CN115803456A - 利用特定人工核苷酸序列的假阳性判断用组合物及利用其的假阳性判断方法 - Google Patents

Abstract

本发明为用于在聚合酶链式反应(PCR)过程中判断阳性对照组试样是否污染检查对象组试样的方法。向阳性对照组插入靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列，并设计与靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的假阳性判断用探针。根据本发明，确认检查对象组中是否存在特定人工核苷酸序列，由此可简单准确地判断假阳性与否。

Description

利用特定人工核苷酸序列的假阳性判断用组合物及利用其的 假阳性判断方法

技术领域

本发明涉及利用特定人工核苷酸序列的假阳性判断用组合物及利用其的假阳性判断方法，向阳性对照组核苷酸序列插入靶核苷酸及特定人工核苷酸序列，并设计与靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的探针，由此，能够以高准确度及特异度判断检查对象组被阳性对照组污染而表现出的假阳性。

背景技术

分子诊断为检测或分析包含DNA、RNA的生物指标物质的领域，从利用1985年由Cetus Corporation(Chiron)的Mullis研发的作为在试验管中扩增核酸的技术的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)开始，使包括人在内的感染菌基因组图谱的完成等的基因分析变得容易，分子诊断领域得以飞跃性发展。在分子水平上实现准确诊断的各种分子诊断检查技术的发展能够实现迅速、准确的诊断和诊断设备的小型化，从而提供个性化诊断和治疗的基础。

尤其，能够定性及定量分析靶DNA或RNA的实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)还称为定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)，是基因分析技术中可强且高灵敏度地进行分析的方法。尤其，实时聚合酶链式反应在分子诊断中已经成为黄金标准(Golden Standard)，可用于基因表达的定量分析或基因型分析、SNP分析、病原体(Pathogen)检测、新药研发过程的评价、RNAi的测定等各种领域。

在现有的聚合酶链式反应(conventional PCR)的情况下，分开进行分子试样的复制及扩增过程和相应分子试样的定性分析过程，但实时聚合酶链式反应如其名，具有如下的优点：在进行复制及扩增过程的同时可实时进行定量分析。

然而，PCR为灵敏且快速的检查方法之一，但因这种敏感度，经常发生假阳性的问题。作为这种假阳性的原因，最主要的问题在于之前扩增的聚合酶链式反应扩增产物引起的污染或样品中的遗传物质的提取及纯化等的过程中产生的交叉污染以及进行诊断实验时必须一同进行的阳性对照组引起的交叉污染。阳性对照组以为了确保诊断结果的可靠性而验证用于诊断实验的PCR的整体组合物(PCR反应混合物(Master Mix)、引物(Primers)、双探针染料(Dual probed Dye)等)是否执行正常功能的目的和检查对象组一同执行。在阳性对照组中，通常添加103copies以上的包含所合成的靶核苷酸序列的低聚物或质粒，并在每个实验均示出阳性结果。

实际上，当进行聚合酶链式反应时，检查对象组可因实验人员的失误或通过之前实验中被污染的实验器具或实验室空气等被添加至阳性对照组的包含所合成的靶核苷酸序列的低聚物或质粒(以下，阳性对照组是指包含所合成的靶核苷酸序列的低聚物或质粒)污染，在检查对象组中不存在靶核苷酸序列的情况下，表现出阳性等假阳性的问题很大。

本发明人在研究确认检查对象组的污染引起的假阳性与否的方法的过程中，为了判断假阳性，将包含添加至阳性对照组的所合成的靶核苷酸序列的低聚物或质粒以向“靶核苷酸序列”内插入“特定人工核苷酸序列”的设计制备，确认可利用能够与“靶核苷酸序列”的一部分及“特定人工核苷酸序列”的一部分同时结合的探针以高准确度及特异度进行假阳性判断，从而完成了本发明。

