CN113862381B - 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法，属于生物检测领域。其中提供的检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物包括基于白纹伊蚊的COI基因序列设计的五条特异性LAMP引物，能够在20min内实现对白纹伊蚊的高灵敏度和高特异性检测。本发明还提供用于检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒和检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法。
背景技术
白纹伊蚊(Aedes albopictus)，属于双翅目蚊科，是一种攻击性很强的蚊子，刺叮凶猛异常，刺叮后皮肤奇痒、可引起皮肤红肿，局部皮炎，甚至全身性皮炎，抓破后易溃痒感染。除刺叮骚扰外，白纹伊蚊还可以传播很多病原体，包括登革病毒、罗斯河病毒、西尼罗病毒等。因此，防控白纹伊蚊的传播对防控以上多种病原体的传播至关重要，而在白纹伊蚊的防控中需要对白纹伊蚊进行鉴别检测。
目前，对白纹伊蚊的鉴别方法主要通过医学媒介生物的传统形态鉴定方法，其存在很多问题，例如受发育状态、肢体残缺不全的限制、近缘种等难以准确鉴定，以及输入性医学媒介生物由于缺少参考资料和参比标本也无法准确快速鉴定；另外还存在鉴定周期长、鉴定人员技术水平要求高、费时费力等缺陷。
专利文献CN111534603A(以下称文献1)公开一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，其基于荧光RPA检测的原理选择白纹伊蚊特异性序列第二内转录间隔区ITS2为靶基因设计了白纹伊蚊检测特异性引物和探针，相对于传统的形态鉴定方法可以不受白纹伊蚊的发育状态、肢体残缺不全、近缘种、缺少参考资料和参比标本等原因的限制，能够实现对白纹伊蚊目的DNA的检测限为0.01ng/μL，并且25min即可完成检测，表现出较佳的检测灵敏度和检测效率。然而，该文献1方法在检测白纹伊蚊的检测灵敏度方面仍存在不足。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物，其包括：
包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的正向内引物FIP，
包含如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的反向内引物BIP，
包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的正向外引物F3，
包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的反向外引物B3，和
包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向环引物LB。
本发明另一方面提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括上述的环介导等温扩增引物。
在一些实施方式中，上述试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+。
在一些实施方式中，上述试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix，其包含反应缓冲液、SYBR Green荧光染料、Bst4.0DNA/RNA聚合酶、dNTP和Mg2+。
本发明又一方面还提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)利用上述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；
3)根据步骤2)读取的扩增曲线进行结果判定：
若阳性对照出现扩增曲线且循环数Ct≤35，且阴性对照不出现扩增曲线或出现扩增曲线的循环数Ct>35，则证明试验结果有效；
若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线且循环数Ct≤35，则为阳性，表明在待测样品中含有白纹伊蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线或出现扩增曲线的循环数Ct>35，则为阴性，表明在待测样品中不含有白纹伊蚊。
在一些实施方式中，步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系包含：2×Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix 8-12μl，作为模板的待测样品DNA 1-3μl，正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度分别为15-17μM、反向环引物LB的浓度为3-5μM、正向外引物F3和反向外引物B3的浓度分别为1-3μM，ddH2O补充至体积为20μl。
在一些实施方式中，步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为57-66℃，反应时间为15-40min。
在一些实施方式中，步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为60-66℃，反应时间为18-20min。
基于以上技术方案提供的检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物基于白纹伊蚊基因组中的一段高保守性的COI基因序列设计得到，包括如SEQ ID NO：2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO：3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO：4所示的正向外引物F3，如SEQ IDNO：5所示的反向外引物B3和如SEQ ID NO：6所示的反向环引物LB。经实施例结果表明，基于本发明提供的检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物的检测方法和检测试剂盒能够高灵敏度(检测最低限为0.001ng/μL)、高特异性检测白纹伊蚊，并且具有检测周期短(可在20min内完成检测，检测效率高)、恒温检测、对设备要求低(不需要复杂仪器)、对鉴定检测人员水平要求低等特点，解决了现有技术中白纹伊蚊鉴定多依赖于形态学鉴定的问题，并且相对于上述文献1公开的利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法具有更高的检测灵敏度，可以满足更加严苛的检测环境。因此，本发明对大量生物样本或残缺生物样本(DNA浓度低)的白纹伊蚊物种鉴定具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中设计的3号引物组和5号引物组分别对白纹伊蚊DNA进行LAMP扩增的荧光曲线；
