JP2004344065A - オリゴヌクレオチド及びそれを用いた結核菌群の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】結核菌または結核菌群遺伝子を迅速、特異的、かつ、高感度に検出するＬＡＭＰ反応用の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーとそれを用いたＬＡＭＰ法による結核菌群検出方法を提供することにある。
【解決手段】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のうち、結核菌および結核菌群には相同性が高いが、非定型抗酸菌とは相同性の低い配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、および、このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応による結核菌および結核菌群遺伝子の増幅および検出方法。
【選択図】 なし
【解決手段】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のうち、結核菌および結核菌群には相同性が高いが、非定型抗酸菌とは相同性の低い配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、および、このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応による結核菌および結核菌群遺伝子の増幅および検出方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核菌群を短時間に特異的に検出するオリオヌクレチド、及び該オリオヌクレチドをプライナーとして用いたＬＡＭＰ法により結核菌群の核酸を増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核は、かつて日本において、国民病とも言われ、年間死者が１０万人を超えることもあった。衛生状態の改善、集団検診やＢＣＧ接種等の感染予防の徹底、感染者の隔離治療による感染拡大の防止措置が計られ患者数は著しく低下したものの、１９９７年の人口１０万人対の罹患率および死者率は、それぞれ３３．９、２．２でありの国内における主要な感染症の一つとなっている。結核の病原菌は、抗酸菌種のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（抗酸菌）に含まれる結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。ＢＣＧ菌、マイコバクテリウム・ボバイス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカーナム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ミクロッチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）とを加えて結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）と称されている。
【０００３】
この結核菌を検出する方法としては、チール・ ネールゼン（Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）染色による検鏡法、コールド式抗酸菌染色による鏡検法があるが、低感度であり、また、煩雑な手操作を要する。培地を用いた培養法もあるが、結核菌が２分裂に要する時間は１０〜１５時間を要するため、検体から判定を行うのに必要量の結核菌を得るまでに２〜４週間を要する。この問題点を解決するため、近年、核酸増幅技術を応用した結核菌ゲノムＤＮＡを検出する技術が開発されている。
【０００４】
核酸増幅技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。これは標的とする核酸配列に相補的な１対のオリゴヌクレオチドプライマーとＴａｑポリメラーゼなど耐熱性のＤＮＡ合成酵素を使い、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇにて標的核酸を短時間に増幅させる技術である。しかし、このＰＣＲ法をもってしても、試料の調製から増幅結果の判定までに３時間程度を要し、ＰＯＣＴ（医療現場診断）に有用とは言い難く、より迅速に、かつ、高感度に標的となる核酸を増幅・検出する技術が求められている。
【０００５】
ＬＡＭＰとはＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略で、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発された簡易・迅速・精確・安価に核酸を増幅する技術で、日本特許番号第３３１３３５８号、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８， ｅ６３， ２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２９０， １１９５−１１９８， ２００２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４７， Ｎｏ．９， １７４２−１７４３， ２００１に報告されている。これは１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた２対計４種のプライマー、あるいは、これに１対のループプライマーを加えた３対計６種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って通常２０分〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。ＰＣＲ法と違い、増幅反応が一定温度なのが特徴で、増幅効率もＰＣＲよりよいとされている。
ＬＡＭＰ反応の検出は、ＬＡＭＰ増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけてＬＡＭＰ反応に特徴的なラダーのバンドを確認する方法や、ＬＡＭＰ反応産物にエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の核酸インターカレーターを添加して検出する方法がある。また、ＬＡＭＰ反応時の生成物であるピロリン酸と反応バッファー中のマグネシウムイオンにて生じる沈殿物を検出する方法が国際公開番号ＷＯ０１／８３８１７ Ａ１、および、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２８９， １５０−１５４， ２００２に示されている。
【０００６】
日本特許第２９７６４０６号に、ｒＲＮＡ遺伝子にて非ウィルス性の生物を検出・同定する方法が記載されている。ウィルスを除くあらゆる細胞はリボソームを含み、従ってゲノム上にｒＲＮＡ遺伝子がコードされている。ｒＲＮＡ遺伝子は種々の生物間にて相同性の高い保存された配列と、相同性が低く特異性の高い配列とを有しており、様々な生物種の検出および同定に極めて有用である。
【０００７】
ＬＡＭＰ法にてｒＲＮＡ遺伝子ファミリーの一つである１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を増幅して結核菌の同定を行う方法が、２００２年 第４９回日本臨床検査医学会総会において、藤田保健衛生大学病院臨床検査部のＫｉｔａｈａｒａらよって報告された（Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ， ５０（Ｓｕｐｐｌ．）， １８８， ２００２）。Ｋｉｔａｈａｒａらの報告によると、結核菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち結核菌群によく保存され相同性の高く、一方で他の非定型抗酸菌とは相同性の低い配列に対してＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計し、これを使ってＬＡＭＰ反応を行った。Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１６と称されるＬＡＭＰプライマーセットにて、非定型抗酸菌および一般細菌のゲノムＤＮＡは増幅することなく、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および、Ｍ．ｂｏｖｉｓを弱毒化したＢＣＧ菌のゲノムだけを特異的に、反応時間６０分にて増幅する事が出来、その検出感度がおよそ１０３個の細胞相当であることが報告された。一方、Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１１と称されるＬＡＭＰプライマーセットでは高い検出感度（１０個の細胞相当）を示したが、結核菌群以外の非定型抗酸菌の一部とも交差性を示し高い特異性を得るには至らなかった。
【０００８】
つまり、ＬＭＡＰ法を用いて結核菌および結核菌群の核酸の増幅および同定が試みられたが、▲１▼高い検出感度、▲２▼高い特異性（結核菌または結核菌群の核酸だけを増幅）、▲３▼短時間（ＰＯＣＴ実現可能な３０分以内）での増幅、を満たすプライマーの開発には至っていない。
【０００９】
【特許文献１】
日本特許第３３１３３５８号
【特許文献２】
国際公開番号ＷＯ ０１／８３８１７ Ａ１
【特許文献３】