利用可与上述“靶核苷酸序列”的一部分及“特定人工核苷酸序列”同时结合的探针可根据各诊断目的特异性地判断假阳性，从而防止被判断为并不特异的假阳性判断方法引起的其他假阳性。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供如下的方法：判断进行阳性对照组及检查对象组的聚合酶链式反应时可能示出的阳性对照组引起的检查对象组的交叉污染与否，由此，快速且准确地判断检查结果是否为假阳性。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供假阳性判断用组合物，包含：阳性对照组，包含靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列；第一探针，与上述靶核苷酸的序列结合；以及第二探针，与上述靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合。

根据本发明的一实施例，当判断假阳性时，可利用对于上述靶核苷酸序列特异性的引物集。尤其，当制备阳性对照组时，在向靶核苷酸序列的内部插入特定人工核苷酸的情况下，无需单独使用用于检测特定人工核苷酸的引物。

在本发明中，上述“探针”包含第一探针及第二探针，可包含更多的探针。本发明的探针可使用本发明所属技术领域的普通技术人员通常使用的探针。根据本发明的优选一实施例，上述第一探针结合的靶核苷酸的序列可以与上述第二探针结合的靶核苷酸的序列的一部分互补。

根据本发明的一实施例，上述阳性对照组的特定人工核苷酸序列可插入于靶核苷酸序列的内部。或者，可独立于靶核苷酸序列来设置。如前所述，在特定人工核苷酸序列插入于靶核苷酸序列的内部的情况下，可减少引物的使用。

在本发明中，上述阳性对照组由核苷酸组成，可使用单链或双链的基因，其种类不受限，但优选为质粒或寡核苷酸。

上述特定人工核苷酸的序列可具有3mer～50mer、3mer～30mer、31mer～50mer、20mer～40mer或5mer～20mer的长度，优选地，具有15mer～35mer的长度。

与靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的探针(第二探针)可与特定人工核苷酸序列的一半左右的长度结合。

在一实施例中，与上述第二探针结合的特定人工核苷酸的一部分序列的长度为5mer～30mer、5mer～25mer、5mer～23mer或10mer～20mer，或优选为5mer～20mer。

根据本发明的再一实施例，当在一个实验中所要检测出的靶核苷酸序列为多个时，设计与特定人工核苷酸及一个靶核苷酸结合的第二探针，由此，还可根据靶核苷酸选择性地判断假阳性。

本发明还提供假阳性判断方法，包括：步骤a，制备包含靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的阳性对照组的试样；步骤b，从样品获得基因组后，制备为检查对象组试样；步骤c，向上述阳性对照组及检查对象组试样分别添加(i)与靶核苷酸的序列结合的第一探针、(ii)与上述靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的第二探针及(iii)引物集；步骤d，上述步骤c之后，使阳性对照组及检查对象组试样分别进行聚合酶链式反应；以及步骤e，进行聚合酶链式反应的结果，当在检查对象组中仅示出与第一探针相应的信号时，判断为真阳性。

根据本发明的一实施例，上述假阳性判断方法还可包括如下的步骤：当在上述检查对象组试样示出与第一探针及第二探针分别相应的信号时，判断为假阳性，当未示出与第一探针及第二探针相应的信号时，判断为阴性。

在本发明的假阳性判断方法中，可利用上述假阳性判断用组合物。

根据另一实施例，靶核苷酸及特定人工核苷酸可存在于互不相同的质粒或寡核苷酸中。

发明的效果

根据本发明具有如下的优点：能够以高特异度容易且快速地掌握是否被阳性对照组污染，在检查对照组PCR中不使用用于确认假阳性的单独的引物，由此，不影响检查对照组PCR反应性，并可确认假阳性。

并且，本发明具有如下的优点：使用与特定人工核苷酸序列及靶核苷酸序列同时结合的探针，由此，可对于靶序列的诊断特异性地判断假阳性。

尤其，本发明具有如下的优点：在将一个以上的核苷酸作为靶核苷酸来进行PCR的情况下，特定第二探针能够结合的靶核苷酸序列，由此，可与其他靶核苷酸区分来掌握是否存在相应靶核苷酸序列、是否被阳性对照组污染。

