KR102496414B1 - 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 및 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하여 최적화된 Real-time RT-PCR 시약 조성물을 이용함으로써 장관감염원충의 감시 체계에 활용할 수 있는 진단법을 확립하고자 하였다.
Description
본 발명은 쿠도아충(Kudoa Septempunctata)의 18S rRNA gene 및 28S rNRA gene을 동시에 구분하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
쿠도아충(Kudoa septempunctata)은 주로 물고기의 근육에 기생하는 어병기생충으로 알려져 왔으나 최근 일본 내 발생한 원인불명 식중독의 역학조사에서 쿠도아 점액포자충에 의한 인체 병원성 쿠도아가 최초 보고되었다.
일본 내 보고자료에 따르면 쿠도아충은 일정량 이상 섭취 시 일과성의 설사나 구토가 주증상이고, 병후 경과는 양호하며 잠복기간 또한 매우 짧고, 인체 내 기생하지 않으며, 사람에서 사람으로 2차 감염 또한 없다고 알려져 있다. 또한, 일본 내에서 발생하는 식죽동 사례 중 매년 50건 이상이 쿠도아충에 감염된 넙치를 날것으로 섭취한 이후 발생하였음을 보고하고 있어 식중독과 관련하여 식품안전상의 위해성 유무에 관해 논란이 되고 있다.
2013년 국내 양식 넙치에서 쿠도아충 감염이 확인이 되고, 2015년 이후 쿠도아충으로 인한 장관감염증 사례가 산발적으로 보고됨에 따라서 우리나라에서는 넙치 양식장의 쿠도아충 감염 현황 조사를 전국적으로 실시하고 있다.
진단법으로 인체는 분변, 구토물에서 18S와 28S rRNA 검사를 통한 유전자 검출을 기준으로 하고 있으며, 넙치는 넙치 근육에서 염색법 (Trypan blue, Giemsa)을 통한 포자 현미경 관찰 및 18S와 28S rRNA PCR 검사를 통한 진단을 하고 있다.
이처럼 쿠도아충은 수인성, 식품매개질환 원인병원체로서 작용할 가능성이 알려지고 각 지자체의 검사법 구축 지원 요구가 높아짐에 따라 의심질환자의 검체(대변)에서 정확한 쿠도아충 검출을 위해 빠르고 효과적인 유전자 검사법으로써 Real-time PCR 기술의 적용이 효과적일 것으로 판단된다.
한국등록특허 제1810786호는 쿠도아충 검출용 PNA 프로브 세트에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제2021176호는 쿠도아충 검사용 단일클론항체 및 이를 이용한 검사 키트에 관해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 쿠도아충의 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 쿠도아충의 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것이고, 상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하며, 서열번호 3 또는 6을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 것이고, 상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하며, 서열번호 3 또는 6을 포함하는 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 것이고, 상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하며, 서열번호 3 또는 6을 포함하는 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 유발 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 쿠도아충 유발 질환은 설사, 구토, 복통 또는 식중독에 관한 것이다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 사용하여 쿠도아충 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출방법을 제공한다.
상기 검출방법은 프로브를 추가로 포함하는 것이고, 상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하며, 서열번호 3 또는 6을 포함하는 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출방법에 관한 것이다.
상기 검출방법에서 사용하는 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 포함한다.
본 발명의 쿠도아충의 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트와 이를 이용한 검출방법은 쿠도아충(Kudoa septempunctata)의 정확한 검출을 위한 multiplex Real-time PCR 시스템(대상 유전자 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene)을 개발하고 이에 대한 성능 분석 및 검증을 통하여 장관감염원충의 감시 체계에 활용할 수 있는 진단법 확립에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 18S rRNA gene 특이적 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 28S rRNA gene 특이적 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene에 대한 각 multiplex 조건의 inhibition test 결과를 나타낸 것이다(red : 18S rRNA gene, blue : 28S rRNA gene).
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 플라스미드 DNA 확인 결과를 나타낸 것이다(red plot : 18S rRNA gene, blue plot : 28S rRNA gene, black plot : IC).