日本特許第２９７６４０６号
【非特許文献１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８， ｅ６３， ２０００
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２９０， １１９５−１１９８， ２００２
【非特許文献３】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４７， Ｎｏ．９， １７４２−１７４３， ２００１
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２８９， １５０−１５４， ２００２
【非特許文献５】
Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ， ５０（Ｓｕｐｐｌ．）， １８８， ２００２
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度、高い特異性、短時間での増幅、を満たす結核菌または結核菌群検出ＬＡＭＰ反応用のプライマー、およびそれを用いたＬＡＭＰ法による結核菌群を迅速に検出する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、迅速・特異的・高感度に結核菌群の検出を行うためのＬＡＭＰ法用のオリゴヌクレオチドプライマーとそれを用いたＬＡＭＰ法による結核菌群を特異的に検出する方法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 配列番号４８の塩基配列を５’側に、配列番号４９の塩基配列を３’側に有し、全長が２９から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（２） 配列番号５０の塩基配列を５’側に、配列番号５１の塩基配列を３’側に有し、全長が２６から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（３） 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド。
（４） 配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００１３】
（５） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（１）または（２）に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
（６） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（３）または（４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
（７） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（３）記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと（４）記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドとを組み合わせて使用する、（６）に記載の方法。
【００１４】
（８） ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１６から２１に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、（５）〜（７）の何れかに記載の方法。
（９） ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２２から２７及び４０から４７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、（５）〜（８）の何れかに記載の方法。
（１０） 試料中の結核菌群を検出するために行なう、（５）〜（９）の何れかに記載の方法。
【００１５】
（１１） 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１６】
（１２） 配列番号１６から１８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１９から２１の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１７】
（１３） 配列番号２２から２４及び４０から４３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２５から２７及び４４から４７の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらインナープライマー、アウタープライマー、および、ループプライマーの設計方法は、先の特許文献１、文献１〜３、および、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。
【００２０】
具体的には、まず、標的核酸について、５’側からＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃの６つの領域を規定し、この６つの領域の相補的な領域をＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３と規定し、次の通り４種類のプライマーを設計する。
【００２１】
（１）ＦＩＰプライマー：標的核酸のＦ２領域を３’端に持ち、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３領域を持つように設計する。
（３）ＢＩＰプライマー：標的核酸のＢ２領域を３’端に持ち、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ３領域を持つように設計する。
【００２２】
ＬＡＭＰ法においては、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分（Ｂ１領域とＢ２領域の間、あるいは Ｆ１領域とＦ２領域の間）に相補的な配列を持つループプライマー（それぞれループプライマーＢ（本発明においてはＢＬプライマー）、ループプライマーＦ（本発明においてはＦＬプライマー））を用いることによりＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。ループプライマーを用いることにより、増幅時間は、ループプライマーを使用しない場合の１／３〜１／２となることが期待される。
【００２３】
本発明においては、先ず、結核菌群の１６Ｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９６２、Ｘ５８８９０、Ｘ５５５８８、ＡＦ４８０６０５）と非定型抗酸菌の１６ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２９１８、ＡＪ５３６０３７、ＡＦ３０６４５５、ＡＪ５３６０３７、ＡＪ５３６０３６、Ｘ５２９２７、Ｍ２９５７５、ＡＦ４８０６０１、ＡＪ５３６０３５、Ｘ５２９３０、ＡＦ４５６２４１、ＡＪ５３６０３４）の配列を比較し、結核菌群に特異性が高く、非定型抗酸菌に特異性が低い配列を選択した。ＬＡＭＰプライマーのインナープライマーの３’末端付近や５’末端付近の配列が、この結核菌群特異的な配列と相補的になるように設計した。まず、インナープライマーとして、ＦＩＰプライマー６種（配列番号１〜６）、ＢＩＰプライマー９種（配列番号７〜１５）を設計し、これらのオリゴヌクレオチドを合成した。次にアウタープライマーとしてＦ３プライマー３種（配列番号１６〜１８）とＢ３プライマー３種（配列番号１９〜２１）、ループプライマーとしてＦＬプライマー３種（配列番号２２〜２４）とＢＬプライマー３種（配列番号２５〜２７）を設計した。インナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーを組み合わせた表１記載の２１種のプライマーセット（＃００１〜＃０２１）を調製した。この２１種のプライマーセットについて、結核菌のゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にて濁度を測定した（実施例１）。２１種のプライマーセットのうちプライマーセット＃００７、＃０１８および＃０１９が比較的短時間にＬＡＭＰによる増幅が進むことが示された。
【００２４】
プライマーセット＃００７のインナープライマー、配列番号３と、配列番号９の配列を改変し、新たに６種のＦＩＰプライマー（配列番号２８〜３０、３４〜３６）と６種のＢＩＰプライマー（配列番号３１〜３３、３７〜３９）とを合成した。これらのプライマーを加えて、新たに２４のプライマーセット（＃０３０〜０５３）を調製した（表２）。プライマーセット＃００７を含む２５のプライマーセットについて、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、濁度が０．１に到達すのに要する時間を指標として、ＬＭＡＰ増幅反応の速さを比較した（実施例２）。その結果、プライマーセット＃０４２が最も早くＬＡＭＰの増幅反応が進行することが示された。
【００２５】
