CN111534603B - 一种利用荧光rpa鉴定白纹伊蚊的方法 - Google Patents

一种利用荧光rpa鉴定白纹伊蚊的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，设计了白纹伊蚊检测特异性引物和探针，建立了检测白纹伊蚊的荧光RPA方法，在39℃，20min即可完成检测；操作简便，灵敏度高，特异性强，重复性好。

Description

一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法。
背景技术
白纹伊蚊（Aedes albopictus），也被称为亚洲虎蚊，属于双翅目蚊科，源于东南亚，是东南亚和中国的常见蚊种。白纹伊蚊既是一种攻击性很强的蚊子，也是一种重要的病毒媒介，它可以传播很多病原体，包括登革热、罗斯河病毒和西尼罗病毒。白纹伊蚊是“半家蚊”，喜欢孳生在小型的积水容器中；家居周围废弃的缸、罐、桶、锅、泡菜坛、盆景、莲花缸、罐头盒、碗、杯等积水中；室内的插花瓶、水缸、痰桶和花盆托等积水；植物的茎叶等小型积水，如竹筒、叶腋、椰子壳、芭蕉叶、香蕉叶等积水中；白纹伊蚊除孳生在人居周围外，在远离人居的竹林的竹桶、树洞、石穴等积水容器中，也可孳生大量白纹伊蚊。
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术是一种新型的在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。该技术在恒温下，利用重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的复合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白（single stranded DNA binding，SSB）的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。反应产物呈指数级增长，整个反应过程无需特殊的辅助仪器，操作简便。
因此，提供一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，操作简便，灵敏度高，特异性强，重复性好。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的引物探针组合物，所述引物序列如下：
上游引物：5’-GTCGTGGTTGATGAGTACATCCCAAACCGGAGT-3’；SEQ ID NO.3；
下游引物：5’-GAGCCCACTGAGAGTTCCAGGTGACTGTTCC-3’；SEQ ID NO.4；
所述探针序列如下：
5’-CCCGTGTGTGAGTTGTGCGGTGCGGTGTCG[FAM-dT]GG[THF]A[BHQ1-dT]TAGGCGCGTGCGCG-3’-PHO。
进一步，含有上述引物探针组合物的试剂盒。
进一步，一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，步骤如下：
（1）提取样品DNA；
（2）以样品DNA为模板，利用上述的引物探针组合进行扩增；在39℃条件下反应20min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，设计了白纹伊蚊检测特异性引物和探针，建立了检测白纹伊蚊的荧光RPA方法，在39℃，20 min即可完成检测。对目的DNA的检测限为0.01ng/μL，3个平行的差异系数值均≤4.85%，显示了良好的重复性。本发明还用相同的引物，采用RPA Basic方法进行了检测，在33℃，25min可完成检测，并经测序、BLAST结果显示均为白纹伊蚊ITS2序列，进一步验证了荧光RPA方法的检测结果，并且与基于DNA条形码的方法检测结果一致。荧光RPA方法和RPA Basic的方法相比，省去了DNA纯化和凝胶电泳的繁琐步骤而更加简便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明引物筛选试验结果；
图2附图为本发明COI序列PCR结果；
其中，M：DL2000；1：BW14；2：BW30；3：BW31；4：BW32；5：BW40；
图3附图为本发明ABI 7500荧光RPA程序①检测结果；
其中，1：BW40；2：BW14；3：阳性对照；4：阴性对照；
图4附图为本发明ABI 7500 Fast 荧光RPA程序②试验结果；
其中，1：BW14；2：BW40；3：阴性对照；
图5附图为本发明ABI 7500 Fast 荧光RPA程序③试验结果；
其中，1：BW40；2：BW14；3：阴性对照；
图6附图为本发明白纹伊蚊RPA温度梯度扩增结果；
图7附图为本发明荧光RPA反应30℃扩增结果；
图8附图为本发明荧光RPA反应35℃扩增结果；
图9附图为本发明荧光RPA反应37℃扩增结果；
图10附图为本发明荧光RPA反应39℃扩增结果；
图11附图为本发明荧光RPA反应42℃扩增结果；
图12附图为本发明白纹伊蚊RPA Basic反应时间选择结果；
图13附图为本发明白纹伊蚊荧光RPA检测特异性试验结果；
