CN113322353B - 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒 - Google Patents

一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒分子检测技术领域，提供了一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA试剂盒，包括核苷酸序列如SEQID NO:1‑4所示的检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物和TwistAmp®DNA amplification Basic Kits。发明提供的试剂盒对甘薯病毒2、甘薯轻斑驳病毒等其他侵染甘薯的病毒无特异性条带片段，检测准确、高效灵敏，为可对种薯种苗组培苗以及大田中薯苗甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的快速检测、早期预警等提供服务。

Description

一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA试 剂盒
技术领域
本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及到利用重组酶聚合酶等温扩增技术同时检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的引物和试剂盒。
背景技术
甘薯羽状斑驳病毒（Sweetpotato feathery mottle virus，SPFMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒，能够引起甘薯叶片花叶斑驳等症状。该病毒是我国甘薯上的主要病毒，在我国甘薯种植区均有分布。甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）属于长线型病毒科（Closteroviridae），毛线型病毒属（Crinivirus）病毒。2009年该病毒在我国广东首次发现，能够引起甘薯矮缩等症状。一般来说，SPFMV和SPCSV单独侵染引起的症状比较轻微，但二者共同侵染会造成甘薯出现严重的矮化，叶片畸形等症状，这种共侵染引起的病害常被称为SPVD，严重影响甘薯植株的生长和甘薯产量，由于甘薯无性繁殖的特殊性，该病在各个薯区快速蔓延成为制约我国甘薯产业发展的重要病害。由于甘薯病毒病暂时没有特效药剂进行防治，在苗床上及早铲除病毒病苗是防治大田甘薯病毒病的重要手段，因此加强对引起该病害的SPFMV和SPCSV的检测尤为重要。
当下病毒的检测方法有，电镜检测，指示植物检测，血清学检测和PCR核酸检测，电镜检测方法繁琐，需要借助大型电镜设备和专业人士操作，指示植物检测受到接种效率，病毒寄主范围等因素影响以及复合侵染病毒难以区分等问题，血清学检测和PCR核酸检测是常用的两类检测方法，但血清学需要借助相应的抗体，而且灵敏度有限，PCR核酸检测由于其快速灵敏的特点被广泛应用于各类微生物检测领域，但所需的仪器设备昂贵。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是Piepenburg等开发的一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶共同参与的恒温扩增的新技术，具有特异性强，操作简便等优势，突破了常规PCR温控仪器的局限，在实践检测和现场快速诊断中具有广泛的适用性。
目前利用RPA对多种植物病原微生物进行检测，但通过RPA技术同时检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA试剂盒未见报道，因此建立甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒对于甘薯病毒病害快速诊断检测上具有广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种应用RPA技术检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物组、试剂盒及检测方法。
一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RPA引物，其正向引物序列如SEQ ID NO: 1所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 2所示。
一种检测甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物，其正向引物序列如SEQ ID NO: 3所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 4所示。
上述引物在检测甘薯羽状斑驳病毒或甘薯褪绿矮化病毒中的应用。
一种检测甘薯羽状斑驳病毒SPFMV和甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的试剂盒，所述试剂包括上述检测甘薯羽状斑驳病毒的RPA引物、检测甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物和TwistAmp® DNA amplification Basic Kits。
优选地，所述试剂盒还包括阳性质粒模板。
一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的方法，包括以下步骤：
（1）对植物材料提取RNA并反转录获得cDNA；
（2）以步骤（1）中的cDNA为模板，以上述检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物为引物进行恒温扩增；
（3）将步骤（2）获得的扩增产物与苯酚：氯仿为1:1v/v的混合溶剂等体积混匀，离心后取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测并判断结果：若没有条带则不含有甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒；若出现约180 bp特异性条带，则甘薯羽状斑驳病毒为阳性；若出现约370bp特异性条带，则甘薯褪绿矮化病毒为阳性。
本发明具有以下优点：
本发明针对甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒全基因组保守区域，设计了甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒RPA引物对，筛选出特异性强、灵敏度高的引物组合。利用本发明提供的试剂盒和检测方法，该特异性引物对甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒特异性片段大小分别为184bp和370bp，对甘薯病毒2、甘薯轻斑驳病毒等其他侵染甘薯的病毒无特异性条带片段，检测准确、高效灵敏，为可对种薯种苗组培苗以及大田中薯苗甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的快速检测、早期预警等提供服务。
附图说明
图1为不同引物组扩增电泳图，其中M.DL 2000 DNA Marker；1：引物组1；2：引物组2；
图2为反应温度的优化电泳图，其中M：DL 2000 DNA Marker；1：33℃；2：36℃；3：39℃；4：42℃；5：45℃；6：48℃；7：51℃；
图3为反应时间的优化电泳图，其中M：DL 2000 DNA Marker；1：10 min；2：15 min；3：20 min；4：25 min；5：30 min；
图4为甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒双重RPA特异性检测电泳图，其中M：DL 2000 Marker；1：黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）；2：甘薯病毒2（Sweetpotato virus 2，SPV2）；3：甘薯轻斑驳病毒（Sweet potato mild mottle virus，SPMMV）；4：甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）；5：甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）；6：甘薯羽状斑驳病毒+甘薯褪绿矮化病毒（SPFMV+SPCSV）；
图5A为双重RPA对SPFMV的灵敏度检测结果电泳图，其中M：DL2000 DNA Marker；1：10 ng/μL；2：1ng/μL；3：10-1 ng/μL；4：10-2 ng/μL；5：10-3 ng/μL；6：10-4 ng/μL；7：10-5 ng/μL；8：H2O；
图5B为双重PCR对SPCSV的灵敏度检测结果电泳图，其中1：10 ng/μL；2：1ng/μL；3：10-1 ng/μL；4：10-2 ng/μL；5：10-3 ng/μL；6：10-4 ng/μL；7：10-5 ng/μL；8：H2O；M：DL2000 DNAMarker。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮缩病毒RPA扩增引物设计
1.1 甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮缩病毒RPA引物设计和筛选
根据甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮缩病毒RNA2与其他侵染甘薯的病毒的基因组序列进行比对分析，设计2组引物进行RPA扩增。其中，所述引物对具体为：