图2为不同反应温度条件下使用本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物对白纹伊蚊DNA进行LAMP扩增的荧光曲线；
图3为本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物对白纹伊蚊检测的特异性结果荧光曲线；
图4为本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物对白纹伊蚊检测的敏感性结果荧光曲线；
图5为本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物对39份蚊样本DNA的检测扩增荧光曲线。
具体实施方式
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，目前已经广泛应用于核酸检测，但还未有将该环介导等温扩增技术用于检测鉴别白纹伊蚊的报道。由于靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一，本发明人首先考虑上述文献1公开的白纹伊蚊特异性序列第二内转录间隔区ITS2作为靶基因设计用于LAMP检测的引物，但是未能获得可以更高灵敏度检测白纹伊蚊的LAMP引物组。发明人研究中发现，COI基因在不同种类蚊之间存在较大的序列差异性，因此发明人转为以白纹伊蚊的COI基因作为靶基因设计用于检测白纹伊蚊的LAMP引物组，最终筛选获得一组可以用于更高灵敏度检测白纹伊蚊的LAMP引物，并基于该LAMP引物组提供了用于检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒和方法。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例，各序号的实施例有助于阅读，其能各自独立实施以及相互关联实施而构成对本发明内容的有力支持。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例中涉及的序列均可以通过现有技术合成。
实施例1：用于检测白纹伊蚊的LAMP引物的设计
在该实施例中，发明人利用白纹伊蚊的COI基因序列(序列表中SEQ ID NO：1所示)在NCBI中进行Blast，发现该基因序列在白纹伊蚊种内高度保守，而在其它种类蚊之间存在可变性，因此发明人认为白纹伊蚊的COI基因可以作为白纹伊蚊检测的候选靶标基因。以白纹伊蚊的COI基因作为靶基因，使用在线LAMP引物设计软件primerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计用于检测白纹伊蚊的LAMP引物，共设计获得多组LAMP引物组合，下表1中仅列出了其中的两组(3号引物组和5号引物组)。
表1：用于检测白纹伊蚊的LAMP引物组
分别使用上表1中的两组LAMP引物(3号引物组和5号引物组)对从白纹伊蚊样品中提取的DNA(例如利用市售的DNA提取试剂盒按照说明书操作提取)进行LAMP扩增，以从中选择确定最佳的LAMP引物组合。其中可以在0.2ml EP反应管中加入用于LAMP扩增检测的20μl反应体系，其包括下表2所示的试剂。反应体系配好后，置于荧光定量PCR仪中于65℃进行反应20min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
表2：用于LAMP扩增检测的20μl反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 2×Bst4.0SYBR Green IsoAmp MasterMix(产品编号A3824-03) | 10μl |
| 10×LAMP Primer Mix | 2μl |
| 模板DNA/RNA | 2μl |
| ddH2O到总体积 | 20μl |
注：10×LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP分别为16μM、LB为4μM、F3/B3分别为2μM。
结果如图1所示，示出了3号引物组和5号引物组分别对白纹伊蚊DNA的荧光扩增曲线，可见相对于3号引物组，5号引物组在5个循环后(即反应5min后)即开始出现扩增曲线，进行反应6min后，即可获得相对强度较高的荧光信号；而3号引物组虽然也出现扩增曲线，但是其荧光信号强度很低。因此，本发明确定上表1中所示的5号引物组作为检测白纹伊蚊的LAMP引物。
实施例2：检测白纹伊蚊的LAMP反应温度的选择
该实施例利用上述实施例1确定的5号引物组在不同的反应温度条件下对白纹伊蚊DNA进行检测，以筛选确定本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物的最佳反应温度，其中20μl反应体系如上表2所示，反应条件中温度梯度设置为：71℃，70.2℃，68.7℃，65.9℃，62.5℃，59.8℃，57℃，反应时间为20min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
检测结果如图2所示，可见当反应温度在57-66℃，优选60-66℃，进一步优选为62.5℃时，均可以在20min内(甚至在15min内，进一步可以在10min内)完成对白纹伊蚊的检测，并均具有较高的荧光信号强度；而当温度超过66℃(71℃，70.2℃，68.7℃)时，虽然也可能检测到白纹伊蚊，但是其荧光信号强度很低。因此，本发明确定当使用上述实施例1确定的5号引物组对白纹伊蚊进行检测时，设定反应温度可以为57-66℃，优选60-66℃，进一步优选为62.5℃，反应时间可以为15-40min，可选为18-20min。
实施例3：检测白纹伊蚊的LAMP引物的特异性