其中，1：白纹伊蚊；2：背点伊蚊；3：埃及伊蚊；4：刺扰伊蚊；5：中华按蚊；6：三带喙库蚊；7：空白对照；
图14附图为本发明荧光RPA灵敏度试验结果10～10-3ng/μL；
其中，1：10 ng/μL；2：1 ng/μL；3：10-1 ng/μL；4：10-2 ng/μL；5：10-3 ng/μL；6：空白对照；
图15附图为本发明荧光RPA灵敏度试验结果1～10-4ng/μL；
其中，1：1ng/μL；2：10-1 ng/μL；3：10-2 ng/μL；4：10-3 ng/μL；5：10-4 ng/μL；6：空白对照；
图16附图为本发明白纹伊蚊重复性试验结果；
其中，1～3：1 ng/μL；4～6：10-1 ng/μL；7～9：10-2 ng/μL；10～12：10-3 ng/μL；13～15：10-4 ng/μL；16：空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
RPA荧光检测试剂盒：Twist AmpTM Exo Kits；RPA基础检测试剂盒：Twist AmpTMBasic Kits；PCR扩增试剂：Premix Taq™ (TaKaRa Taq™ Version 2.0 plus dye)。引物、探针均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成提供。
实施例1 引物筛选
选择白纹伊蚊特异性序列第二内转录间隔区ITS2为靶基因，用Oligo7软件设计3对引物：白纹1、白纹2、白纹3，见表1。
表1 白纹伊蚊候选引物
Figure DEST_PATH_IMAGE002
引物、探针均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成提供。
以白纹伊蚊DNA样本：BW14、BW30、BW31、BW32、BW40（5个重复）为模板，用白纹1、白纹2、白纹3引物对，用Twist AmpTM Basic Kits试剂盒进行扩增，按照Twist AmpTM BasicKits说明书配制体系，反应体系见表2。
表2 白纹伊蚊RPA basic反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
反应管颠倒混匀数次至管中试剂干粉完全溶解，瞬时离心，将管壁上溶液离下。然后在反应管管壁上加280mM醋酸镁溶液2.5μl，反应体系总体积50μl，反应管颠倒混匀，短时离心，立刻放入预热的PCR仪中，参照说明书设置反应程序为39℃ 20min。反应产物用天根普通DNA产物纯化试剂盒（DP204-03）进行纯化，然后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。扩增产物送测序，以验证试验结果。
试验同时以水作模板、以白纹3为引物，同时进行RPA扩增，作为阴性对照。以试剂盒自带阳性质控作阳性对照，阳性对照扩增长度约160bp。
RPA基础检测试剂盒扩增的同时，用普通PCR扩增试剂进行扩增，PCR扩增所用模板和引物与RPA相同，扩增体系和反应程序见表3、表4。
表3 白纹伊蚊ITS2序列PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表4 白纹伊蚊ITS2序列PCR反应程序
Figure DEST_PATH_IMAGE008
RPA Basic和PCR扩增结果见图1。图1结果显示，白纹1引物对目标基因片段大小为360bp，PCR扩增结果在360bp左右有较浅的扩增条带，而RPA Basic方法无目标大小条带；白纹2引物对目标基因片段大小为219bp，PCR和RPA基础检测方法均有目标大小条带，并且扩增条带单一且较亮；白纹3引物对扩增结果显示，虽有目标大小扩增条带，但RPA扩增产物浓度较白纹2较弱，引物二聚体较多。因此，选择白纹2引物组合。
RPA扩增产物送测序，测序结果均与白纹伊蚊内转录间隔区2（ITS2）序列一致，一致性均>98%。
用基于DNA条形码COI序列的方法验证RPA检测结果。用PCR方法扩增COI序列，扩增引物及反应体系、反应程序分别见表5、表6、表7。
表5 COI扩增引物
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表6 COI PCR扩增反应体系
试剂 浓度 使用量（1×）
Master Mix 12.5μL
RNase Free dH<sub>2</sub>O 9μL
COI-F 10μM 0.5μL
COI-R 10μM 0.5μL
模板 2.5μL
Total 25μL
表7 COI PCR扩增反应程序
Figure DEST_PATH_IMAGE012
COI序列PCR扩增结果见图2。图2结果显示，5个白纹伊蚊样本均有目标条带（约400bp），PCR产物经测序，然后与NCBI数据库进行Blast比对，结果均为白纹伊蚊COI序列，一致性均>99%。RPA方法蚊种鉴定结果与DNA条形码方法检测结果一致。
实施例2 荧光RPA反应条件
根据白纹2-F/R引物，设计白纹探针，白纹探针序列如下：
5’CCCGTGTGTGAGTTGTGCGGTGCGGTGTCG[FAM-dT]GG[THF]
A[BHQ1-dT]TAGGCGCGTGCGCG-3’-PHO。
