KR102274011B1 - 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 - Google Patents

결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것으로서, 본 발명의 의해 무겁고 복잡한 PCR 기기 없이도 빠르고 정확하게 MTB와 NTM을 검출할 수 있고 이를 감별하여 진단할 수 있는바 본 발명은 기존의 결핵 검출법을 대체하는 분자진단 검사법으로 이용될 것으로 기대된다.

Description

결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 {Primer set for high sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for detection and identification of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous mycobacteria}
본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것이다.
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)에 의한 비말 감염 질환으로 지난 수세기 동안 수백만 명의 사망자가 발생한 감염성 질환 사망의 주요 원인중 하나이다. 또한 매년 1천만 건의 새로운 사례와 약 2백만 건의 사망 원인으로 추정된다.
한편, 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)은 자연수와 토양 등 자연환경에 널리 상재하는 균으로 NTM 감염증은 폐질환이 가장 흔하며 대부분의 경우 균이 공기를 통해 호흡기에 감염되어 발생한다. 역학적으로 M, avium complex가 60-80%를 차지하며, 외국의 경우 M. kansasii가 15-20%를, 국내의 경우 M. abscessus가 20-30%를 차지하며 국내에서 임상 검체에서 NTM이 분리되는 빈도와 NTM 폐질환으로 진단, 치료 받는 환자들이 크게 늘고 있다
기존의 결핵 검출법으로는 흉부방사선 검사, 직접도말 표본의 항산성염색 (Acid fast stain), 고체 배지 및 액체 배지 배양법이 있다. 배양에서 양성을 확인하는 것이 확진 방법이나, 배양 기간이 6-8주로 매우 길다는 점에서 그 한계가 있다. 또한 직접도말 표본의 항산성염색의 경우 MTB와 NTM을 구분할 수 없다는 단점이 있다. 따라서 최근에는 MTB, NTM 구분 및 진단을 위해 결핵균 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)검사가 이러한 도말검사와 배양검사의 단점을 보완하여 민감하고 신속하게 MTB 및 NTM 검출 및 동정을 위하여 사용되고 있으며 결핵진료지침에도 의심되는 환자의 경우 균동정을 위해 PCR을 사용할 것을 권고하고 있다. 하지만, PCR을 이용한 MTB 및 NTM 검출법은 숙련된 검사자 및 고급 실험실 기반을 필요로 한다. 따라서 전문적인 의료 서비스를 이용할 수 없는 지역이나 단기간에 많은 수의 선별 검사를 해야 할 필요가 있는 곳에서는 검사에 한계점이 있다.
최근, 온도 변화 없이 일정한 온도에서 유전자를 증폭하는 등온 증폭 반응법(loop-mediated isothermal amplification reaction, LAMP)이 개발되었다. LAMP법은 주형에 상보적인 프라이머 6개를 사용하여 각기 다른 8개의 부위를 인식하여 유전자 증폭을 진행한다. 기존의 PCR법과 비교하였을 때, 온도의 변화 없이 증폭할 수 있다는 점에서 검사의 소모시간을 단축할 수 있고, 온도 변화를 위한 값비싼 장비 없이 검사를 진행할 수 있다
이에, 본 발명자들은 LAMP법을 이용하여 숙련된 검사자 및 값비싼 장비 없이도 MTB 및 NTM을 동시에 동정하는 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
Norihiro, T. et. al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature protocols. 2008;3:5.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 결핵균 검출 프라이머 세트와 결핵균 및 비결핵항산균 검출 프라이머 세트를 제공하고, 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하여 결핵균과 비결핵항산균을 감별하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 결핵균 및 비결핵항상균을 감별하여 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 결핵균 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 내지 12의 프라이머를 포함하는, 결핵균 및 비결핵항산균 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 서열번호 7 내지 12의 프라이머를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 13 내지 18의 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 서열번호 5; 서열번호 11; 및/또는 서열번호 18;의 프라이머는 형광물질로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광물질은 서열번호 5의 15번째 염기인 티민(T)에 표지될 수 있으며, 서열번호 11의 18번째 염기인 티민에 표지될 수 있고, 서열번호 18의 18번째 염기인 티민에 표지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 서열번호 5; 서열번호 11; 및 서열번호 18 프라이머는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는 결핵균 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 내지 12의 프라이머를 포함하는 결핵균 및 비결핵항상균 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 18의 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 키트를 제공한다. .