根据本发明，特定人工核苷酸的序列具有3mer～50mer、3mer～30mer、31mer～50mer、20mer～40mer或5mer～20mer的长度，优选地，具有15mer～35mer的长度，可解决随着序列变长而产生的非特异性检测问题，使用与靶核苷酸及特定人工核苷酸同时结合的第二探针，由此，可提高假阳性判断的特异性。

根据本发明的一实施例，向靶核苷酸序列的中间插入特定人工核苷酸，即使没有针对特定人工核苷酸的单独的引物，也可识别特定人工核苷酸，并可防止引物的过度使用，从而可去除因引物之间的二聚体形成等而产生的噪声。

本发明提供与特定人工核苷酸及靶核苷酸的序列同时结合的探针，由此可提高假阳性判断的准确度。

本发明还具有如下的优点：利用与特定人工核苷酸及靶核苷酸结合的第二探针，由此，可仅特异性地检测包含靶核苷酸的阳性对照组引起的污染。

附图说明

图1为示出根据特定人工核苷酸的存在与否的探针结合与否的PCR示意图。

图2为互不相同的靶核苷酸序列存在多个的阳性对照组的PCR示意图。

图3为根据特定人工核苷酸的存在与否确认阳性判断与否的图片。

图4示出根据本发明的一实验例制备的阳性对照组、探针、靶核苷酸及引物的基因序列。

图5为示出根据本发明的一实施例制备的模板A和第二S探针及第二O探针各自的结合关系的示意图。

图6为示出根据本发明的一实施例制备的模板B和第二S探针及第二O探针各自的结合关系的示意图。

图7为根据本发明的一实施例，当将S基因作为靶核苷酸时，使用与S基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列结合的第二探针(第二S探针)确认包含S基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的阳性对照组(模板A)引起的污染的结果。参照图7，表达(发光)了对于阳性对照组(模板A)具有高特异度的第二S探针，可利用第二S探针检测阳性对照组(模板A)引起的污染。

图8为根据本发明的一实施例，当将S基因作为靶核苷酸时，使用与S基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列结合的第二探针(第二S探针)确认是否被不包含S基因的核苷酸序列的基因(模板B)污染的检测的结果。参照图8，仅对于相应实验的阳性对照组(模板A)具有高特异度的第二S探针对于模板B引起的污染不表达(发光)，由此可确认未检测到不是阳性对照组的基因(模板B)引起的污染。

图9为根据本发明的一实施例，当将ORF1ab基因作为靶核苷酸时，使用与ORF1ab基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列结合的第二探针(第二O探针)确认包含ORF1ab基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的阳性对照组(模板B)引起的污染的结果。根据图9的对于阳性对照组(模板B)具有高特异度的第二O探针表达(发光)，可确认能够检测出阳性对照组(模板B)引起的污染。

图10为根据本发明的一实施例，当将ORF1ab基因作为靶核苷酸时，使用与ORF1ab基因的核苷酸序列及特定人工核苷酸序列结合的第二探针(第二O探针)确认不包含ORF1ab基因的核苷酸序列的基因(模板A)引起的污染的结果。参照图10，仅对于相应实验的阳性对照组(模板B)具有高特异度的第二O探针对于模板A引起的污染也不表达(发光)，由此可确认并不是阳性对照组的基因(模板A)引起的污染未被检测出。

图11为示出在如以往的发明不需要假阳性判断探针和靶核苷酸的结合的情况下，具有相同序列的一种类的假阳性判断探针依赖特定人工核苷酸的存在与否来表达(发光)，因此，当判断阳性对照组引起的假阳性时，可产生并不使需要的其他基因序列引起的判断错误的示意图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明的优选实施例。参照后述的实施例，将可明确本发明的优点、特征以及实现上述优点、特征的方法。但是，本发明并不限定于以下所公开的实施例，可由互不相同的各种形式实现，本实施例仅使本发明的公开更加完整，并为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地告知发明的范畴而提供，本发明仅被发明要求保护范围的范畴定义。在说明书全文中，相同的附图标记指代相同的结构要素。