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포 추출 DNA를 이용한 시료의 표준 곡선 작성 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 올리고 DNA를 이용한 표준 곡선 작성 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충의 LOD 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 28S rRNA gene 특이적 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene에 대한 각 multiplex 조건의 inhibition test 결과를 나타낸 것이다(red : 18S rRNA gene, blue : 28S rRNA gene).
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충 플라스미드 DNA 확인 결과를 나타낸 것이다(red plot : 18S rRNA gene, blue plot : 28S rRNA gene, black plot : IC).
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포 추출 DNA를 이용한 시료의 표준 곡선 작성 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 올리고 DNA를 이용한 표준 곡선 작성 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 쿠도아충의 LOD 시험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
프로브는 이 분야에 알려진 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 일반적으로 5' 및 3' 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 (Reporter) 및 소광자 (Quencher)가 결합되어 있으므로, 사용가능한 모든 형광 표지인자 및 소광자를 사용할 수 있다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 병원체의 특이 유전자 검출을 가능케 하고, 바람직하게는 K. septempunctata 18s rRNA gene에 FAM, 28s rRNA gene에 JOE 및 internal control에 Cy5를 사용하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5' 말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3' 말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3, 4, 9, 10, 15, 16 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 50 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변 또는 토사물으로부터 분리된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 쿠도아충 유발질환은 쿠도아충으로 인해 발생하거나 쿠도아충에 감염된 생물을 섭취하여 발생하는 질환에 관한 것이고, 구체적으로는 설사, 구토, 복통 또는 식중독에 관한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머; 및 서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머;를 사용하여 쿠도아충 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> 쿠도아충 18S rRNA gene 검출용 프라이머 및 프로브 설계
본 발명에서는 Kudoa septempuctata에 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하는 것이 목표이므로 NCBI에 등록된 K. septempunctata의 18S rRNA gene의 서열을 수집한 뒤, consensus sequence를 BLAST한 결과로 확보한 유사성이 높은 Kudoa sp.의 sequence를 multiple alignment하여 분석을 수행, specific region에 프로브 및 프라이머의 3'-end에 특이성을 부여하였다(도1, 표1).
- 쿠도아충 18S rRNA gene 특이적 검출용 프라이머 및 프로브 서열 -
<실시예 2> 쿠도아충 28S rRNA gene 검출용 프라이머 및 프로브 설계
18S rRNA gene과 동일하게 Kudoa septempuctata 28S rRNA gene 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하기 위해서 NCBI에 등록된 K. septempunctata의 28S rRNA gene의 서열을 수집한 뒤, consensus sequence를 BLAST한 결과로 확보한 유사성이 높은 Kudoa sp.의 sequence를 multiple alignment하여 분석을 수행, specific region에 프로브 및 프라이머의 3'-end에 특이성을 부여하였다(도 2, 표 2).
- 쿠도아충 28S rRNA gene 특이적 검출용 프라이머 및 프로브 서열 -
<실시예 3> 프라이머 및 프로브의 in silico 분석
본 발명의 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 서열은 K. septempunctata에서만 특이적 검출이 가능할 것으로 예측된다(표3).
- 쿠도아충 18S rRNA gene 검출용 프라이머 및 프로브의 검출 범위 확인 결과 -
실시예 1 및 2의 프라이머 및 프로브에 대한 in silico cross reactivity을 통하여 장관 감염 원충과 장내 상재 가능한 세균 및 바이러스들과의 서열 일치도를 분석하였다.
염기서열 분석을 수행한 원충과 박테리아 및 바이러스들과 본 발명의 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 검출용 프라이머 및 프로브 염기서열의 일치율이 낮아 비특이적 증폭 시그널이 발생하지 않을 것으로 예측되었다(표 4 및 5).
-18S rRNA gene 특이적 검출용 primer/probe의 in silico cross-reactivity 확인-
-28S rRNA gene 특이적 검출용 primer/probe의 in silico cross-reactivity 확인-
<실시예 4> 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시검출을 위한 Multiplex Real-time PCR 조건 최적화
쿠도아충 검출을 위한 두 시스템에 해당하는 18S rRNA gene과 28S rRNA gene 및 internal control 검출용 핵산을 합성하였으며, 이때, multiplex를 구성하기 위한 TaqMan probe의 reporter dye는 두 시스템 모두 동일하게 쿠도아충 18S rRNA gene에 FAM, 28S rRNA gene에 JOE 및 internal contrl에 Cy5를 사용하였다.