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약에는 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 MTB primer set; 및 서열번호 7 내지 12의 MTB 및 NTM primer set;를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 체액(body fluid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 프라이머 세트는 서열번호 13 내지 18의 internal control primer set를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 형광 측정 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 MTB primer set; 및 MTB 및 NTM primer set에 의해 증폭된 산물이 모두 검출되는 경우 MTB 양성으로 해석하고, MTB primer set에 의한 증폭 산물은 검출되지 않았으나 MTB 및 NTM primer set에 의해 증폭된 산물은 검출되는 경우 NTM 양성으로 해석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 internal control primer set에 의한 증폭산물이 검출되고 다른 primer set에 의한 증폭 산물은 검출되지 않는 경우 음성으로 해석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 (3) 단계의 검출 시간을 측정하여 MTB 및/또는 NTM을 정량화 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 “정량화”는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 증폭반응 수행 시의 표준곡선과 비교하여 DNA 농도에 따른 형광물질 검출 시간을 정량화하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 단계 (3)의 증폭 산물을 형광지표를 이용하여 검출함으로써 형광물질 검출 시간을 측정하여 DNA 농도를 정량화하는 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 실시간 다중 등온증폭반응(real-time multiplex LAMP)을 기반으로 하여 종래 전통적인 PCR, real time PCR 기반의 검출방법 보다 폐질환의 원인균 동정 시간을 단축시키고, LAMP을 기반으로 하기 때문에 검사에 온도변화가 필요치 않아 종래 PCR 기기와 비교하여 단순하고 경제적이고 가벼운 기기를 이용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 multiplex로 검사하여 MTB 및 NTM을 모두 검출하고 동시에 이를 감별할 수 있다는 점에서 시간과 비용 측면에 유리하여 기존의 결핵 검출법을 대체하는 분자진단검사방법으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 결핵 GYRB 유전자 서열 특이적인 MTB 프라이머 세트, 비결핵항산균과 결핵균 모두 증폭할 수 있는 16S rRNA 유전자 서열 특이적인 MTB 및 NTM 프라이머 세트, 인간의 G6PD를 증폭하는 internal control 프라이머 세트를 이용하여 실제 MTB, NTM 감염 및 정상인 비감염 검체, 증류수 검체 테스트 결과이다.
도 2는 결핵 GYRB 유전자 서열 특이적인 MTB 프라이머 세트의 검출한계를 plasmid를 이용하여 테스트한 결과이다.
도 3은 결핵 GYRB 유전자 서열 특이적인 MTB 프라이머 세트가 MTB에 특이적으로 증폭하고 비결핵항산균 NTM에 비특이적인지 확인하기 위하여 교차반응 유무를 실제 MTB, NTM 감염 검체를 대상으로 테스트한 결과이다.
본 발명자들은 현장에서 감염성 폐질환 환자의 병원균을 빠르고 정확하게 동정할 수 있는 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)의 gyrB 유전자에 특이적인 프라이머와 결핵균과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)의 16S rRNA에 특이적인 프라이머 세트를 LAMP 기반으로 제작하였다. 본 발명의 LAMP 기반의 프라이머 세트는 전통적인 PCR과 달리 온도변화를 요구하지 아니하여 단순하고 가벼운 증폭 기기를 이용할 수 있고 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 gyrB에 특이적인 프라이머 세트와 상기 16S rRNA에 특이적인 프라이머 세트를 포함하여 multiplex LAMP를 수행함으로써 결핵균과 비결핵균을 동시에 감별하여 검출할 수 있도록 함으로써 균체 동정 시간을 단축시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 G6PD 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제작하여 Internal control primer set로 제공함으로써 상기 multiplex LAMP 분석 결과에 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 MTB에 특이적으로 작용하는 프라이머 (MTB primer), 25종의 NTM 및 MTB에 동시에 작용하는 프라이머 (MTB 및 NTM primer) 및 internal control로 증폭 여부를 확인할 수 있는 프라이머 (Internal control primer) 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 MTB 박테리아 검출용 조성물을 제공한다. 하기 표 1의 서열번호 1-6은 MTB를 위한 6개의 프라이머 세트이며 (MTB primer), 서열번호 7-12은 25종의 NTM 및 MTB를 위한 6개의 프라이머 세트 (MTB 및 NTM primer) 이며, 서열번호 13-18은 internal control로 G6PD 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (Internal control primer) 세트이다. 표 1의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물은 Multiplex LAMP 법을 이용한 MTB, NTM 박테리아 검출법에 사용될 수 있다.