除非另行定义，在本说明书中使用的所有术语(包括技术术语及科学术语)能够以本发明所属技术领域的普通技术人员共同理解的含义使用。并且，除非明确定义，由通常使用的词典定义的术语不应异常解释或过度解释。在本说明书中使用的术语用于说明实施例，并不限定本发明。在本说明书中，除非在语句中特别提及，否则单数型还包括复数型。

在本说明书中，“聚合酶链式反应”还称为Polymerase Chain Reaction，是利用耐热性DNA聚合酶分析特定基因或者将基因扩增为可操作(Genetic Engineering)的水平的方法。通常是指如下的过程：聚合酶链式反应通过温度循环(cycling)，具有与扩增部位的两个末端相对应的碱基序列的引物重复与扩增对象DNA结合、聚合、脱落的过程，同时，以几何级合成特定部位的DNA。

在本说明书中，“实时聚合酶链式反应”还称为实时PCR(Real-Time PCR)，是实时监测聚合酶链式反应扩增产物的解释方法，可进行通过以往的聚合酶链式反应法难以测定的准确定量。实时聚合酶链式反应不仅用于如核苷酸表达解释的定量分析，还能够以各种方式用于如病原菌感染诊断的定性分析。实时聚合酶链式反应利用荧光检测出PCR扩增产物的量。

利用双标记探针(Dual-Labeled Probe)的实时聚合酶链式反应可使用用于PCR扩增的一对引物(即，正向寡核苷酸引物及反向寡核苷酸引物)，可将双标记探针用作检测探针。上述检测探针为在正向引物结合部位与反向引物结合部位之间的某处与靶模板DNA的正义引物或反义引物链杂化(hybridization)的单链寡核苷酸。在退火步骤中，寡核苷酸检测探针通过单链模板退火。随着扩增的发生，探针通过DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性被切割并分解。因此，随着特异性模板序列的扩增的发生，检测探针以几何级量被分解。实时PCR的检测探针通常由报道分子(称为报道分子荧光染料或荧光物质(reporter))及消光剂(还称为淬火剂(quencher))构成。通常，荧光团附着于寡核苷酸的5'端部或其附近，消光剂附着于寡核苷酸的3'端部或其附近。例如，在双标记探针的5'末端结合报道分子，在3'末端结合用于吸收荧光的消光剂，若发生退火，则吸收由消光剂表达的荧光，但在接着的延伸(Extension)过程中，因Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶的作用，附着在5'的荧光团从检测探针脱落而表达荧光。若测定该荧光亮，则可测定靶核苷酸的扩增量。即，若发生更多的靶核苷酸的扩增，则更多的寡核苷酸检测探针被切割，由此释放更多的荧光团及消光剂，最终分离荧光团/消光剂对，使得荧光性释放振幅增加。由此，可知特定探针与互补碱基序列结合，并可知存在相应碱基序列。

在本发明中，用作消光剂(Quencher)的物质大多使用Black Hole Quencher(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、Blackberry Quencher(BBQ650)、Dabcyl and Eclipes quencher等，但并不限定于此，可通过FRET抑制荧光体的荧光的所有物质均可适用。并且，可使用表达400nm～800nm之间的荧光的荧光体(fluorophore)作为上述报道分子，主要利用FAM、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、CAL Fluor560、CAL Flour610、ATTO565NHS-ester、ROX NHS-ester、TexasRed NHS-ester及Yakima Yellow等的荧光体，但并不限定于此。

在本说明书中，“寡核苷酸”是指通常在实验室中，为了生物学及基因组学、生物化学、分子生物学研究或实际基因检查而合成的短链DNA或RNA分子。

在本说明书中，“质粒”是指在细菌的细胞内复制而能够独自增殖的除染色体以外的DNA分子。

在本说明书中，“靶核苷酸序列”是指所要检测的核苷酸序列，“特定人工核苷酸序列”是指任意特定的核苷酸序列。在本说明书中，特定人工核苷酸序列具有与靶核苷酸序列不同的基因序列。