第一组引物
SPFMV-RPAF1：5’--3’ GAATCTKCTATTGTWGAACCTATTGCCACACC，如SEQ ID NO:1所示；
SPFMV-RPAR1：5’--3’ TTCTGAACCCATTTACGCACCATCTTGTG，如SEQ ID NO:2所示；
SPCSV-RPAF2：5’--3’ CGCAGGTCYATWGTWAATGTGAATCARYTGT，如SEQ ID NO:3所示；
SPCSV-RPAR2：5’--3’GTCATSACCTTACTSGAWATTGAGGGGAAGAA，如SEQ ID NO:4所示；
第二组引物
SPFMV-RPAF3：5’--3’CAACATATGARCCAGARCAGTWTGAWGTTGC，SEQ ID NO:5所示；
SPFMV-RPAR3：5’--3’CTTTTAAGAGTCCCTTATGATACGTAATAG，SEQ ID NO:6所示；
SPCSV-RPAF4：5’--3’TGAYGATGACATWGCGARGATMTGTGCCAG，SEQ ID NO:7所示；
SPCSV-RPAR4：5’--3’TATTATCTGCWCCAAGGTTRATAYTGAAG，SEQ ID NO:8所示。
1.2 甘薯RNA的提取和反转录
取甘薯病样0.1 g用液氮研磨成粉状，利用多糖多酚RNA提取试剂盒（天根）对RNA进行提取，将提取出的RNA取6 μL，加入2.5 mM dNTP 1 μL，10 μM下游引物SPFMV-RPAR1、SPCSV-RPAR2各1 μL和SPFMV-RPAR3、SPCSV-RPAR4各1 μL，分置于2个PCR管中，65℃5 min后，冰上2 min。然后加入Ribonuclease Inhibitor核糖核酸酶抑制剂0.5 μL，5×PrimeScript Buffer 4 μL，Prime Script™ Reverse Transcriptase反转录酶1 μL，加入ddH2O补足至20 μL，42℃ 60 min，85℃ 5 min获得cDNA。
1.3 RPA反应体系
反应使用TwistAmp® Basic kit，反应总体系为50 μL，首先在0.2 mL的PCR管中加入缓冲液29.5 μL，10 μM的SPFMV上下游引物各1.6 μL，SPCSV上下游引物各0.8 μL，2.5mM dNTP 5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.2 μL，用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入280 mM的MgOAc溶液2.5 μL。
1.4 RPA扩增反应条件
将上述RPA扩增体系充分混匀，置于39℃的水浴或者PCR仪中孵育25 min，获得RPA扩增产物。
1.5 RPA扩增产物电泳检测
将RPA产物加入等体积苯酚：氯仿（1:1）混匀，12 000 rpm离心1 min，取5 μL RPA产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像。
1.6 引物筛选
将利用不同引物组的扩增产物加入等体积苯酚：氯仿（1:1）混匀，12 000 rpm离心1 min，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，引物组1有两条明亮的特异性条带，引物组2只有一条明亮的特异性条带，所以选择引物组1进行后续实验。
1.7反应温度的优化
选取第一组引物扩增获得的SPFMV和SPCSV阳性质粒为模板，用第一组引物分别在33、36、39、42、45、48、51℃下进行RT-RPA反应，反应时间为20 min，反应产物经50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液纯化后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，各个反应温度均扩增出了目的条带，其中反应温度为39℃时，其目的条带最为清晰明亮且特异性强，故本实验中最适的反应温度为39℃(图2)。
1.8反应时间的优化
在优化后的反应温度条件反应温度为39℃下，以SPFMV和SPCSV阳性质粒为模板，分别在10、15、20、25、30min条件下进行RT-RPA反应，反应产物经50 μL苯酚/氯仿(1:1)溶液纯化后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在15 min反应后，出现了较为清晰明亮的目的条带，故本实验中，最优的RPA反应时间为25 min(图3)。
实施例2 双重RPA反应的特异性检验
收集甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿矮缩病毒（SPCSV）、甘薯病毒2（SPV2）、黄瓜花叶病毒（CMV）、甘薯轻斑驳病毒（SPMMV）等RNA病毒病样，按照1.2中所述方法获得cDNA并为模板，以ddH2O为阴性对照，按照实例1.3、1.4、1.5进行RPA反应并检测。
具体结果如图4显示，样品4甘薯羽状斑驳病毒仅出现一条约180 bp的特异性条带，样品5甘薯褪绿矮缩病毒仅出现了1条约370 bp的特异性条带；样品6甘薯羽状斑驳病毒+甘薯褪绿矮缩病毒分别出现约180 bp和370 bp的特异性条带；其余样本无条带出现，说明所建立的检测方法对SPFMV和SPCSV具有较好的特异性。
实施例3 双重RPA反应的灵敏度检验
以SPFMV和SPCSV阳性质粒以10倍浓度梯度依次稀释，稀释成1 ng/μL，10-1 ng/μL，10-2 ng/μL，10-3 ng/μL，10-4 ng/μL，10-5 ng/μL，10-6 ng/μL。分别以这7种不同浓度的为模板（1 μL），按照1.3、1.4、1.5进行RPA反应并检测。
PCR检测：以上述梯度稀释的质粒模板，扩增体系为PCR Mix预混液（TsingKe，北京）12.5 μL，模板1 μL，引物对SPFMV-RPAF1/ SPFMV-RPAR1各0.3 μL，SPCSV-RPAF2/SPCSV-RPAR2各0.7 μL，ddH2O补足至25 μL，在PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应条件如下：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54.9℃ 30 s，72℃ 25 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。取5 μLPCR产物经1%-1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，经核酸染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像。
结果如图5A和图5B显示，本发明RPA方法与普通PCR检测的灵敏度相当，约为10-4ng/μL。
利用本发明提供的引物、试剂盒和检测方法，可对甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮缩病毒进行快速鉴定，检测过程简便，结果灵敏准确，为甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮缩病毒的早期诊断和鉴定等提供服务。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，但不是用于对本发明的限制，熟悉本技术领域的技术人员应对理解，在不脱离本发明原理的前提下据此所做的若干变化和修饰，同样应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)
<120> 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的RPA试剂盒
<130> 20210610
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPFMV-RPAF1
<400> 1
gaatctkcta ttgtwgaacc tattgccaca cc 32
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPFMV-RPAR1
<400> 2
ttctgaaccc atttacgcac catcttgtg 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPCSV-RPAF2
<400> 3
cgcaggtcya twgtwaatgt gaatcarytg t 31
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPCSV-RPAR2
<400> 4
gtcatsacct tactsgawat tgaggggaag aa 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPFMV-RPAF3
<400> 5
caacatatga rccagarcag twtgawgttg c 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPFMV-PRAR3
<400> 6
cttttaagag tcccttatga tacgtaatag 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPCSV-RPAF4
<400> 7
tgaygatgac atwgcgarga tmtgtgccag 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPCSV-RPAR4
<400> 8
tattatctgc wccaaggttr ataytgaag 29