次に、この＃０４２のループプライマーの改変を行った。新たに４種のＦＬプライマー（配列番号４０〜４３）と、４種のＢＬプライマー（配列番号４４〜４７）を合成した。ＦＬプライマーとＢＬプライマーのうちのいずれかを含む１０のプライマーセット＃０６５〜＃０７４を調製し（表５）、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００にて濁度を測定した（実施例３）。続いてＦＬプライマーとＢＬプライマーの両者を含むプライマーセット＃０８２〜＃０９０を調製し、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００にて濁度を測定し（実施例４）、より短時間で増幅が進行する２種のプライマーセット＃０８２と＃０８５を得て、その最適なプライマー濃度を調べた（実施例５）。この２種のプライマーセットについて、ＬＡＭＰ増幅反応の結核菌群への特異性と検出感度とを調べた結果（実施例６、７）、課題とする迅速・特異的・高感度に結核菌群の検出を行うためのＬＡＭＰ用プライマーを得るに至った。
【００２６】
以上の通り、本発明で用いるインナープライマーとしては、配列番号４８の塩基配列を５’側に、配列番号４９の塩基配列を３’側に有し、全長が２９から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５０の塩基配列を５’側に、配列番号５１の塩基配列を３’側に有し、全長が２６から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号２から５、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに配列番号８から１１、２８から３０及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２７】
また、本発明で用いるアウタープライマーとしては、Ｆ３として配列番号１６、Ｂ３として配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、本発明で用いるループプライマーとしては、配列番号２３、２６及び４０から４７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２８】
本発明においてインナープライマー、アウタープライマーまたはループプライマーとして用いる上記オリゴヌクレオチドは何れも、当業者に周知の方法である固相合成法により合成することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から販売されている。
【００２９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本明細書の配列表の配列番号で示される特定の塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものでもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ＬＡＭＰ法で結核菌のＤＮＡを増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したオリゴヌクレオチドや、プライマーとするオリゴヌクレオチドの５´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものでもよい。
【００３０】
本発明におけるＬＡＭＰ法では、標的遺伝子を含む試料、プライマー（ＦＩＰ， Ｆ３， ＢＩＰ， Ｂ３）、鎖置換型ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液を含む反応液を調製し、６４〜６５℃で１０分から１時間程度インキュベーションすることにより、増幅産物あるいは増幅の有無を検出することができる。増幅産物の検出は簡易検出及びリアルタイム検出が可能であり、増幅する時間は、ループプライマーを利用することで更に短縮することができる。
【００３１】
ＬＡＭＰ法は、具体的には以下の通り行なうことができる。即ち、インナープライマー（ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー）、ループプライマー（ＦＬプライマーおよびＢＬプライマー）及びアウタープライマー（Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー）を含むプライマーセットを作製し、これを適当なマイクロチューブに添加し、氷上に置く。ＬＡＭＰ反応液としては、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、所定量の試料（即ち、結核菌ゲノムＤＮＡを含む試料）を添加し、全容量を適量に調整し、氷上に置く。これに、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して全容量を調整し、混和した後、例えば、６４℃にて１５分から１時間反応させることによりＬＡＭＰ反応を行なう。
【００３２】
ＬＡＭＰ反応におけるインナープライマーの濃度は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜７０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは３０〜５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば４０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３３】
ＬＡＭＰ反応におけるループプライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜１５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは１０〜１００ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば２０、４０または６０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３４】
ＬＡＭＰ反応におけるアウタープライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、２〜２０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは２〜１０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば５ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３５】
ＬＡＭＰ反応による増幅反応の過程では、副産物としてピロリン酸マグネシウムが産生される。この副産物は、増幅産物と比例して産生されることから、増幅産物量が非常に多いＬＡＭＰ法では白濁として観察することができる。即ち、ＬＡＭＰ法ではこの白濁の有無で標的遺伝子の有無を確認することができる。また、ＬＡＭＰ反応とその後の反応産物の検出は、ＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）などの市販の装置を用いて行なうことができる。
【００３６】
あるいは、蛍光インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド等）の存在下で増幅させた増幅産物の入ったチューブにＵＶランプを照射することにより、鋳型ＤＮＡ（標的遺伝子）が存在する場合には、蛍光強度が上がり、肉眼でも増幅の有無、いわゆる標的遺伝子の有無を確認することができる。
【００３７】
上記以外としては、ＬＡＭＰ反応後、反応産物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドあるいはサイバーグリーンで核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の結核菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーを使用することもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】
実施例１：ＬＡＭＰ反応１
ＬＡＭＰ反応プライマーとして用いる配列番号１から２７記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００１〜＃０２１（表１）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。図１にプライマーセット＃００１〜＃００７、図２にプライマーセット＃００８〜＃０１４、図３にプライマーセット＃０１５〜＃０２１のリアルタイム濁度測定の結果を示す。プライマーセット＃００７や＃０１９が比較的早くＬＡＭＰ反応が進んでいることが示された。このうち、まずプライマーセット＃００７の改良を進めることとした。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２：ＬＡＭＰ反応２：インナープライマーの改変
プライマーセット＃００７に使用されているインナープライマーを元に、インナープライマーとして新たに配列番号２８から３９記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃０３０〜＃０５３（表２）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表３と表４にまとめた。その結果、プライマーセット＃０４２が最も早くＬＡＭＰ反応が進行することが示された。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【００４３】
