×5mins热循环2-10次。而未杂交的双链报告基因DNA链的首尾平末端在耐热连接酶50℃以上工作时不会连接，低温时耐热Taq连接酶又不会工作。结果只有阳性标本中因有阳性模板杂交序列帮助，报告基因DNA才能形成环状DNA，而阴性标本则只存在线性报告基因DNA。

耐热连接酶反应从第二个循环开始，不仅待测特异性阳性基因帮助报告基因DNA成环，而且已经成环的报告基因DNA亦协助断开的报告基因DNA成环，所以成环的报告基因DNA也是以指数方式增长。

(3)环状报告基因反向PCR：

采用报告基因正中间的序列作为反向PCR引物，向外延伸反向扩增环状报告基因DNA，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，产生三种360bp，300bp和200bp大小PCR条带，仅出现300bp条带指示总的肠道病毒感染，300bp+200bp条带为EV71型感染，300bp+360bp条带为CoxA16型感染，而阴性标本因报告基因不成环，线性DNA采用中间序列作为反向引物，向外延伸反向扩增不出，电泳没有DNA条带。

调节置换报告基因步聚的反应条件，可使系统检测灵敏度在纳克(ng)、皮克(pg)及飞克(fg)等不同水平范围内有效调节，总可以找出一个调节关键点，使真正阳性标本有效反应阳性，下调/放弃一点剩余/过度的灵敏度换取系统对气雾胶交叉污染的数十或数百个以下拷贝不反应/不敏感，减少交叉污染引起的假阳性。加上良好的PCR实验室操作(如实验室分区，在超净工作台内工作，带手套，使用过滤芯吸头等)，反向PCR产物在另设一间专门独立的电泳实验室进行凝胶电泳，并且PCR产物单向传至电泳室，效果就等同于实时荧光PCR的闭管操作。同时使用了5’端Oligo d(A)标记的反向引物，在电泳缓冲液盒中加入适量Oligo d(T)交联的纤维素凝胶颗粒，结果从电泳凝胶中渗出少量的反向PCR产物，就会通过Oligo d(A)-Oligo d(T)结合至凝胶颗粒，减少挥发。再则，反向PCR底物采用dUTP代替dTTP，挥发的PCR产物进一步可用尿嘧啶N-糖基化酶降解破坏。如果阳性与阴性对照均不工作，说明污染，就可换第二套报告基因系统，再污染再轮换。

以下是优选的实施例：

(一)第一套报告基因的制备：

选取与肠道病毒种属很远的植物拟南芥LFY基因一段序列(CDSnt781-1080)作为第一套ReportI共同的报告基因。其序列如下：

CCACTTGTAC(GAACAATGCC GTGAGTTCCT TCTTCAGGTC CAGACAATTG CTAAAGACCG TGGCGAAAAATGCCCCACCA AGGTGACGAA CCAAGTATTC AGGTACGCGA AGAAATCAGG AGCGAGTTACATAAACAAGC CTAAAATGCG ACACTACGTT CACTGTTACG CTCTCCACTG CCTAGACGAAGAAGCTTCAA ATGCTCTCAG AAGAGCGTTT AAAGAACGCG GTGAGAACGT TGGCTCATGGCGTCAGGCTT GTTACAAGCC ACTTGTGAAC ATCGCTTGTC GTCATGGCTG GGATATAGAC)GCCGTCTTTAA.

(1)EV总报告基因的制备：

选取肠道病毒致病株共同5’-NTR非编码区(BrCr株nt441-491)绝对保守序列作为探针序列，即gta gtc ctc cgg ccc ctg aat gcg gct-aat cct aac tgc gga gca cat，其右左部分分别加在约250bp LFY报告基因的首尾。具体方案是首先生成首尾带探针序列的LFY片段的克隆质粒，然后以该质粒为模板，仅以5’-NTR非编码区探针序列作为引物，扩增、纯化EV总报告基因。

质粒克隆上游引物：BamHI位点+右半探针有意义链+上游LFY引物有意义链

pI/EVF1：5’-gga gca cat acc ctt cag gtc cag aca att gct aaa g-3’

pI/EVF：5’-cg gga tcc aat cct aac tgc gga gca cat acc ctt cag-3’