Claims (3)

1.一种同时检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的试剂盒，其特征在于，包括
正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的检测甘薯羽状斑驳病毒的RPA引物；
正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的检测甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物；
和TwistAmp® DNA amplification Basic Kits。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质粒模板。
3.一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对植物材料提取RNA并反转录获得cDNA；
（2）以步骤（1）中的cDNA为模板，以检测甘薯羽状斑驳病毒的RPA引物和检测甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物为引物进行恒温扩增；
（3）将步骤（2）获得的扩增产物与苯酚：氯仿体积比为1:1的混合溶剂等体积混匀，离心后取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测并判断结果：若没有条带则不含有甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒；若出现约180 bp特异性条带，则甘薯羽状斑驳病毒为阳性；若出现约370 bp特异性条带，则甘薯褪绿矮化病毒为阳性；
检测甘薯羽状斑驳病毒的RPA引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
检测甘薯褪绿矮化病毒的RPA引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
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Title
甘薯羽状斑驳病毒的RT-PCR 检测技术构建;肖海峻，等;《分子植物育种》;20191231;第17卷(第13期);第4302-4306页 *
甘薯退绿矮化病毒的RT-PCR检测技术构建;肖海峻,等;《分子植物育种》;20171231;第15卷(第07期);第2896-2900页 *
重组酶聚合酶扩增技术在植物病原快速检测中的应用;马文娣，等;《植物保护》;20210608;第1-5、13页 *

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Application publication date: 20210831

Assignee: Xuzhou zhongnongshuke Agricultural Development Co.,Ltd.

Assignor: JIANGSU XUHUAI DISTRICT XUZHOU AGRICULTURAL Research Institute (JIANGSU XUZHOU SWEET POTATO RESEARCH CENTER)

Contract record no.: X2023980052769

Denomination of invention: A RPA kit for detecting sweet potato feather mottle virus and sweet potato chlorotic dwarf virus

Granted publication date: 20220826

License type: Exclusive License

Record date: 20231219