【表４】
【００４４】
実施例３：ＬＡＭＰ反応３：ループプライマーの改変１
プライマーセット＃０４２に使用されているループプライマーを改変するため、新たに配列番号４０から４７記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーまたはＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃０６５〜＃０７４（表５）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表６にまとめた。その結果、プライマーセット＃０６５、＃０６６、＃０６７、＃０６８、＃０６９、＃０７１、＃０７２、＃０７３、＃０７４が比較的早くＬＡＭＰ反応が進んでいることが示された。このうち、プライマーセット＃０６５〜＃０６９、＃０７０〜＃０７４のうち反応の早く進んだプライマーセット各３セットを選択した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
実施例４：ＬＡＭＰ反応４：ループプライマーの改変２
実施例３にて選択したプライマーセット＃０６５、＃０６７、＃０６８、＃０７１、＃０７２、＃０７３に使用されているＦＬループプライマーとＢＬループプライマーとを組み合わせ、プライマーセット＃０８２〜＃０９０（表７）を調製した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセットを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図４）。また、各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表８にまとめた。その結果、全てのプライマーセットが、実施例２で示したプライマーセット＃０４２よりもＬＡＭＰ反応が早く進む事が示された。中でもＦＬプライマーとして配列番号２３、ＢＬプライマーとして配列番号４４とを組み合わせたプライマーセット＃０８２がが最も早くＬＡＭＰ反応が進むことが示された。またプライマーセット＃０８４、＃０８５、＃０８８、＃０８９も濁度が０．１に到達する時間の平均が１８分台であり、比較的早くＬＡＭＰ反応が進むことが示された。この中で、２回の実験とも１８分台であったプライマーセット＃０８５も＃０８２と共に選択した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
【表８】
【００５０】
実施例５：ＬＡＭＰ反応５：プライマーの濃度
実施例１、２、４にて選択したプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５のプライマーセットについて、ＦＬループプライマーとＢＬループプライマーの量を変えてＬＡＭＰ反応を行った。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして各２０、４０、６０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセットを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定し、ＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表９にまとめた。ループプライマー量を２０ｐｍｏｌから４０ｐｍｏｌや６０ｐｍｏｌに増加させると、ＬＡＭＰ増幅に要する時間が短縮された。
【００５１】
【表９】
【００５２】
実施例６：ＬＡＭＰ反応６：交差性
インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５を０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、表１０記載の結核菌群（ＢＣＧ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）非定型抗酸菌（Ｍ．ｍａｌｍｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）のゲノムＤＮＡ １００ｐｇを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて４０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図５〜８）。その結果、いずれのプライマーセットとも結核菌群のゲノムＤＮＡをテンプレートにした場合のみＬＡＭＰによる増幅が進んでおり、作製したプライマーセットが結核菌群に特異性が高いことが示された。
【００５３】
【表１０】
【００５４】
実施例７：ＬＡＭＰ反応７：検出感度
インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５を０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰを添加して全容量を２２μｌとした。これに１００ｐｇ（２．１×１０４個の細胞相当）から１００ｆｇ（２．１×１０１個の細胞相当）のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図９〜１２）。その結果、プライマーセット＃０４２、＃０８２、＃０８５の検出感度が、結核菌２１０個相当であることが示された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のプライマーを用いたＬＡＭＰ反応によれば、結核菌および結核菌群遺伝子を迅速、特異的かつ高感度に検出することが可能である。
【００５６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プライマーセット＃００１から＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図２】図２は、プライマーセット＃００８から＃０１４を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図３】図３は、プライマーセット＃０１５から＃０２１を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図４】図４は、プライマーセット＃０８２から＃０９０を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図５】図５は、プライマーセット＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図６】図６は、プライマーセット＃０４２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図７】図７は、プライマーセット＃０８２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図８】図８は、プライマーセット＃０８５を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図９】図９は、プライマーセット＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１０】図１０は、プライマーセット＃０４２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１１】図１１は、プライマーセット＃０８２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１２】図１２は、プライマーセット＃０８５を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核菌群を短時間に特異的に検出するオリオヌクレチド、及び該オリオヌクレチドをプライナーとして用いたＬＡＭＰ法により結核菌群の核酸を増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核は、かつて日本において、国民病とも言われ、年間死者が１０万人を超えることもあった。衛生状態の改善、集団検診やＢＣＧ接種等の感染予防の徹底、感染者の隔離治療による感染拡大の防止措置が計られ患者数は著しく低下したものの、１９９７年の人口１０万人対の罹患率および死者率は、それぞれ３３．９、２．２でありの国内における主要な感染症の一つとなっている。結核の病原菌は、抗酸菌種のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（抗酸菌）に含まれる結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。ＢＣＧ菌、マイコバクテリウム・ボバイス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカーナム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ミクロッチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）とを加えて結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）と称されている。
【０００３】