质粒克隆下游引物：EcoRI位点+左半探针反意义链+下游LFY引物反意义链

pI/EVR1：5’-cag ggg ccg gag gac tac gtt cac aag tgg ctt gta ac-3’

pI/EVR：5’-cg gaa ttc agc cgc att cag ggg ccg gag gac tac-3’

以此对引物(pI/EVF∶F1＝9∶1)/(pI/EVR1∶R＝1∶9)常规PCR，产物纯化、酶切，克隆至pUC19质粒载体，测序鉴定。

合成EV总报告基因制备引物(且F生物素化，R磷酸化)：

I/EVF：5’-aat ccY aac tgc gga gca cat acc-3’

I/EVR：5’-agc cgc att cag ggg ccg gag gac-3’

以此对磷酸化引物制备EV总报告基因：

pUC-I/EV 1μl

5’I/EVF引物(5μM) 1μl

3’I/EVR引物(5μM) 1μl

10mM dNTPs 1μl

10×pfu聚合酶缓冲液 5μl

pfu聚合酶 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

首先94℃变性5分钟，再进行循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃35秒，经过25个循环后，最后72℃10分钟。

EV总报告基因PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于dH₂O。

(2)EV71型报告基因的制备：

选取肠道病毒EV71型衣壳蛋白编码区VP1的一段相对保守序列作为探针序列，该区序列不与其它肠道病毒亚型交叉，但在EV71的亚型之间仍存在一些变异。排列、比较所有从Genebank收集的EV71亚型(BrCr，B，C等)该区序列，总结出两个具有代表性的序列，a：gag cta ttc acc tac ag cgc t-tt gat gca gag ttcact ttt gtt gcg和b：gag ctg ttc acc tac atg cgc t-tt gac gca gaa ttc act ttt gtt gcg。每个右左部分分别加在两端各缩短一些约150bp的小LFY片段首尾，首先克隆这两种带EV71首尾探针的LFY片段质粒pUC-I 71a和pUC-I 71b。然后以该质粒为模板，以更广泛代表性的简并性VP1区引物扩增，纯化EV71型报告基因，可以指示绝大部EV71亚型的检测。

pUC-I71a上游引物：BamH I位点+右半探针有意义链+小LFY上游引物

pI71aF1：5’-ttt gtt gcg tgc act ccc ac gaa cca agt att cag gtata c-3’

pI71aF：5’-cg gga tcc gca gag ttc act ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3’

pUC-I71a下游引物：EcoR I位点+左半探针有意义链+小LFY下游引物

pI71aR1：5’-gaa tag ctc cac ctt tct cgc gtt ctt taa acg ctc-3’

pI71aR：5’-cg gaa ttc cat gta ggt gaa tag ctc cac ctt tct c-3’

以此对引物(pI71aF∶F1＝9∶1)/(pI71aR1∶R＝1∶9)常规PCR，产物纯化、酶切，克隆pUC19质粒载体，产生pUC-I71a，测序鉴定。

合成EV71a型报告基因制备简并性引物(且F生物素化，R磷酸化)：

I71aF：5’-tt gat/c gca gag ttc act ttt gtt/a gcg tgc act ccc ac-3’

I71aF’：5’-tt gac gca gag ttc act/c ttt gtc gcg tgc act ccc ac-3’

I71aR：5’-a gcg cat g/ata ggt gaa tag ctc cac-3’

以此对磷酸化引物制备EV71a型报告基因：

pUC-I71a 1μl

5’I71aF引物(5μM) 0.5μl

5’I71aF’引物(5μM) 0.5μl

3’I71aR引物(5μM) 1μl

10mM dNTPs 1μl

10×pfu聚合酶缓冲液 5μl

pfu聚合酶 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

EV71a报告基因PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于dH₂O。

pUC-I71b上游引物：BamH I位点+右半探针有意义链+小LFY上游引物

pI71bF1：(5’-ttt gtt gcg tgc act ccc ac gaa cca agt att cag gta c-3’)(同pI71aF1)

pI71bF：5’-cg gga tcc gca gaa ttc act ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3’

pUC-I71b下游引物：BamH I位点+左半探针有意义链+小LFY下游引物

pI71bR1：5’-gaa cag ctc cac ctt tct cgc gtt ctt taa acg ctc-3’

pI71bR：5’-cg gga tcc cat gta ggt gaa cag ctc cac ctt tct c-3’