该实施例利用上述实施例1确定的5号引物组对6株白纹伊蚊和另外4株其它蚊种(尖音库蚊、三带喙库蚊、骚扰伊蚊、中华按蚊)的DNA作为模板进行检测，以评价本发明提供的检测白纹伊蚊的LAMP引物及检测方法的特异性。其中20μl反应体系如上表2所示，反应条件为：反应温度62.5℃，反应时间20min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
结果如图3所示，可见所有6株白纹伊蚊的检测结果均出现扩增曲线，而另外4株其它蚊种(尖音库蚊、三带喙库蚊、骚扰伊蚊、中华按蚊)的检测结果均没有出现扩增曲线，表明本发明提供的用于检测白纹伊蚊的LAMP引物及检测方法具有良好的特异性。
实施例4：检测白纹伊蚊的LAMP引物的敏感性
该实施例利用上述实施例1确定的5号引物组对不同浓度的白纹伊蚊DNA进行检测，以评价本发明提供的用于检测白纹伊蚊的LAMP引物及检测方法的敏感性。其中不同浓度的白纹伊蚊DNA的制备方法为：将提取的白纹伊蚊的DNA用超微量核酸检测仪测定浓度(100ng/μl)，后用ddH2O进行10倍梯度稀释，得到系列浓度的白纹伊蚊DNA作为模板：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl。20μl反应体系如上表2所示，反应条件为：反应温度62.5℃，反应时间20min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
检测结果如图4所示，可见本发明提供的用于检测白纹伊蚊的LAMP引物及检测方法对白纹伊蚊DNA检测的最低限可以达到1pg/μl，即0.001ng/μl，比上述文献1提供的检测方法的检出限(0.01ng/μl)低一个数量级，表现出更加优异的检测灵敏度，可以适应于更加严苛的检测环境和检测要求(例如样品量有限)。
实施例5：用于检测白纹伊蚊的LAMP试剂盒
该实施例提供了用于检测白纹伊蚊的LAMP试剂盒，其包括上述实施例1确定的用于检测白纹伊蚊的LAMP引物组(5号引物组)，还可以包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+，具体可以为Bst4.0SYBRGreen IsoAmp MasterMix(可以商购获得，例如产品编号为A3824-03的Bst4.0 SYBR GreenIsoAmp MasterMix)。
为了方便使用该实施例提供的试剂盒，在试剂盒中还可包括用于检测白纹伊蚊的环介导等温扩增方法，其可以包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)利用该实施例提供的试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；
3)根据步骤2)读取的扩增曲线结果进行判定：
若阳性对照出现扩增曲线(例如典型的“S”型扩增曲线)，且阴性对照不出现扩增曲线，则证明试验结果有效；
若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线(优选循环数Ct≤35，进一步优选循环数Ct≤20)，则为阳性，表明在待测样品中含有白纹伊蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线，或者出现扩增曲线的循环数Ct>35，则为阴性，表明在待测样品中不含有白纹伊蚊。
其中在步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系可以包含：2xBst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix 8-12μl，作为模板的待测样品DNA 1-3μl，正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度分别为15-17μM、反向环引物LB的浓度为3-5μM、正向外引物F3和反向外引物B3的浓度分别为1-3μM，ddH2O补充至体积为20μl。
其中步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件可以为：反应温度为57-66℃，优选为60-66℃，反应时间为15-40min，为了适应低浓度的待测样品的DNA，反应时间可选为18-20min。
实施例6：白纹伊蚊的临床样本检测
该实施例中利用上述实施例5提供的试剂盒按照试剂盒中提供的检测方法步骤对野外采集的39份蚊样本进行检测。首先使用传统形态鉴定方法对39份蚊样本(待测样品)进行鉴定，其中11份蚊样本为白纹伊蚊，6份蚊样本为中华按蚊，3份蚊样本为尖音库蚊，18份蚊样本为三带喙库蚊，1份蚊样本为刺扰伊蚊。在用上述实施例5提供的试剂盒对39份蚊样本提取的DNA和阴性对照进行检测时，20μl反应体系如上表2所示，反应条件为：反应温度62.5℃，反应时间20min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
检测结果如图5所示，在检测的39份蚊样本中，所有11份白纹伊蚊样本的检测结果均出现扩增曲线，而其他28份蚊样本(6份蚊样本为中华按蚊，3份蚊样本为尖音库蚊，18份蚊样本为三带喙库蚊，1份蚊样本为刺扰伊蚊)的检测结果均未出现扩增曲线，表明本发明提供的试剂盒和方法能够临床用于检测白纹伊蚊。并且本发明提供的检测方法检测周期短(可以在20min内获得结果)、特异性强，灵敏度高(检测最低限可达到0.001ng/μl)，不需要复杂仪器。因此，本发明对于大量样本或残缺生物样本(待测样品DNA浓度低)的白纹伊蚊物种鉴定具有重要的应用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心
<120> 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 682
<212> DNA
<213> 白纹伊蚊(COIAedes albopictus)
<400> 1
aagatattgg aacattatac tttattttcg gtatttgatc tggaatagtc ggaacttcac 60
taagagtttt aattcgtatt gaacttagac atcctggtat atttattgga aatgatcaaa 120
tttataatgt aattgttact gctcatgctt ttattataat tttttttata gtaataccta 180
tcataattgg aggatttgga aactgactag tacccttaat actaggagcc cctgatatag 240