この結核菌を検出する方法としては、チール・ ネールゼン（Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）染色による検鏡法、コールド式抗酸菌染色による鏡検法があるが、低感度であり、また、煩雑な手操作を要する。培地を用いた培養法もあるが、結核菌が２分裂に要する時間は１０〜１５時間を要するため、検体から判定を行うのに必要量の結核菌を得るまでに２〜４週間を要する。この問題点を解決するため、近年、核酸増幅技術を応用した結核菌ゲノムＤＮＡを検出する技術が開発されている。
【０００４】
核酸増幅技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。これは標的とする核酸配列に相補的な１対のオリゴヌクレオチドプライマーとＴａｑポリメラーゼなど耐熱性のＤＮＡ合成酵素を使い、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇにて標的核酸を短時間に増幅させる技術である。しかし、このＰＣＲ法をもってしても、試料の調製から増幅結果の判定までに３時間程度を要し、ＰＯＣＴ（医療現場診断）に有用とは言い難く、より迅速に、かつ、高感度に標的となる核酸を増幅・検出する技術が求められている。
【０００５】
ＬＡＭＰとはＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略で、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発された簡易・迅速・精確・安価に核酸を増幅する技術で、日本特許番号第３３１３３５８号、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８， ｅ６３， ２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２９０， １１９５−１１９８， ２００２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４７， Ｎｏ．９， １７４２−１７４３， ２００１に報告されている。これは１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた２対計４種のプライマー、あるいは、これに１対のループプライマーを加えた３対計６種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って通常２０分〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。ＰＣＲ法と違い、増幅反応が一定温度なのが特徴で、増幅効率もＰＣＲよりよいとされている。
ＬＡＭＰ反応の検出は、ＬＡＭＰ増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけてＬＡＭＰ反応に特徴的なラダーのバンドを確認する方法や、ＬＡＭＰ反応産物にエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の核酸インターカレーターを添加して検出する方法がある。また、ＬＡＭＰ反応時の生成物であるピロリン酸と反応バッファー中のマグネシウムイオンにて生じる沈殿物を検出する方法が国際公開番号ＷＯ０１／８３８１７ Ａ１、および、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２８９， １５０−１５４， ２００２に示されている。
【０００６】
日本特許第２９７６４０６号に、ｒＲＮＡ遺伝子にて非ウィルス性の生物を検出・同定する方法が記載されている。ウィルスを除くあらゆる細胞はリボソームを含み、従ってゲノム上にｒＲＮＡ遺伝子がコードされている。ｒＲＮＡ遺伝子は種々の生物間にて相同性の高い保存された配列と、相同性が低く特異性の高い配列とを有しており、様々な生物種の検出および同定に極めて有用である。
【０００７】
ＬＡＭＰ法にてｒＲＮＡ遺伝子ファミリーの一つである１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を増幅して結核菌の同定を行う方法が、２００２年 第４９回日本臨床検査医学会総会において、藤田保健衛生大学病院臨床検査部のＫｉｔａｈａｒａらよって報告された（Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ， ５０（Ｓｕｐｐｌ．）， １８８， ２００２）。Ｋｉｔａｈａｒａらの報告によると、結核菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち結核菌群によく保存され相同性の高く、一方で他の非定型抗酸菌とは相同性の低い配列に対してＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計し、これを使ってＬＡＭＰ反応を行った。Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１６と称されるＬＡＭＰプライマーセットにて、非定型抗酸菌および一般細菌のゲノムＤＮＡは増幅することなく、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および、Ｍ．ｂｏｖｉｓを弱毒化したＢＣＧ菌のゲノムだけを特異的に、反応時間６０分にて増幅する事が出来、その検出感度がおよそ１０３個の細胞相当であることが報告された。一方、Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ．１１と称されるＬＡＭＰプライマーセットでは高い検出感度（１０個の細胞相当）を示したが、結核菌群以外の非定型抗酸菌の一部とも交差性を示し高い特異性を得るには至らなかった。
【０００８】
つまり、ＬＭＡＰ法を用いて結核菌および結核菌群の核酸の増幅および同定が試みられたが、▲１▼高い検出感度、▲２▼高い特異性（結核菌または結核菌群の核酸だけを増幅）、▲３▼短時間（ＰＯＣＴ実現可能な３０分以内）での増幅、を満たすプライマーの開発には至っていない。
【０００９】
【特許文献１】
日本特許第３３１３３５８号
【特許文献２】
国際公開番号ＷＯ ０１／８３８１７ Ａ１
【特許文献３】
日本特許第２９７６４０６号
【非特許文献１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８， ｅ６３， ２０００
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２９０， １１９５−１１９８， ２００２
【非特許文献３】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４７， Ｎｏ．９， １７４２−１７４３， ２００１
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２８９， １５０−１５４， ２００２
【非特許文献５】
Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ， ５０（Ｓｕｐｐｌ．）， １８８， ２００２
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度、高い特異性、短時間での増幅、を満たす結核菌または結核菌群検出ＬＡＭＰ反応用のプライマー、およびそれを用いたＬＡＭＰ法による結核菌群を迅速に検出する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、迅速・特異的・高感度に結核菌群の検出を行うためのＬＡＭＰ法用のオリゴヌクレオチドプライマーとそれを用いたＬＡＭＰ法による結核菌群を特異的に検出する方法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 配列番号４８の塩基配列を５’側に、配列番号４９の塩基配列を３’側に有し、全長が２９から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（２） 配列番号５０の塩基配列を５’側に、配列番号５１の塩基配列を３’側に有し、全長が２６から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
（３） 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド。
（４） 配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【００１３】
（５） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（１）または（２）に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
（６） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（３）または（４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
（７） ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして（３）記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと（４）記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドとを組み合わせて使用する、（６）に記載の方法。