以此对引物(pI71bF∶F1＝9∶1)/(pI71bR1∶R＝1∶9)常规PCR，产物纯化、酶切，克隆至pUC19质粒(BamHI alone酶切，Cip)，产生pUC-I71b，测序鉴定。

合成EV71b报告基因制备简并性引物(且F生物素化，R磷酸化)：

I71bF：5’-tt gac/t gca/g gaa ttc act ttt gtt gcg tgc ac-3’

I71bF’：5’-tt gac/t gca gag ttc acc ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3’

I71bR：5’-a g/acg cat gta ggt gaa cag ctc cac-3’

以此对磷酸化引物制备EV71b报告基因：

pUC-I71b 1μl

5’I71bF引物(5μM) 0.5μl

5’I71bF’引物(5μM) 0.5μl

3’I71bR引物(5μM) 1μl

10mM dNTPs 1μl

10×pfu聚合酶缓冲液 5μl

pfu聚合酶 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

EV71b报告基因PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于dH₂O，并与EV71a报告基因DNA合并。

(3)CoxA16型报告基因的制备：

选取肠道病毒CoxA16型编码区衣壳蛋白VP1的一段特异性序列作为探针序列，即gac cca cca gct caa gtg tca-gtc ccc ttc atg tca cca gcc agt。将其右左部分分别加在两端各延长一些约320bp的大LFY片段首尾，首先克隆这种带CoxA16型首尾探针的LFY片段质粒pUC-IA16。然后以该质粒为模板，以其简并性的VP1区引物扩增，纯化CoxA16型报告基因，可以指示绝大部CoxA16型的检测。

质粒pUC-IA16上游引物：BamH I位点+右半探针有意义链+大LFY上游引物

pIA16F1：5’-atg tca cca gcc agt cca ctt gta cga aca atg cc-3’

pIA16F：5’-cg gga tcc gtc ccc ttc atg tca cca gcc agt cca c-3’

质粒pUC-IA16下游引物：EcoR I位点+左半探针反意义链+大LFY下游引物

pIA16R1：5’-ttg agc tgg gtc tta aag acg gcg tct ata tcc-3’

pIA16R：5’-cg gaa ttc tga cac ttg agc tgg tgg gtc tta aag-3’

以此对引物(pIA16F∶F1＝9∶1)/(pIA16R1∶R＝1∶9)常规PCR，产物纯化、酶切，克隆至pUC19质粒载体，产生pUC-IA16，测序鉴定。

合成CoxA16型报告基因制备引物(且F生物素化，R磷酸化)：

IA16F：5’-gtc/a ccc ttc atg tca/t cca gcc agt cca ctt gta c-3’

IA16R：5’-tga cac ttg a/tgc t/cgg tgg gtc tta aag acg g-3’

以此对磷酸化引物制备CoxA16型报告基因：

pUC-IA16 1μl

5’IA16F引物(5μM) 1μl

3’IA16R引物(5μM) 1μl

10mM dNTPs 1μl

10×pfu聚合酶缓冲液 5μl

pfu聚合酶 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

CoxA16型报告基因PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于dH₂O。

最后EV总报告基因DNA，EV71a报告基因+EV71b报告基因DNA和CoxA16型报告基因DNA混合合并为第一套ReportI报告基因。

(二)第二套报告基因的制备：

选取与肠道病毒种属很远的植物拟南芥LFY基因另一段序列(CDSnt105-355)约250bp作为第二套ReportII的报告基因。其序列如下：

ACACCGCAGA CGGCTGCTTT TGGGATGCGA CTTGGTGGTT TAGAGGGACT ATTCGGTCCG TACGGTATACGTTTCTACAC GGCGGCGAAG ATAGCGGAGT TAGGTTTTAC GGCGAGCACG CTTGTGGGTA TGAAGGACGAGGAGCTTGAA GAGATGATGA ATAGTCTCTC TCATATCTTT CGTTGGGAGC TTCTTGTTGG TGAACGGTACGGTATCAAAG CTGCCGTTAG AGCTGAACGG AGACGATTGC.