在本说明书中，“检查对象组”是指为了确认所要检测的靶核苷酸序列是否存在，从样品获得的基因，“阳性对照组”是指存在上述“靶核苷酸序列”的所合成的基因。

在本说明书中，“阳性”是指在检查对象组中存在靶核苷酸序列，“假阳性”是指即使不存在靶核苷酸序列，也判断为阳性。

在本说明书中，“污染”是指“阳性对照组”的核苷酸序列通过空气或实验人员或实验工具等流入至“检查对象组”。在此情况下，实时聚合酶链式反应结果，示出在“检查对象组”中不存在靶核苷酸序列的情况下，也存在靶核苷酸序列，将其称为“假阳性”。

在本说明书中，当表达基因序列的位置时，“独立”是指基因序列并未混合(序列之间插入)，以保持固有的基因序列的状态存在。

以下，通过实施例具体说明本发明。

实施例1.利用包含特定人工核苷酸序列及靶核苷酸序列的阳性对照组、与靶核苷 酸结合的基因序列与第一探针部分互补的第二探针判断假阳性

根据本发明的一实施例，假阳性判断用组合物可包含：阳性对照组，包含靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列；第一探针，与上述靶核苷酸序列的特异性部位结合；以及第二探针，与上述靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸序列同时结合，还可包含对于靶核苷酸序列特异性的引物集。

此时，阳性对照组可由双链或单链构成，优选地，可以为寡核苷酸或质粒形式。

上述阳性对照组的“特定人工核苷酸序列”可插入于“靶核苷酸序列”的内部或独立存在。

与上述靶核苷酸序列的特异性部位结合的第一探针及与上述靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列结合的第二探针各自结合的靶核苷酸序列可以为部分相互互补的序列。

实施例1的示意图如图1。参照图1，在向靶核苷酸序列的内部插入特定人工核苷酸序列的情况下，本发明的第二探针可与靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列同时结合。在存在靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的情况下，上述第二探针可与模板链结合。相反，当在模板链中不存在特定人工核苷酸序列时，第二探针不能与模板链结合。

图2为将靶核苷酸序列为多个的阳性对照组的质粒构成模式化的图。参照图2，可向靶核苷酸A序列的内部插入特定人工核苷酸序列。在靶核苷酸为多个的情况下，可使用能够与各核苷酸结合的引物和探针，此时，特定人工核苷酸插入于靶核苷酸A的序列内部，因此，即使没有单独的引物，也可进行反应来识别特定人工核苷酸。

实施例2.利用包含阳性对照组中的特定人工核苷酸序列及靶核苷酸序列的阳性 对照组、与靶核苷酸结合的基因序列与第一探针不同的第二探针判断假阳性

整体结构与上述例示1相同，但上述第二探针结合的靶核苷酸的序列不与第一探针重叠，其可不同。

实验例1

1-1.制备包含特定人工核苷酸的阳性对照组

为了确认是否根据特定人工核苷酸的存在与否的判断假阳性，插入质粒中的靶核苷酸A、靶核苷酸B、靶核苷酸C及靶核苷酸D(内部对照组核苷酸)。此时，在靶核苷酸A序列的中间插入特定人工核苷酸。