【００１４】
（８） ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１６から２１に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、（５）〜（７）の何れかに記載の方法。
（９） ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２２から２７及び４０から４７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、（５）〜（８）の何れかに記載の方法。
（１０） 試料中の結核菌群を検出するために行なう、（５）〜（９）の何れかに記載の方法。
【００１５】
（１１） 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１６】
（１２） 配列番号１６から１８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１９から２１の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
【００１７】
（１３） 配列番号２２から２４及び４０から４３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２５から２７及び４４から４７の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。
【００１９】
ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらインナープライマー、アウタープライマー、および、ループプライマーの設計方法は、先の特許文献１、文献１〜３、および、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。
【００２０】
具体的には、まず、標的核酸について、５’側からＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃの６つの領域を規定し、この６つの領域の相補的な領域をＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３と規定し、次の通り４種類のプライマーを設計する。
【００２１】
（１）ＦＩＰプライマー：標的核酸のＦ２領域を３’端に持ち、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３領域を持つように設計する。
（３）ＢＩＰプライマー：標的核酸のＢ２領域を３’端に持ち、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ３領域を持つように設計する。
【００２２】
ＬＡＭＰ法においては、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分（Ｂ１領域とＢ２領域の間、あるいは Ｆ１領域とＦ２領域の間）に相補的な配列を持つループプライマー（それぞれループプライマーＢ（本発明においてはＢＬプライマー）、ループプライマーＦ（本発明においてはＦＬプライマー））を用いることによりＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。ループプライマーを用いることにより、増幅時間は、ループプライマーを使用しない場合の１／３〜１／２となることが期待される。
【００２３】
本発明においては、先ず、結核菌群の１６Ｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９６２、Ｘ５８８９０、Ｘ５５５８８、ＡＦ４８０６０５）と非定型抗酸菌の１６ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２９１８、ＡＪ５３６０３７、ＡＦ３０６４５５、ＡＪ５３６０３７、ＡＪ５３６０３６、Ｘ５２９２７、Ｍ２９５７５、ＡＦ４８０６０１、ＡＪ５３６０３５、Ｘ５２９３０、ＡＦ４５６２４１、ＡＪ５３６０３４）の配列を比較し、結核菌群に特異性が高く、非定型抗酸菌に特異性が低い配列を選択した。ＬＡＭＰプライマーのインナープライマーの３’末端付近や５’末端付近の配列が、この結核菌群特異的な配列と相補的になるように設計した。まず、インナープライマーとして、ＦＩＰプライマー６種（配列番号１〜６）、ＢＩＰプライマー９種（配列番号７〜１５）を設計し、これらのオリゴヌクレオチドを合成した。次にアウタープライマーとしてＦ３プライマー３種（配列番号１６〜１８）とＢ３プライマー３種（配列番号１９〜２１）、ループプライマーとしてＦＬプライマー３種（配列番号２２〜２４）とＢＬプライマー３種（配列番号２５〜２７）を設計した。インナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーを組み合わせた表１記載の２１種のプライマーセット（＃００１〜＃０２１）を調製した。この２１種のプライマーセットについて、結核菌のゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にて濁度を測定した（実施例１）。２１種のプライマーセットのうちプライマーセット＃００７、＃０１８および＃０１９が比較的短時間にＬＡＭＰによる増幅が進むことが示された。
【００２４】
プライマーセット＃００７のインナープライマー、配列番号３と、配列番号９の配列を改変し、新たに６種のＦＩＰプライマー（配列番号２８〜３０、３４〜３６）と６種のＢＩＰプライマー（配列番号３１〜３３、３７〜３９）とを合成した。これらのプライマーを加えて、新たに２４のプライマーセット（＃０３０〜０５３）を調製した（表２）。プライマーセット＃００７を含む２５のプライマーセットについて、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、濁度が０．１に到達すのに要する時間を指標として、ＬＭＡＰ増幅反応の速さを比較した（実施例２）。その結果、プライマーセット＃０４２が最も早くＬＡＭＰの増幅反応が進行することが示された。
【００２５】
次に、この＃０４２のループプライマーの改変を行った。新たに４種のＦＬプライマー（配列番号４０〜４３）と、４種のＢＬプライマー（配列番号４４〜４７）を合成した。ＦＬプライマーとＢＬプライマーのうちのいずれかを含む１０のプライマーセット＃０６５〜＃０７４を調製し（表５）、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００にて濁度を測定した（実施例３）。続いてＦＬプライマーとＢＬプライマーの両者を含むプライマーセット＃０８２〜＃０９０を調製し、結核菌 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートしてＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００にて濁度を測定し（実施例４）、より短時間で増幅が進行する２種のプライマーセット＃０８２と＃０８５を得て、その最適なプライマー濃度を調べた（実施例５）。この２種のプライマーセットについて、ＬＡＭＰ増幅反応の結核菌群への特異性と検出感度とを調べた結果（実施例６、７）、課題とする迅速・特異的・高感度に結核菌群の検出を行うためのＬＡＭＰ用プライマーを得るに至った。
【００２６】
以上の通り、本発明で用いるインナープライマーとしては、配列番号４８の塩基配列を５’側に、配列番号４９の塩基配列を３’側に有し、全長が２９から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５０の塩基配列を５’側に、配列番号５１の塩基配列を３’側に有し、全長が２６から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号２から５、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに配列番号８から１１、２８から３０及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２７】
また、本発明で用いるアウタープライマーとしては、Ｆ３として配列番号１６、Ｂ３として配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、本発明で用いるループプライマーとしては、配列番号２３、２６及び４０から４７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２８】
本発明においてインナープライマー、アウタープライマーまたはループプライマーとして用いる上記オリゴヌクレオチドは何れも、当業者に周知の方法である固相合成法により合成することができる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から販売されている。
【００２９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本明細書の配列表の配列番号で示される特定の塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものでもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ＬＡＭＰ法で結核菌のＤＮＡを増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したオリゴヌクレオチドや、プライマーとするオリゴヌクレオチドの５´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものでもよい。