본 발명의 MTB 및 NTM 감별 검출을 위한 multiplex LAMP 프라이머 세트의 구성은 하기 표 2와 같으며, 반응 시간 및 온도는 하기 표 3과 같다.
한편, 본 발명의 상기 세 프라이머 세트에 형광물질을 부착하여 Multiplex real-time LAMP를 수행할 수 있으며, 상기 프라이머 세트마다 부착된 형광을 달리하여 한 번의 검사로 균체 동정 결과를 얻을 수 있다. 구체적으로, MTB primer 및 MTB 및 NTM primer에서 모두 증폭된 경우 MTB로 해석한다. MTB 및 NTM primer는 증폭이 되었으나 MTB primer에서 증폭이 되지 않은 경우 NTM으로 해석한다. 검사결과가 음성으로 나왔을 때 internal control primer에서 증폭이 된 경우 참 음성으로 해석하며, 결과가 음성이나 internal control primer도 음성인 경우 재검할 것을 권고한다.
상기 프라이머 세트에 부착되는 형광물질은 형광을 발하는 것이라면 제한되지 아니하나, 그 비제한적인 예로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등이 있다.
한편, 본 발명은 MTB 프라이머 세트의 서열번호 5의 염기로 구성된 정방향 고리프라이머 (Forward loop primer: FLP)에서 15번째 염기인 티민(thymine)에 형광물질을 부착하고, MTB 및 NTM 프라이머 세트의 서열번호 11로 구성된 FLP에서 18번 염기인 티민에 형광물질을 부착하고, internal control primer set의 서열번호 18의 역방향 고리프라이머(Backward loop primer: BLP)에서 18번째 염기인 티민에 형광신호를 부착하여 타겟 유전자의 증폭에 간섭하지 않고 빠르고 강하게 형광을 발할 수 있도록 하였다. 형광물질을 붙이는 티민의 위치는 프라이머 올리고서열 3' 말단에 마지막 4개의 염기서열에 위치하고, 티민 앞에는 G나 C 가 위치하고, 티민의 말단 두염기에도 GG GC CC등의 염기가 위치함으로 티민의 형광발현을 최적화 하도록 고안되었다.
본 발명에서 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 체액(body fluid) 등을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)”은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요 없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭 유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, “실시간 다중 등온증폭반응”은 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서, 다양한 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 바람직하게는 실시간으로 시료에서 MTB 및/또는 NTM를 동시에 검출 및 판별할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)에 사용되는 것이 바람직하며, 등온증폭반응은 표적 DNA를 LAMP에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) LAMP일 수 있고, 실시간 LAMP (real-time LAMP)일 수 있으며, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 있어서, “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽 에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합 하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다.
본 발명에 있어서, “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합 하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
한편, 본 발명에서 고리 프라이머에서 형광물질이 부착된 염기를 특정하기 위한 염기의 번호매김은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 염기 순서를 확인하는 방법과 동일하게 3'에서 5' 순서로 이루어진다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[재료 및 방법]
1. MTB 박테리아 및 NTM의 DNA
고려대학교 구로병원에서 결핵환자와 비결핵항산균 감염환자의 객담 및 기관지 흡인액에서 추출된 MTB 박테리아와 NTM의 핵산을 (DNA) 확보하였으며, 각 샘플의 감염 여부는 병원에서 임상적으로 확인되었다.
2. 임상 검체
MTB 20개, NTM 20개, 결핵음성 20개, 총 60개의 검체는 고려대학교 구로병원에서 받아 사용하였다.
3. MTB 박테리아 및 NTM 검출용 프라이머 세트, LAMP 혼합물 조성 및 반응 조건
MTB 박테리아의 GyrB 유전자 서열과 Mycobacterium 박테리아 (MTB, NTM 모두 포함)의 16S rRNA 유전자 서열을 바탕으로 MTB 박테리아 및 25종의 NTM 검출용 프라이머 세트를 설계/제작하였다. 각 프라이머 세트의 고리 프라이머에는 각각 FAM와 HEX을 연결하였으며, 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 1에 정리하였다. 하기 표 1에서 형광물질로 표지된 염기는 굵은 글씨로 표시하였다. LAMP를 이용한 결핵 검출은 EIKEN사의 Loop amp DNA Amplification kit를 구입하여 사용하였다. real-time LAMP를 위한 반응 혼합물의 시약 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, real-time LAMP은 하기 표 3의 반응 조건 및 시간에 따라 수행하였다.