探针设计是根据Twistamp-assay-design技术要求对3’端进行修饰，阻断探针的扩增。
荧光RPA反应体系见表8。
表8白纹伊蚊检测荧光RPA反应体系
试剂 浓度 使用量（1×）
Primer Free Rehydration buffer 29.5μl
RNase Free dH<sub>2</sub>O 11.2μl
白纹2-F 10μM 2.1μl
白纹2-R 10μM 2.1μl
白纹探针 10μM 0.6μl
Total 45.5μl
依次添加上述试剂至反应管中，混匀后，短时离心，分装至0.1mL荧光PCR反应管，每管18.2μl，然后添加模板（BW40或BW14）0.8μl/管，短暂离心，在管壁上加280mM 醋酸镁1μl，反应体系共20μl，混匀离心后，立即放入ABI 7500或者ABI 7500 Fast荧光PCR仪中进行扩增反应。
反应程序：
①ABI 7500，38℃ 10s，39℃ 35s（收集荧光），30个循环，约22min；
②ABI 7500 Fast，39℃ 30s（收集荧光），40个循环，共反应20min；
③ABI 7500 Fast，39℃ 15s，39℃ 35s（收集荧光），25个循环，约20.8min。
信号采集通道选择FAM，passive reference和quencher均选择“none”。同时，以水作阴性对照。结果如图3、4、5。
图3-图5结果显示，BW40、BW14两个样本采用上述3个反应程序均有显著扩增，说明引物、探针选择正确。由于仪器设置要求不同，ABI 7500无法运行程序：39℃ 30s（收集荧光），30个循环，因此分为2步，设置2个有少许差异的温度。图3显示，白纹伊蚊样本和阳性对照样品均有扩增曲线出现，但阴性对照也有较弱的扩增趋势；而ABI 7500 Fast检测结果（图4、图5）显示，阴性对照均无扩增趋势，程序③中BW14扩增荧光值明显低于BW40，而程序②没有该现象；因此，选择使用ABI 7500 Fast荧光PCR仪，选择反应程序39℃ 30s（收集荧光），40个循环（共20min）作为后续试验的反应程序。
实施例3 白纹伊蚊RPA反应温度选择
RPA Basic方法反应温度的选择：配制7管RPA basic反应体系，除了空白反应管外，其它反应管中各加入白纹伊蚊BW14的DNA 2µL，其它组分完全相同，设置PCR仪6个梯度的扩增反应温度为25℃、30℃、33℃、37℃、39℃、42℃，然后将配制好的反应管分别放在不同温度的PCR仪中反应20min，其中空白反应管放置于39℃ PCR仪内反应20min。扩增产物经纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。
图6结果显示，扩增温度在30~42℃范围内均可扩增出目的条带，当扩增温度为30℃时，扩增产物条带较弱，扩增温度为33~42℃时，扩增条带均较强，而且随着温度升高，扩增条带越亮，但扩增条带拖尾越严重，并有较弱的非特异性条带，因此选择白纹伊蚊RPABasic检测方法的扩增温度为33℃。
荧光RPA反应温度的选择：配制荧光RPA反应体系，反应温度为30℃、35℃、37℃、39℃、42℃。筛选结果如图7～11、表9。
表9 荧光RPA温度筛选试验结果
温度（℃） 30 35 37 39 42
Ct值 37.87 18.07 13.67 10.87 10.92
图7～11、表9结果显示，随着反应温度的升高，Ct值减小，但达到39℃、42℃时，没有明显差别，说明随着温度的升高，扩增效率提高，温度升至39℃以上后无明显变化，因此荧光RPA检测方法的反应温度选择为39℃。
实施例4 白纹伊蚊RPA Basic检测方法反应时间选择
配制8管RPA Basic反应体系，除了空白反应管外，各加入白纹伊蚊BW14的DNA 2µL，并加入白纹2引物对，混匀后立即放入33℃金属浴恒温器内，并开始计时，反应5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min后分别取出1管放至冰浴中，立即进行纯化，并进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图12所示。由图12可知，扩增10 min的产物已经满足琼脂糖凝胶的检测条件，随着扩增时间的延长，扩增产物的量增加，综合扩增量和特异性，选择25min为RPA Basic方法的最佳反应时间。
实施例5 特异性试验
分别以白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、背点伊蚊、三带喙库蚊、中华按蚊DNA为模板，用RPA Exo试剂盒进行荧光RPA检测。结果如图13所示，仅有白纹伊蚊有扩增曲线，其他蚊种和空白对照均没有扩增曲线，表明与埃及伊蚊、刺扰伊蚊、背点伊蚊、三带喙库蚊、中华按蚊DNA均无交叉反应，所建立的荧光RPA方法能对白纹伊蚊进行特异性检测。
实施例6 灵敏度试验
测定白纹伊蚊DNA样本浓度为32ng/μL，做适当稀释，稀释至10 ng/μL、1 ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3 ng/μL，进行荧光RPA检测，结果见图14、表10。