【００３０】
本発明におけるＬＡＭＰ法では、標的遺伝子を含む試料、プライマー（ＦＩＰ， Ｆ３， ＢＩＰ， Ｂ３）、鎖置換型ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液を含む反応液を調製し、６４〜６５℃で１０分から１時間程度インキュベーションすることにより、増幅産物あるいは増幅の有無を検出することができる。増幅産物の検出は簡易検出及びリアルタイム検出が可能であり、増幅する時間は、ループプライマーを利用することで更に短縮することができる。
【００３１】
ＬＡＭＰ法は、具体的には以下の通り行なうことができる。即ち、インナープライマー（ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー）、ループプライマー（ＦＬプライマーおよびＢＬプライマー）及びアウタープライマー（Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー）を含むプライマーセットを作製し、これを適当なマイクロチューブに添加し、氷上に置く。ＬＡＭＰ反応液としては、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、所定量の試料（即ち、結核菌ゲノムＤＮＡを含む試料）を添加し、全容量を適量に調整し、氷上に置く。これに、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して全容量を調整し、混和した後、例えば、６４℃にて１５分から１時間反応させることによりＬＡＭＰ反応を行なう。
【００３２】
ＬＡＭＰ反応におけるインナープライマーの濃度は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜７０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは３０〜５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば４０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３３】
ＬＡＭＰ反応におけるループプライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜１５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは１０〜１００ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば２０、４０または６０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３４】
ＬＡＭＰ反応におけるアウタープライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、２〜２０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは２〜１０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば５ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。
【００３５】
ＬＡＭＰ反応による増幅反応の過程では、副産物としてピロリン酸マグネシウムが産生される。この副産物は、増幅産物と比例して産生されることから、増幅産物量が非常に多いＬＡＭＰ法では白濁として観察することができる。即ち、ＬＡＭＰ法ではこの白濁の有無で標的遺伝子の有無を確認することができる。また、ＬＡＭＰ反応とその後の反応産物の検出は、ＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）などの市販の装置を用いて行なうことができる。
【００３６】
あるいは、蛍光インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド等）の存在下で増幅させた増幅産物の入ったチューブにＵＶランプを照射することにより、鋳型ＤＮＡ（標的遺伝子）が存在する場合には、蛍光強度が上がり、肉眼でも増幅の有無、いわゆる標的遺伝子の有無を確認することができる。
【００３７】
上記以外としては、ＬＡＭＰ反応後、反応産物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドあるいはサイバーグリーンで核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の結核菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーを使用することもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】
実施例１：ＬＡＭＰ反応１
ＬＡＭＰ反応プライマーとして用いる配列番号１から２７記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００１〜＃０２１（表１）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。図１にプライマーセット＃００１〜＃００７、図２にプライマーセット＃００８〜＃０１４、図３にプライマーセット＃０１５〜＃０２１のリアルタイム濁度測定の結果を示す。プライマーセット＃００７や＃０１９が比較的早くＬＡＭＰ反応が進んでいることが示された。このうち、まずプライマーセット＃００７の改良を進めることとした。
【００３９】
【表１】
実施例２：ＬＡＭＰ反応２：インナープライマーの改変
プライマーセット＃００７に使用されているインナープライマーを元に、インナープライマーとして新たに配列番号２８から３９記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃０３０〜＃０５３（表２）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表３と表４にまとめた。その結果、プライマーセット＃０４２が最も早くＬＡＭＰ反応が進行することが示された。
【００４１】
【表２】
【表３】
【表４】
実施例３：ＬＡＭＰ反応３：ループプライマーの改変１
プライマーセット＃０４２に使用されているループプライマーを改変するため、新たに配列番号４０から４７記載のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーまたはＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃０６５〜＃０７４（表５）を作製し、これを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した。各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表６にまとめた。その結果、プライマーセット＃０６５、＃０６６、＃０６７、＃０６８、＃０６９、＃０７１、＃０７２、＃０７３、＃０７４が比較的早くＬＡＭＰ反応が進んでいることが示された。このうち、プライマーセット＃０６５〜＃０６９、＃０７０〜＃０７４のうち反応の早く進んだプライマーセット各３セットを選択した。
【００４５】
【表５】
【表６】
実施例４：ＬＡＭＰ反応４：ループプライマーの改変２
実施例３にて選択したプライマーセット＃０６５、＃０６７、＃０６８、＃０７１、＃０７２、＃０７３に使用されているＦＬループプライマーとＢＬループプライマーとを組み合わせ、プライマーセット＃０８２〜＃０９０（表７）を調製した。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして２０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセットを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図４）。また、各プライマーセットにて行ったＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表８にまとめた。その結果、全てのプライマーセットが、実施例２で示したプライマーセット＃０４２よりもＬＡＭＰ反応が早く進む事が示された。中でもＦＬプライマーとして配列番号２３、ＢＬプライマーとして配列番号４４とを組み合わせたプライマーセット＃０８２がが最も早くＬＡＭＰ反応が進むことが示された。またプライマーセット＃０８４、＃０８５、＃０８８、＃０８９も濁度が０．１に到達する時間の平均が１８分台であり、比較的早くＬＡＭＰ反応が進むことが示された。この中で、２回の実験とも１８分台であったプライマーセット＃０８５も＃０８２と共に選択した。
【００４８】
【表７】
【表８】
実施例５：ＬＡＭＰ反応５：プライマーの濃度