1-2.制备不包含特定人工核苷酸的阳性对照组

未向质粒内插入特定人工核苷酸，除此之外，以与实验例1-1相同的条件制备阳性对照组。

在实验例1-1及实验例1-2中使用的基因序列如下述表1，制备时使用的试样的比例如下述表2。

表1

表2

试样	体积(ul)	最终浓度
			2X RT-qPCR Master Mix	10	1X
靶核苷酸A正向引物(20uM)	0.25	0.5uM
			靶核苷酸A反向引物(20uM)	0.25	0.5uM
靶核苷酸A探针(5uM)	0.25	0.125uM
			靶核苷酸C基因正向引物(20uM)	0.25	0.5uM
靶核苷酸C反向引物(20uM)	0.25	0.5uM
			靶核苷酸C探针(5uM)	0.25	0.125uM
靶核苷酸B正向引物(20uM)	0.25	0.5uM
			靶核苷酸B反向引物(20uM)	0.25	0.5uM
靶核苷酸B探针(5uM)	0.25	0.125uM
			内部对照组核苷酸正向引物(20uM)	0.25	0.5uM
内部对照组核苷酸反向引物(20uM)	0.25	0.5uM
			内部对照组核苷酸探针(5uM)	0.25	0.125uM
特定人工核苷酸探针(5uM)	0.25	0.125uM
			蒸馏水	1.75	-
模板	5	-
			总体积	20	-

根据上述实验例1-1及实验例1-2制备的阳性对照组由下述表3的条件进行PCR。

表3

上述PCR的结果如图3。参照图3，可知实验例1-1及实验例1-2的质粒包含靶核苷酸A、靶核苷酸B、靶核苷酸C、靶核苷酸D(内部对照组)。但是，可知与特定人工核苷酸表达的实验例1-1的阳性对照组不同地，实验例1-2的阳性对照组不表达特定人工核苷酸。由此，可根据特定人工核苷酸的存在与否确认样品是否被阳性对照组污染。

实验例2

在通过并不所需的其他基因(例如，不包含靶核苷酸序列的基因)表达(发光)假阳性判断用探针(第二探针)的情况下，无法明确判断是否被阳性对照组污染。

例如，在靶核苷酸序列为S的情况下，使用模板A(特定人工核苷酸序列插入于序列S)作为阳性对照组，可使用第一探针(与靶核苷酸结合)及第二探针(仅与特定人工核苷酸序列结合)作为探针。但是，在之前实验中，在将模板B(特定人工核苷酸序列插入于orf1ab基因序列)用作阳性对照组、同样使用第二探针的情况下，当被模板B污染时，也示出通过第二探针的表达(发光)，由此，具有无法确认是否是之前实验(模板B)引起的污染或当前实验中的阳性对照组(模板A)引起的假阳性的问题。

相反，本发明的特征在于，与特定人工核苷酸结合的第二探针还可与靶基因的一部分序列结合。在本发明中，第二探针需要与相应实验中的靶核苷酸结合，第二探针不与在相应实验中没有靶核苷酸序列的基因结合，由此仅可选择性地判断当前实验中的阳性对照组引起的假阳性，因此，判断假阳性的准确率高。

2-1.制备寡核苷酸

以本实验的PCR为对象准备模板基因A、B。模板A包含S基因的序列及特定人工核苷酸的序列，S基因的序列包含由S(F)、S(R)、S probe(FAM)表示的基因的序列。在本实验中，模板A的特定人工核苷酸的序列为ACGAGACCTACTG，模板B的特定人工核苷酸序列为ACGAGACCTACTGGT。

模板B包含Orf1ab基因的序列及特定人工核苷酸的序列，Orf1ab基因的序列包含由Orf1ab(F)、orf1ab(R)、orf1ab-probe(HEX)表示的基因的序列。

在实验例2中使用的第二探针为包含S基因的一部分序列的第二S探针、包含Orf1ab基因的一部分序列的第二O探针。

本实验中中使用的基因序列制备得如图4。

2-2.在靶核苷酸为S基因的情况下，判断假阳性

2-2-1.当被阳性对照组(模板A)污染时，利用第二S探针判断假阳性

在使用模板A(包含靶核苷酸序列S及特定人工核苷酸序列)作为阳性对照组(positive control)的情况下，可利用与S基因的一部分序列结合的第二探针(第二S探针)确认是否被阳性对照组污染。

在实验例2-2-1中，当被模板A(阳性对照组)污染时，确认是否表达(发光)第二探针(第二S探针)。将根据上述实施例2-2制备的模板A及第二S探针以如下述表4的条件混合后，对于所混合的试样，以如下述表5的顺序进行PCR。