选取肠道病毒致病株共同的编码区Protein 2C一段绝对保守序列作为探针序列，即atg aat aac tac atg cag ttc aag a-gc aaa cac cgt att gaa cct gta tgc，其右左部分分别加在约250bp第二段LFY报告基因的首尾。具体方案是首先生成首尾带探针序列的LFY片段的克隆质粒pUCII/EV，然后以该质粒为模板，仅以Protein2C编码区探针序列作为引物，扩增、纯化ReportII总报告基因。

pII/EVF1：5’-att gaa cct gta tgc aca ccg cag acg gct gct ttt g-3’

pII/EVF：5’-cg gga tcc cac cgt att gaa cct gta tgc aca cc-3’

pII/EVR1：5’-cat gta gtt att cat gca atc gtc tcc gtt cag ctc-3’

pII/EVR：5’-cg gaa ttc gaa ctg cat gta gtt att cat gca atc-3’

以此对引物(pII/EVF∶F1＝9∶1)/(pII/EVR1∶R＝1∶9)常规PCR，产物纯化、酶切，克隆至pUC19质粒载体，测序鉴定。

合成ReportII总报告基因制备引物(且F生物素化，R磷酸化)：

II/EVF：5’-gc aaa cac cgt att gaa cct gta tg-3’

II/EVR：5’-t ctt gaa ctg cat gta gtt att cat g-3’

以此对磷酸化引物制备ReportII总报告基因：

pUCII/EV 1μl

5’II/EVF引物(5μM) 1μl

3’II/EVR引物(5μM) 1μl

10mM dNTPs 1μl

10×pfu聚合酶缓冲液 5μl

pfu聚合酶 1μl

dH ₂ O 40μl

50μl

ReportII总报告基因PCR产物经琼酯糖凝胶电泳纯化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的DNA重溶于dH₂O。

(三)杂交——耐热连接酶反应：

血液、脓液及分泌物标本可直接加样1μl，或用生理盐水稍做稀释直接加样。对于粪便标本，需要富集病毒RNA，即标本加0.3％SDS，RNAsin抑制剂和5’端Oligo d(A)标记的短序列(EV5’-NTR非编码序列5’-aag agt cta ttg agc tag tta-3’和Protein3D序列5’-gtg tac ttg gtg gaa tgc cct cag gct-3’小段保守区反意义链做富集Oligo)，于10ml生理盐水中稍稍混匀，沉一会儿，弃固体残渣，上清于一新15ml离心管中，加入适量Oligo d(T)交联的纤维素凝胶颗粒，生理盐水洗涤凝胶颗粒一次，加2-5μl颗粒进行杂交-耐热连接酶反应。

待测样本(血液直接加样) 1-2μl

带首尾报告基因DNA 1μl

10×Taq连接酶缓冲液 2μl

Taq连接酶(2×稀释) 1μl

dH ₂ O 15μl

20μl

进行10-20循环的95℃×1分钟和52℃×5分钟。循环数依灵敏范围需要而定。反应完成后立即置-20℃冷藏待用。耐热连接酶热变性95℃时加入或采用热启动连接酶可进一步减少非特异性。

(四)环状报告基因反向PCR：

合成反向PCR引物：采用报告基因DNA正中间的序列(即报告基因LFY片段中间黑体标示的序列)设计合成反向PCR引物。

5’端反向引物F：5’-CAC TGT TAC GCT CTC CAC TGC C-3’

3’端反向引物R：5’-G AAC GTA GTG TCG CAT TTT AG-3’

杂交连接酶反应液 2μl

5’端反向引物F 1μl

3’端反向引物R 1μl

10mM dNTP 1μl

10×Taq buffer 5μl

Taq polymerase 1μl

dH ₂ O 39μl

50μl

首先94℃变性5分钟，然后20-30个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃35秒。25个循环后72℃10分钟。

(五)PCR产物分析：

用1.5-2.5％琼酯糖凝胶agarose电泳分析。三种360bp，300bp和200bp大小PCR条带，仅出现300bp条带指示总的肠道病毒感染，300bp+200bp条带为EV71型感染，300bp+360bp条带为CoxA16型感染。