합성된 프라이머 및 TaqMan probe 세트를 이용해 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 확인한 결과 각 표적에서만 정상적인 증폭 곡선을 나타내었다.
1) Real-time PCR 반응액은 10 pmol/㎕로 희석한 forward 및 reverse primer 각 1 ㎕ 와 2pmol/㎕로 희석한 TaqMan probe 1 ㎕, 2X Real-time PCR MasterMix(Kogenebiotech)에 DNA 5 ㎕와 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞추었다.
2) PCR 조건은 50℃에서 2분간 carryover contamination 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
최적화된 primer/probe 농도 조건 및 inhibition 확인 시험 데이터는 표 6, 7 및 도3과 같으며 singleplex 반응액과 multiplex 반응액에서의 각 Target DNA 검출 Ct 값에 큰차이가 없었다.
- 확립된 primer 및 probe 농도 조건 -
- 각 prmer/probe set의 multiplex 효율 확인 시험 -
쿠도아충 양성 시료를 이용한 Real-time PCR MasterMix (PowerAmp™ Real-time PCR Master Mix II, M0104) 반응액은 각 농도로 혼합한 primer 및 probe 시약 4 ㎕, ２X Real-time MasterMix 10 ㎕와 단계적으로 희석한 DNA 5 ㎕와 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞추었다(표 8).
PCR 조건은 50℃에서 ２분간 Carryover contamination 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
- 각 prmer/probe set의 multiplex 효율 확인 시험 -
<실시예 5> 양성표준물질 제작
양성표준시료의 성상은 각 프라이머의 증폭 시퀀스를 포함한 Plasmid DNA이며 이의 제조 방법은 다음과 같다.
1) 양성시료를 본 키트의 프라이머로 증폭시켜 생성된 각 target의 PCR product를 삽입 유전자로 활용하였다.
2) 삽입 유전자의 증폭산물을 벡터와 함께 클로닝 서비스 전문 업체에 의뢰하여 유전자 클로닝을 진행하였다(표 9).
- 클로닝 벡터 정보 -
합성된 양성표준 plasmid DNA stock을 Real-time PCR로 확인하고 실험 목적에 맞도록 안정화 물질로 희석하여 사용하였다(도 4).
<실시예 6> 성능평가
개발한 쿠도아충 진단용 multiplex Real-time PCR 시스템의 특이성을 교차반응 시험을 통해 평가하였다.
임상 검체에 오염 가능한 상재균, 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 장관 감염 원충과 장내 상재 가능한 세균, 바이러스 및 human genomic DNA를 포함한 다양한 생물종의 핵산을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였다.
교차반응 시험 결과 표적인 쿠도아충 시료에서만 각각의 형광 채널에서 검출반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았다(표 10).
- 쿠도아충 진단용 교차반응 시험 결과 -
쿠도아충의 직선성은 세포 수를 측정한 시료에서 추출한 DNA와 합성 올리고 DNA(106 target copies/㎕)를 이용해 측정하였다
각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, template DNA로 사용하여 PCR을 수행, 측정 Ct 값과 농도를 이용해 표준 곡선을 작성한 결과 모두 R2 값이 0.99 이상이었고, slope로부터 계산된 PCR 효율도 100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(표 11, 도 5, 6)
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1
- 쿠도아충의 linearity test Ct 측정값 -
본 발명에서 사용한 시약의 민감도는 검출한계(Limit of detection)로 측정하였으며, 각 타겟의 추정되는 검출 한계 근처를 4개의 농도로 희석하여 제조한 시료를 24회 반복시험하며, 총 시험 건수 중 95% 이상 양성으로 판정될 수 있는 농도를 최소 검출한계로 결정하였다(도 7, 표 12)
- 쿠도아충의 검출한계 측정 -
쿠도아충의 각 타겟을 표준물질로 제작한 플라스미드 DNA를 10, 5, 2.5, 1 copies 로 순차적으로 희석한 뒤, 각 농도별 24회 반복 시험한 결과로부터 산출한 95% 이상 검출 가능한 최소 농도가 진단 시스템의 두 타겟은 모두 2.5 copies로 분석되었으며, 진단의 두 타겟은 모두 5 copies로 분석되었다(표 13, 14).