cttttcctcg aataaataat ataagttttt gaatattacc cccctcttta acactgctgc 300
tttctagttc tatagtagaa aacggagctg gaacagggtg aacggtttat cctcctcttt 360
cttctggaac agctcatgct ggggcttcag ttgatttagc aattttttct ttacatttag 420
cgggaatctc atctatttta ggagcagtaa attttattac aactgtaatt aatatacgat 480
cagctggtat tactcttgat cgactacctt tatttgtgtg atcagtagta attacagcta 540
ttttattact tctttctcta cccgtattag ccggagctat tactatatta ttaacagacc 600
gaaatttaaa tacatctttt tttgatccaa ttggaggggg agaccctatt ttatatcaac 660
atttattttg attttttggt cc 682
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccagctccg ttttctacta tagaattttt ttttgaatat tacccccctc t 51
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagggtgaa cggtttatcc ttttttaaat caactgaagc cccag 45
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgatatag cttttcctcg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatagatgag attcccgcta a 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctctttctt ctggaacagc tcat 24
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaggggggt aatattcaaa aacttttttt taatactagg agcccctgat 50
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acactgctgc tttctagttc tatagtttta gaggaggata aaccgttca 49
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatttggaaa ctgactagta cc 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catgagctgt tccagaaga 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tagaaaacgg agctggaaca gg 22
Claims (8)
1.一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物，其为：
如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的正向内引物FIP，
如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的反向内引物BIP，
如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的正向外引物F3，
如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的反向外引物B3，和
如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向环引物LB。
2.一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括权利要求1所述的环介导等温扩增引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix，其包含反应缓冲液、SYBR Green荧光染料、Bst4.0DNA/RNA聚合酶、dNTP和Mg2+。
5.一种非疾病诊断目的的检测白纹伊蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)利用权利要求2-4中任一项所述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；
3)根据步骤2)读取的扩增曲线进行结果判定：
若阳性对照出现扩增曲线且循环数Ct≤35，且阴性对照不出现扩增曲线或出现扩增曲线的循环数Ct>35，则证明试验结果有效；
若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线且循环数Ct≤35，则为阳性，表明在待测样品中含有白纹伊蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线或出现扩增曲线的循环数Ct>35，则为阴性，表明在待测样品中不含有白纹伊蚊。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系包含：2×Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix 8-12μl，作为模板的待测样品DNA 1-3μl，正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度分别为15-17μM、反向环引物LB的浓度为3-5μM、正向外引物F3和反向外引物B3的浓度分别为1-3μM，ddH2O补充至体积为20μl。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为57-66℃，反应时间为15-40min。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为60-66℃，反应时间为18-20min。
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