実施例１、２、４にて選択したプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５のプライマーセットについて、ＦＬループプライマーとＢＬループプライマーの量を変えてＬＡＭＰ反応を行った。インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして各２０、４０、６０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセットを０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｐｇ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定し、ＬＡＭＰ反応の濁度が０．１に達した時間を表９にまとめた。ループプライマー量を２０ｐｍｏｌから４０ｐｍｏｌや６０ｐｍｏｌに増加させると、ＬＡＭＰ増幅に要する時間が短縮された。
【００５１】
【表９】
実施例６：ＬＡＭＰ反応６：交差性
インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５を０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰ、表１０記載の結核菌群（ＢＣＧ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）非定型抗酸菌（Ｍ．ｍａｌｍｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）のゲノムＤＮＡ １００ｐｇを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて４０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図５〜８）。その結果、いずれのプライマーセットとも結核菌群のゲノムＤＮＡをテンプレートにした場合のみＬＡＭＰによる増幅が進んでおり、作製したプライマーセットが結核菌群に特異性が高いことが示された。
【００５３】
【表１０】
実施例７：ＬＡＭＰ反応７：検出感度
インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含むプライマーセット＃００７、＃０４２、＃０８２、＃０８５を０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し、氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、 ２．８ｍＭ ｄＧＴＰ、２．８ｍＭ ｄＣＴＰ、２．８ｍＭ ｄＡＴＰ、２．８ｍＭ ｄＴＴＰを添加して全容量を２２μｌとした。これに１００ｐｇ（２．１×１０４個の細胞相当）から１００ｆｇ（２．１×１０１個の細胞相当）のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて６０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した（図９〜１２）。その結果、プライマーセット＃０４２、＃０８２、＃０８５の検出感度が、結核菌２１０個相当であることが示された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のプライマーを用いたＬＡＭＰ反応によれば、結核菌および結核菌群遺伝子を迅速、特異的かつ高感度に検出することが可能である。
【００５６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プライマーセット＃００１から＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図２】図２は、プライマーセット＃００８から＃０１４を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図３】図３は、プライマーセット＃０１５から＃０２１を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図４】図４は、プライマーセット＃０８２から＃０９０を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図５】図５は、プライマーセット＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図６】図６は、プライマーセット＃０４２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図７】図７は、プライマーセット＃０８２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図８】図８は、プライマーセット＃０８５を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇの結核菌群または非定型抗酸菌のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて４０分間、経時的に濁度を測定した。
【図９】図９は、プライマーセット＃００７を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１０】図１０は、プライマーセット＃０４２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１１】図１１は、プライマーセット＃０８２を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
【図１２】図１２は、プライマーセット＃０８５を使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定の結果を示す。１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇの結核菌群ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、６４℃にて１時間、経時的に濁度を測定した。
Claims (13)
- 配列番号４８の塩基配列を５’側に、配列番号４９の塩基配列を３’側に有し、全長が２９から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 配列番号５０の塩基配列を５’側に、配列番号５１の塩基配列を３’側に有し、全長が２６から５０塩基である一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有する、オリゴヌクレオチド。
- 配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
- ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
- ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅する方法。
- ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして請求項３記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと請求項４記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドとを組み合わせて使用する、請求項６に記載の方法。
- ＬＡＭＰ法におけるアウタープライマーとして配列番号１６から２１に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、請求項５〜７の何れかに記載の方法。
- ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２２から２７及び４０から４７に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いる、請求項５〜８の何れかに記載の方法。
- 試料中の結核菌群を検出するために行なう、請求項５〜９の何れかに記載の方法。
- 配列番号１から６、２８から３０及び３４から３６の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号７から１５、３１から３３及び３７から３９の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのインナープライマーとして使用するプライマーセット。
- 配列番号１６から１８の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１９から２１の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのアウタープライマーとして使用するプライマーセット。
- 配列番号２２から２４及び４０から４３の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２５から２７及び４４から４７の何れかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の核酸を増幅するためのループプライマーとして使用するプライマーセット。
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-
2003
- 2003-05-22 JP JP2003144712A patent/JP2004344065A/ja not_active Withdrawn
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