取两例疑似手足口病病人肠道分泌物样本，分别抽提RNA，按照上述检测样本肠道病毒，结果如图2所示：M电泳道：DNA标准品；1.电泳道：阳性对照，共有360bp，300bp，200bp三条带，2.电泳道：空白阴性对照；3.样品道：产生300bp主带，同时出现200bp条带，说明其为EV71型肠道病毒阳性；4.样品道：仅一条300bp主条带，说明其为EV71、CoxA16以外其它型肠道病毒感染。

序列说明

SEQ ID NO.1为用于第一套ReportI共同报告基因序列，SEQ ID NO.2～5依次为引物pI/EVF1、pI/EVF、pI/EVR1和pI/EVR，SEQ ID NO.6&7为引物I/EVF和I/EVR，SEQ ID NO.8～11依次为引物pI71aF1、pI71aF、pI71aR1和pI71aR，SEQ ID NO.12～14依次为引物I71aF、I71aF’和I71aR，SEQ ID NO.15～18依次为引物pI71bF1、pI71bF、pI71bR1和pI71bR，SEQ IDNO.19～21依次为引物I71bF、I71bF’和I71bR，SEQ ID NO.22～25依次为引物pIA16F1、pIA16F、pIA16R1和pIA16R，SEQ ID NO.26&27为引物IA16F和IA16F，SEQ ID NO.28为用于第二套ReportII共同报告基因序列，SEQ ID NO.29～32依次为引物pII/EVF1、pII/EVF、pII/EVR1和pII/EVR，SEQ ID NO.33&34为引物II/EVF和II/EVR、SEQ ID NO.35&36为扩增报告基因的引物。

序列表

<110>北京泰格瑞分子检验有限公司

<120>链置换聚合酶链反应

<130>

<160>36

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>321

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

ccacttgtac gaacaatgcc gtgagttcct tcttcaggtc cagacaattg ctaaagaccg 60

tggcgaaaaa tgccccacca aggtgacgaa ccaagtattc aggtacgcga agaaatcagg 120

agcgagttac ataaacaagc ctaaaatgcg acactacgtt cactgttacg ctctccactg 180

cctagacgaa gaagcttcaa atgctctcag aagagcgttt aaagaacgcg gtgagaacgt 240

tggctcatgg cgtcaggctt gttacaagcc acttgtgaac atcgcttgtc gtcatggctg 300

ggatatagac gccgtcttta a 321

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggagcacata cccttcaggt ccagacaatt gctaaag 37

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgggatccaa tcctaactgc ggagcacata cccttcag 38

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

caggggccgg aggactacgt tcacaagtgg cttgtaac 38

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggaattcag ccgcattcag gggccggagg actac 35

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aatccyaact gcggagcaca tacc 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agccgcattc aggggccgga ggac 24

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tttgttgcgt gcactcccac gaaccaagta ttcaggtac 39

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgggatccgc agagttcact tttgttgcgt gcactcccac 40

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gaatagctcc acctttctcg cgttctttaa acgctc 36

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cggaattcca tgtaggtgaa tagctccacc tttctc 36

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n＝″t″or″c″

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>n＝″t″or″a″

<400>12

ttgangcaga gttcactttt gtngcgtgca ctcccac 37

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>n＝″t″or″c″

<400>13

ttgacgcaga gttcacnttt gtcgcgtgca ctcccac 37

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n＝″g″or″a″

<400>14

agcgcatnta ggtgaatagc tccac 25

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tttgttgcgt gcactcccac gaaccaagta ttcaggtac 39

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cgggatccgc agaattcact tttgttgcgt gcactcccac 40

<210>17

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gaacagctcc acctttctcg cgttctttaa acgctc 36

<210>18

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cgggatccca tgtaggtgaa cagctccacc tttctc 36

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n＝″c″or″t″

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n＝″a″or″g″

<400>19

ttgangcnga attcactttt gttgcgtgca c 31

<210>20

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n＝″c″or″t″

<400>20

ttgangcaga gttcaccttt gttgcgtgca ctcccac 37

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>n＝″g″or″a″

<400>21

ancgcatgta ggtgaacagc tccac 25

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

atgtcaccag ccagtccact tgtacgaaca atgcc 35

<210>23

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cgggatccgt ccccttcatg tcaccagcca gtccac 36