表10 灵敏度试验结果（10～10-3ng/μL）
浓度（ng/μL） 10 1 10<sup>-1</sup> 10<sup>-2</sup> 10<sup>-3</sup> 空白对照
Ct值 9.44 10.53 13.33 16.7 20.24 21.99
图14、表10结果显示，浓度稀释至10-3 ng/μL时仍有扩增曲线，因为未进行更低浓度检测，无法确定可检测到的最低浓度。补做灵敏度试验，浓度选择为1 ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3 ng/μL、10-4 ng/μL。结果如图15所示，本发明方法检测到的最低浓度为10-3ng/μL，与上述试验一致。
实施例7 重复性试验
选取1 ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3 ng/μL、10-4 ng/μL白纹伊蚊DNA为模板，每个浓度3个平行，进行重复性试验，结果如图16。浓度为1 ng/μL扩增曲线为1～3，浓度为10-1ng/μL的扩增曲线为4～6，浓度为10-2ng/μL的扩增曲线为7～9，浓度为10-3 ng/μL的扩增曲线为10～12，浓度为10-4 ng/μL的扩增曲线为13～15，可见相同的浓度的模板检测结果一致，在相同位置均可观察到相对应的荧光曲线，重复性良好。同时如表11，方法检出限0.01ng/μL以上浓度的重复性试验变异系数均小于5%，重复性良好。因此，把0.01ng/μL作为本发明方法的稳定的检出限。
表11 重复性试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
本发明设计了白纹伊蚊检测特异性引物和探针，建立了检测白纹伊蚊的荧光RPA方法，在39℃，20 min即可完成检测。对目的DNA的检测限为0.01ng/μL，3个平行的差异系数值均≤4.85%，显示了良好的重复性。本发明还用相同的引物，采用RPA Basic方法进行了检测，在33℃，25min可完成检测，并经测序、BLAST结果显示均为白纹伊蚊ITS2序列，进一步验证了荧光RPA方法的检测结果，并且与基于DNA条形码的方法检测结果一致。而且，荧光RPA方法和RPA Basic的方法相比，省去了DNA纯化和凝胶电泳的繁琐步骤而更加简便。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tacattcaac tatacgtgtg cctccctcga ccc 33
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gagcacactg agagttccag gtgactgttc c 31
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtcgtggttg atgagtacat cccaaaccgg agt 33
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gagcccactg agagttccag gtgactgttc c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cggtaaaaca ttcaagatag tcagacgcga cgg 33
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gagcccactg agagttccag gtgactgttc c 31
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cgagcttatt ttacgtctgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aacgtcgagg tattccggct 20

Claims (3)

1.一种利用荧光重组酶聚合酶扩增方法鉴定白纹伊蚊的组合物，其特征在于，所述组合物由引物和探针组成，所述引物序列如下：
上游引物：5’-GTCGTGGTTGATGAGTACATCCCAAACCGGAGT-3’，
下游引物：5’-GAGCCCACTGAGAGTTCCAGGTGACTGTTCC-3’；
所述探针序列如下：
5’-CCCGTGTGTGAGTTGTGCGGTGCGGTGTCG[FAM-dT]GG[THF]A[BHQ1-dT]TAGGCGCGTGCGCG-3’-PHO。
2.一种包含权利要求1所述的组合物的试剂盒。
3.一种基于重组酶聚合酶扩增技术鉴定白纹伊蚊的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）提取样品DNA；
（2）以样品DNA为模板，利用权利要求1所述的组合物进行荧光RPA扩增；在39℃条件下反应20min，通过收集荧光信号来进行检测结果判断。
CN202010327634.3A 2020-04-23 2020-04-23 一种利用荧光rpa鉴定白纹伊蚊的方法 Active CN111534603B (zh)

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