表4

表5

实验2-2-1的结果如图7。参照图7，用于本实验的第二探针为与S基因(靶核苷酸序列)的一部分结合的第二S探针，因此，第一探针、第二探针引起的两个峰(peak)均被检测出。由此，可知存在靶核苷酸(S基因)(第一探针引起的峰)，且为阳性对照组引起的假阳性(第二探针引起的峰)。

即，在靶核苷酸为S基因的情况下，可使用向S基因插入特定人工核苷酸序列的模板A作为阳性对照组。此时，可通过确认第二S探针(与S基因及特定人工核苷酸序列结合)的表达(发光)来确认靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列是否存在，因此，可判断为阳性对照组引起的假阳性。

2-2-2.当为并不是阳性对照组引起，而是由基因(模板B)引起的污染时，确认第二 S探针的表达(发光)与否

在靶核苷酸序列为S基因情况下，当被不包含靶核苷酸序列的模板B污染时，若表达(发光)第二探针，则妨碍阳性对照组引起的假阳性判断。

在本实验中，当被模板B污染时，为了确认是否表达(发光)需要与靶核苷酸序列(S基因)结合的第二探针(第二S探针)，将根据上述实施例2-2制备的模板B及第二探针以如下述表6的条件混合后，将所混合的试样以如上述表5的顺序进行PCR。

表6

实验例2-2-2的结果如图8。参照图8，用于实验的第二S探针需要与S基因(并不是*orf1ab基因)序列结合，在模板B中不存可与第二S探针结合的序列，因此，无法检测到第二S探针。

根据本实验，当被不存在靶核苷酸(基因S)序列的模板B污染时，不表达(发光)第二S探针。

即，参照实验例2-2-1及实验例2-2-2，假阳性判断用探针(第二探针)的表达(发光)是指靶核苷酸序列及特定人工核苷酸均存在，可使用第二探针来仅判断阳性对照组(模板A)引起的假阳性。

2-3.在靶核苷酸为Orf1ab基因的情况下，判断假阳性

2-3-1.当被阳性对照组(模板B)污染时，利用第二O探针判断假阳性

在使用模板B(包含作为靶核苷酸序列的Orf1ab的基因序列及特定人工核苷酸序列)作为阳性对照组(positive control)的情况下，可利用与Orf1ab基因的一部分序列结合的第二探针(第二O探针)确认是否被阳性对照组污染。

在实验例2-3-1中，当被阳性对照组模板B污染时，确认是否通过第二探针(第二O探针)表达(发光)。

将根据上述实施例2-2制备的模板B及第二O探针以如下述表7的条件混合后，对所混合的试样以如下述表5的顺序进行PCR。

表7

实验例2-3-1的结果如图9。参照图9，使用第二O探针(与作为靶核苷酸的Orf1ab基因序列的一部分结合)作为用于本实验的第二探针，第一探针、第二探针引起的两个峰均被检测出。由此，可知存在阳性对照组基因(模板B)(第一探针峰)，是阳性对照组引起的假阳性(第二探针引起的峰)。

即，在靶核苷酸为Orf1ab基因的情况下，可使用模板B(向靶核苷酸Orf1ab序列插入特定人工核苷酸序列)作为阳性对照组。此时，可通过确认与Orf1ab基因的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的第二O探针的表达(发光)来确认靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的存在与否，因此，可判断阳性对照组引起的假阳性。

2-3-2.当部位阳性对照组污染，而是被基因(模板A)污染时，确认第二O探针的表 达(发光)与否

在靶核苷酸为Orf1ab基因的情况下，当被不包含靶核苷酸序列的模板A污染时，若表达第二探针，则妨碍阳性对照组引起的假阳性判断。

在本实验中，当被模板A污染时，为了确认包含靶核苷酸序列(S基因)的第二探针(第二O探针)是否表达(发光)，将根据上述实施例2-2制备的模板A及第二O探针以如下述表8的条件混合后，对所混合的试样以如上述表5的顺序进行PCR。