서열번호 Name Sequence (5'-3') Target gene length
1 Mycobacterium tuberculosis F3 GCGATATCTGGTGGTCTGCA Gyr B 20
2 B3 CCGTGGTTTCGAAAACAGC 19
3 FIP ACCCGTCGCGCTTGATCTCGTCGGCGTGTCGGTGGTTA 38
4 BIP GAGAAGTCGGAACCCCTGGGCGCACCGTTGACCCCGT 37
5 FLP GACTTCGAGCCGGG T GG 17
6 BLP AGGGGCGCCGACCAAGAA 18
7 Non tuberculous Mycobacterium F3 CCAACTACGTGCCAGCAG 16S rRNA 18
8 B3 ACCGGTGTTCCTCCTGAT 18
9 FIP RCCTACGAGCTCTTTACGCCCACCGCGGTAATACGTAGGGT 41
10 BIP GCGATACGGGCAGACTDGAGCATTCCACCGCTACACCAG 39
11 FLP GTAATTCCGGACAACGC T CG 20
12 BLP TACTGCAGGGGAGACTGGAA 20
13 Internal control F3 TGTCACCAGCAACATCTCGA G6PD 20
14 B3 TCCTCAGGGAAGCAAATGAC 20
15 FIP ATAGCAGAGAGGCTGCCTACGGTTTTGATGTCCCCTGTCCCACCA 45
16 BIP AAGAAAAGCAGACGCAGCAGCTTTTTGGGGCTGTTTGCGGATT 43
17 FLP GGGGTGGCCATGGAGTGC 18
18 BLP TCCCAACCTCAATGCCC T GC 20
LAMP 구성요소
구분 부피
2X Reaction buffer 12.5 μl
Enzyme buffer 1 μl
Fluorescent dye 1 μl
Primer
(FIP,BIP,FLP,BLP)		 각 최종 농도 800 nM
Primer (F3 ,B3) 각 최종 농도 100 nM
Distilled water 8.5 μl
Template DNA 2 μl
Total volume 25 μl
LAMP 온도 조건 및 시간
65℃ 1 min 60 cycle
80℃ 5 min
Total reaction time 75 min
[실험결과]
실시예 1. LAMP용 프라이머 세트의 MTB 검출 한계 확인
본 발명의 multiplex LAMP용 프라이머 세트의 MTB 검출 한계를 확인하기 위해 MTB의 genomic DNA 1 ng/μL를 3차 증류수로 10까지 희석하여 민감도를 확인하였다. 테스트에 사용된 핵산은 비사용 시 -50℃에 보관하였다. 10분의 1희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 결과 10 fg/μL에서 증폭이 확인되었다(도 2). 하기 표 4는 희석농도에 따른 Mycobacterium tuberculosis LAMP 프라이머 세트의 Ct 값을 나타낸 것이다.
No μg/μl Mycobacterium tuberculosis 박테리아
Ct value RFU
1 100 9.33 18258
2 10-1 10.25 19964
3 10-2 11.45 23781
4 10-3 13.18 17775
5 10-4 14.24 19911
6 10-5 16.42 16799
7 10-6 17.72 23854
8 10-7 33.90 23316
9 10-8 45.38 20499
10 10-9 N/A 4665
실시예 2. LAMP용 프라이머 세트의 NTM에 대한 교차 반응 확인
상기 결핵환자의 객담 및 기관지 흡인액에서 추출된 DNA 샘플을 대상으로 한 real-time LAMP의 Mycobacterium tuberculosis 박테리아의 각 서열에 대한 특이 반응을 확인하기 위해 NTM 박테리아의 서열과 상호 교차 반응을 실시하였다. Mycobacterium tuberculosis의 LAMP 교차반응에 따른 검출 Ct 값은 하기 표 5 및 도 3에 나타내었으며, 결과에 따라 상호 교차 반응 및 비 특이 반응에 대한 결과는 없음을 확인할 수 있었다.
Mycobacterium tuberculosis
Sample Ct. value RFU
MTB 1 7.75 1995
MTB 2 8.16 1497
NTM 1 N/A 396
NTM 2 N/A 482
non-infected human gDNA N/A 510
D.W N/A 1.44
실시예 3. LAMP용 프라이머 세트의 MTB, NTM, 및 결핵음성 임상 검체에서의 검출 Ct 값 확인
고려대학교 구로 병원에서 얻은 MTB 20개, NTM 20개, 결핵음성 20개, 총 60개의 검체로 임상실험을 실시하였다. 상기 검체에서 추출된 DNA 샘플을 대상으로 real-time LAMP을 수행하고 Mycobacterium tuberculosis 박테리아의 검출 결과를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 6과 같으며 원내 진단결과와 동일하게 확인되었다.