- 쿠도아충의 18S rRNA gene 농도별 Ct 측정값 -
- 쿠도아충의 28S rRNA gene 농도별 Ct 측정값 -
본 발명에서 사용한 시약의 정밀도는 날짜 간(between day), 시험 간(between run) 반복성으로 평가하였다.
각 타겟 별 3 가지 농도의 표준시료를 시험하였으며 분석적 민감도 시험 결과를 바탕으로 저농도(low positive), 중간 농도(moderate positive) 및 고농도(high positive)를 각각 LOD, 3 x LOD 및 5 x LOD로 설정하였다(CLSI EP5-A2).
타겟 별 시료를 10일 동안 1일 1회, 시료의 농도 당 2반복 시험하였다.
반복성 시험 결과 산출된 검사 날짜 간(between day), 시험 간(between run) CV (%)는 5% 미만으로 산출되어 본 발명의 시약 시스템의 정밀성을 입증하였다(표 15, 16).
- 정밀도 시험 결과 -
- 반복성 시험 결과 -
이상의 결과를 통해, 본 발명에서 개발한 쿠도아충(K. septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene multiplex Real-time PCR system의 분석적 성능 및 유효성 검증 실시 결과를 토대로 장관감염원충들의 신속 검사방법으로써 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.
<110> KDCA
<120> Primer sets for simultaneous detection of 18S rRNA and 28S rRNA
of Kudoa Septempunctata
<130> M20-0000
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA forward
<400> 1
agctaataca tagcaaatct caccatg 27
<210> 2
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA reverse
<400> 2
gccgaggcca gttggtc 17
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA probe
<400> 3
aatggtggga gcattta 17
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 28S rRNA forward
<400> 4
gtcagggcta ttggcactaa aga 23
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 28S rRNA reverse
<400> 5
catccacgcc aacaataaat c 21
<210> 6
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 28S rRNA probe
<400> 6
aaatggccag cagttttggc tttcacag 28
Claims (20)
- 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 프로브;와,
서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 6의 프로브를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 프로브;와,
서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 6의 프로브를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 조성물 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제5항에 있어서, 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 조성물
- 서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 프로브;와,
서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 6의 프로브를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 감염증 진단용 조성물 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제10항에 있어서, 상기 쿠도아충 감염증은 설사, 구토, 복통 또는 식중독인 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 감염증 진단용 조성물
- 제10항에 있어서, 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 감염증 진단용 조성물
- 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
서열번호 1을 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 2를 포함하는 쿠도아충 18S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 프로브;와,
서열번호 4를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 정방향 프라이머;
서열번호 5를 포함하는 쿠도아충 28S rRNA gene 역방향 프라이머; 및
서열번호 6의 프로브를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트를 사용하여 쿠도아충 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출방법 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제16항에 있어서, 시료는 토사물 또는 분변으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 쿠도아충(Kudoa septempunctata) 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출방법
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200172363A KR102496414B1 (ko) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200172363A KR102496414B1 (ko) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220082441A KR20220082441A (ko) | 2022-06-17 |
| KR102496414B1 true KR102496414B1 (ko) | 2023-02-06 |
Family
ID=82268926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200172363A KR102496414B1 (ko) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102496414B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101810786B1 (ko) | 2016-09-21 | 2017-12-20 | 강릉원주대학교산학협력단 | 쿠도아충 검출용 pna 프로브 세트 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR102021176B1 (ko) | 2016-03-30 | 2019-11-05 | 주식회사 솔포투 | 검사용 단일클론항체 및 이를 이용한 검사 키트 |
-
2020
- 2020-12-10 KR KR1020200172363A patent/KR102496414B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 2019년도 수인성 및 식품매개감염병 관리지침, 질병관리본부, 2019.* |
| GenBank Accession No. AB731754 (2016.09.28.)* |
| GenBank Accession No. AB731755 (2016.09.28.)* |
| Sang Phil Shin et al., Aquaculture, 464, p.37-41, 2016.* |
| Tetsuya Harada et al., International Journal of Food Microbiology, 156, p.161-167, 2012.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220082441A (ko) | 2022-06-17 |
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