表8

实验例2-3-2的结果如图10。参照图10，用于实验的第二O探针需要与ORF1ab基因(并不是*S基因)序列的一部分结合。在模板A中不存在可与第二O探针结合的ORF1ab基因序列，因此，未检测出第二O探针。根据本实验，当被不存在靶核苷酸(ORF1ab基因)序列的模板A污染时，不表达(发光)第二O探针。

若第二探针不与靶核苷酸的一部分序列结合(参照图11)，在因当前实验(在图11中，利用B试剂盒)之前的实验(在图11中，利用A试剂盒)而实验工具等被污染的情况下，具有因之前实验的残留物(图11中的模板A)表达(发光)第二探针的问题。在此情况下，即使靶基因序列不存在于检查对象组中，在检查对象组、阴性对照组中不表达(发光)假阳性判断用探针(第二探针)，由此，妨碍阳性对照组引起的假阳性判断。

即，在利用与靶核苷酸及特定人工核苷酸结合的假阳性判断用探针(第二探针)的情况下，若不存在所设置的特定靶核苷酸，则无法检测出假阳性检测用探针(第二探针)。因此，在利用本发明的情况下，仅可特异性确认是否被包含所设置的特定靶核苷酸的阳性对照组污染。

根据本发明，在靶核苷酸为多个的情况下，特定靶核苷酸，从而可仅判断相应靶核苷酸的污染。

如上所述，本发明图示优选实施例及实验例并进行说明，但并不限定于上述实施例及实验例，可在不超出本发明的目的的范围内，可由本发明所属技术领域的普通技术人员进行各种变更和修改。

Claims (15)

1.一种假阳性判断用组合物，其特征在于，包含：

阳性对照组，包含靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列；

第一探针，与上述靶核苷酸的序列结合；以及

第二探针，与上述靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合。

2.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，还包含对于上述靶核苷酸序列特异性的引物集。

3.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，上述第一探针结合的靶核苷酸的序列与上述第二探针结合的靶核苷酸的序列的一部分互补。

4.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，上述阳性对照组的特定人工核苷酸序列插入于靶核苷酸序列的内部。

5.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，上述阳性对照组的特定人工核苷酸序列独立于靶核苷酸序列来设置。

6.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，上述阳性对照组由核苷酸组成，是质粒或寡核苷酸。

7.根据权利要求1所述的假阳性判断用组合物，其特征在于，上述特定人工核苷酸序列具有15mer至35mer的长度，上述第二探针结合的特定人工核苷酸的长度为5mer至20mer。

8.一种假阳性判断方法，其特征在于，包括：

步骤a，制备包含靶核苷酸序列及特定人工核苷酸序列的阳性对照组的试样；

步骤b，从样品获得基因组后，制备为检查对象组试样；

步骤c，向上述阳性对照组及检查对象组试样分别添加(i)与靶核苷酸的序列结合的第一探针、(ii)与上述靶核苷酸的一部分序列及特定人工核苷酸的一部分序列结合的第二探针及(iii)引物集；

步骤d，上述步骤c之后，使阳性对照组及检查对象组试样分别进行聚合酶链式反应；以及

步骤e，进行聚合酶链式反应的结果，当在检查对象组中仅示出与第一探针相应的信号时，判断为真阳性。

9.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，包括如下的步骤：

当在上述检查对象组试样中示出与第一探针及第二探针分别相应的信号时，判断为假阳性，

当未示出与第一探针及第二探针相应的信号时，判断为阴性。

10.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述步骤b的引物集对于靶核苷酸序列具有特异性。

11.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述步骤c的第一探针结合的靶核苷酸的序列与上述第二探针结合的靶核苷酸的序列的一部分互补。

12.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述阳性对照组的特定人工核苷酸序列插入于靶核苷酸序列的内部。

13.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述阳性对照组的特定人工核苷酸序列独立于靶核苷酸序列来设置。

14.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述阳性对照组由核苷酸组成，是质粒或寡核苷酸。

15.根据权利要求8所述的假阳性判断方法，其特征在于，上述特定人工核苷酸序列具有15mer至35mer的长度，上述第二探针结合的特定人工核苷酸的长度为5mer至20mer。

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