<210>24

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

ttgagctggg tcttaaagac ggcgtctata tcc 33

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

cggaattctg acacttgagc tggtgggtct taaag 35

<210>26

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n＝″c″or″a″

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>n＝″a″or″t″

<400>26

gtncccttca tgtcnccagc cagtccactt gtac 34

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>n＝″a″or″t″

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>n＝″t″or″c″

<400>27

tgacacttgn gcnggtgggt cttaaagacg g 31

<210>28

<211>250

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>28

acaccgcaga cggctgcttt tgggatgcga cttggtggtt tagagggact attcggtccg 60

tacggtatac gtttctacac ggcggcgaag atagcggagt taggttttac ggcgagcacg 120

cttgtgggta tgaaggacga ggagcttgaa gagatgatga atagtctctc tcatatcttt 180

cgttgggagc ttcttgttgg tgaacggtac ggtatcaaag ctgccgttag agctgaacgg 240

agacgattgc 250

<210>29

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

attgaacctg tatgcacacc gcagacggct gcttttg 37

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

cgggatccca ccgtattgaa cctgtatgca cacc 34

<210>31

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

catgtagtta ttcatgcaat cgtctccgtt cagctc 36

<210>32

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

cggaattcga actgcatgta gttattcatg caatc 35

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

gcaaacaccg tattgaacct gtatg 25

<210>34

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

tcttgaactg catgtagtta ttcatg 26

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

cactgttacg ctctccactg cc 22

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gaacgtagtg tcgcatttta g 21

Claims

1“链置换聚合酶链反应”，其特征是将靶分子DNA和/或RNA链置换成与靶分子不同的报告基因链，再扩增报告基因链间接指示靶分子。

2.根据权利要求1所述的“链置换聚合酶链反应”，链置换特征在于以靶分子DNA链和/或RNA链上的一段或多段预选序列作为靶序列与一种或多种报告基因链的首尾预加探针杂交，使报告基因链的首尾预加探针的末端相邻，用连接酶连接，使报告基因链成环，然后反方向PCR扩增将待测靶分子直接扩增转换成包括一套以上的报告基因环，如果没有特异性待测基因帮助，报告基因不能成环，也就不能反向PCR扩增。

3.根据权利要求1所述“链置换聚合酶链反应”，其适用于PCR分子检测应用领域，包括PCR及产物凝胶电泳检测、实时荧光PCR定量检测，PCR产物生物芯片分析、分子组化和分子病理原位PCR。

4.根据权利要求1所述的“链置换聚合酶链反应”，所述双探针为待测靶DNA链和/或RNA链通过预选的两小段保守序列或特异序列作为探针互补序列，所述双探针长度为20-200base，单个探针长度为10-100base。

5.根据权利要求1所述的“链置换聚合酶链反应”，所述报告基因链指与靶分子无关的、或种系不同的核酸单链或有效单链，其首尾分别预加上靶分子的两相邻的小段保守序列或特异序列互补的探针，所述报告基因长度为80-1000base。

6.根据权利要求1所述的“链置换聚合酶链反应”，所述链置换耐热连接酶反应指带末端探针的报告基因首尾与待测靶基因模板变性后杂交，连接酶或耐热连接酶连接报告基因首尾成环，95℃变性，15℃-70℃复性杂交，连接进行热循环，所述循环次数为1-50次。

7.根据权利要求6所述的“链置换聚合酶链反应”，所述置换耐热连接酶反应的连接酶指DNA连接酶或耐热连接酶Taq DNA ligase。

8.根据权利要求1所述的“链置换聚合酶链反应”，所述报告基因环的反向PCR扩增的是无关的报告基因序列和靶分子预选的小段保守序列或特异序列互补的探针序列，所述报告基因环反方向PCR为1至多重PCR。

9.一种DNA或RNA单链，包括报告基因，在所述报告基因首尾两端具有探针，该探针能够与靶分子DNA或RNA链杂交，并且使得报告基因首尾两端探针的末端相邻。

10.一种试剂盒，其包括：权利要求9所述的DNA或RNA单链、Taq连接酶及其缓冲液、10mM dNTPs、Taq聚合酶及其缓冲液、反向引物F/R和凝胶电泳试剂。