Sample NO. 원내 PCR 결과 LAMP 　
Ct<40 Ct<30 RFU
MTB 1 35.6 24.98 19692
2 27 14.67 14309
3 33.3 18.51 17017
4 22.7 13.39 19391
5 31 16.48 12619
6 30.9 16.20 27559
7 18.3 11.32 23126
8 28 14.91 17555
9 30.8 16.12 15324
10 36.7 19.99 28758
11 28.4 15.34 23078
12 34.7 18.72 21257
13 30.3 17.07 19650
14 39.1 20.67 22392
15 34.8 18.59 21175
16 30.7 15.65 19386
17 22.4 11.43 17174
18 39.2 22.34 16850
19 32.1 18.90 23138
20 31.4 16.13 15903
NTM 1 N/A N/A N/A
2 N/A N/A N/A
3 N/A N/A N/A
4 N/A N/A N/A
5 N/A N/A N/A
6 N/A N/A N/A
7 N/A N/A N/A
8 N/A N/A N/A
9 N/A N/A N/A
10 N/A N/A N/A
11 N/A N/A N/A
12 N/A N/A N/A
13 N/A N/A N/A
14 N/A N/A N/A
15 N/A N/A N/A
16 N/A N/A N/A
17 N/A N/A N/A
18 N/A N/A N/A
결핵음성 1 N/A N/A N/A
2 N/A N/A N/A
3 N/A N/A N/A
4 N/A N/A N/A
5 N/A N/A N/A
6 N/A N/A N/A
7 N/A N/A N/A
8 N/A N/A N/A
9 N/A N/A N/A
10 N/A N/A N/A
11 N/A N/A N/A
12 N/A N/A N/A
13 N/A N/A N/A
14 N/A N/A N/A
15 N/A N/A N/A
16 N/A N/A N/A
17 N/A N/A N/A
18 N/A N/A N/A
19 N/A N/A N/A
20 N/A N/A N/A
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> Primer set for high sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for detection and identification of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous mycobacteria <130> DHP19-451 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_F3 <400> 1 gcgatatctg gtggtctgca 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_B3 <400> 2 ccgtggtttc gaaaacagc 19 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_FIP <400> 3 acccgtcgcg cttgatctcg tcggcgtgtc ggtggtta 38 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_BIP <400> 4 gagaagtcgg aacccctggg cgcaccgttg accccgt 37 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_FLP <400> 5 gacttcgagc cgggtgg 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium tuberculosis_BLP <400> 6 aggggcgccg accaagaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_F3 <400> 7 ccaactacgt gccagcag 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_B3 <400> 8 accggtgttc ctcctgat 18 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_FIP <400> 9 rcctacgagc tctttacgcc caccgcggta atacgtaggg t 41 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_BIP <400> 10 gcgatacggg cagactdgag cattccaccg ctacaccag 39 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_FLP <400> 11 gtaattccgg acaacgctcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non tuberculous Mycobacterium_BLP <400> 12 tactgcaggg gagactggaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_F3 <400> 13 tgtcaccagc aacatctcga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_B3 <400> 14 tcctcaggga agcaaatgac 20 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_FIP <400> 15 atagcagaga ggctgcctac ggttttgatg tcccctgtcc cacca 45 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_BIP <400> 16 aagaaaagca gacgcagcag ctttttgggg ctgtttgcgg att 43 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_FLP <400> 17 ggggtggcca tggagtgc 18 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control_BLP <400> 18 gagaagtcgg aacccctggg cgcaccgttg accccgt 37

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 내지 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트를 포함하는, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria) 감별 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 5, 11, 및 18의 프라이머는 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 서열번호 5의 15번째 염기인 티민(thymine)에 형광물질이 부착되었고,
    상기 서열번호 11의 18번째 염기인 티민에 형광물질이 부착되었고,
    상기 서열번호 18의 18번째 염기인 티민에 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항상균 감별 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 5, 11, 및 18에 부착된 형광물질은 각각 상이한 파장을 발하는 형광물질인 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항상균 감별 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  13. 제7항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 키트.
  15. (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 제7항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 체액(body fluid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항상균 감별 검출 방법.
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