JP5670623B2 - パエシロマイセスバリオッティの検出方法 - Google Patents
パエシロマイセスバリオッティの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5670623B2 JP5670623B2 JP2009130744A JP2009130744A JP5670623B2 JP 5670623 B2 JP5670623 B2 JP 5670623B2 JP 2009130744 A JP2009130744 A JP 2009130744A JP 2009130744 A JP2009130744 A JP 2009130744A JP 5670623 B2 JP5670623 B2 JP 5670623B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- represented
- seq
- nucleotide sequence
- set forth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 title claims description 49
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 297
- 241000079253 Byssochlamys spectabilis Species 0.000 claims description 141
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 119
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 119
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 89
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 80
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 79
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 77
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 76
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 51
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 46
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 34
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 100
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 71
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 14
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 14
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 7
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000228339 Byssochlamys nivea Species 0.000 description 3
- 241001136508 Talaromyces luteus Species 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228337 Byssochlamys Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241001530809 Hamigera avellanea Species 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000228343 Talaromyces flavus Species 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M (3R,5S)-fluvastatin sodium Chemical compound [Na+].C12=CC=CC=C2N(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001194141 Aspergillus hiratsukae Species 0.000 description 1
- 241000131350 Aspergillus neoglaber Species 0.000 description 1
- 241001507862 Aspergillus spinosus Species 0.000 description 1
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 description 1
- 241000030451 Byssochlamys fulva Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000116139 Hamigera <sponge> Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241001507755 Neosartorya Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 1
- 241001136491 Talaromyces trachyspermus Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010252 digital analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 229960003765 fluvastatin Drugs 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- -1 pyrophosphate ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Description
(a)配列番号1〜4及び22〜33のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(b)配列番号1〜4及び22〜33のいずれかに記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
(c)配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
配列番号10に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号11に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
配列番号10に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号11に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットに関する。
DNAポリメラーゼと、
dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含むdNTPと、
を含むパエシロマイセス バリオッティ(Paecilomyces variotii)検出キットに関する。
本発明は、パエシロマイセス バリオッティ(Paecilomyces variotii)のβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわちパエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子配列中に存在するパエシロマイセス バリオッティに特異的な領域(可変領域)の塩基配列で表される核酸を用いてパエシロマイセス バリオッティの同定を行い、パエシロマイセス バリオッティを特異的に識別・検出する方法である。ここで、「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は他の真菌との間で大きく異なる。本発明における「パエシロマイセス バリオッティ」は、糸状不完全菌類のパエシロマイセス(Paecilomyces)に属する。また、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
(a)配列番号1〜4及び22〜33のいずれかに記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(b)配列番号1〜4及び22〜33のいずれかに記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス バリオッティの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
上記(a)又は(b)の塩基配列で表されるβ-チューブリン遺伝子の可変領域はパエシロマイセス バリオッティ固有の塩基配列であるため、他の通常の菌類のものとは明確に区別しうるものである。従って、本発明のパエシロマイセス バリオッティの検出方法によれば、パエシロマイセス バリオッティを特異的かつ迅速に検出できる。また、上記(a)又は(b)の塩基配列で表されるDNAは、パエシロマイセス バリオッティの検出に用いることができる。
配列番号3で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティEU037073株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号4で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM50293株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号22で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティNBRC4855株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号23で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM52147株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号24で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM52145株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号25で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM51028株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号26で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM51195株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号27で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM55619株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号28で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティNBRC5479株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号29で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM51027株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号30で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティNBRC31967株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号31で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティNBRC31685株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号32で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティSUM3339株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
配列番号33で示された塩基配列は、パエシロマイセス バリオッティIFM50294株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列も真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有することを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列もターゲットとする。
配列番号1〜4及び22〜33に記載の塩基配列及びその相補配列は、それぞれ、パエシロマイセス バリオッティのIFM40913株、IFM40915株、EU037073株、IFM50293株、NBRC4855株、IFM52147株、IFM52145株、IFM51028株、IFM51195株、IFM55619株、NBRC5479株、IFM51027株、NBRC31967株、NBRC31685株、SUM3339株及びIFM50294株から単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。これらの配列はパエシロマイセス バリオッティにおいて相同性が非常に高く、しかもパエシロマイセス バリオッティ以外の菌類とは相同性が低いため、被検体がこれらの塩基配列を有しているか否かを確認することで、パエシロマイセス バリオッティのみを特異的に識別・同定することが可能である。
また、配列番号1〜4及び22〜33に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基か欠失、置換若しくは付加された塩基配列又はその相補配列で表される核酸を用いても、同様にパエシロマイセス バリオッティのみを特異的に識別・同定することが可能である。
(以下、配列番号1〜4及び22〜33のいずれか記載の塩基配列又はその相補配列並びに配列番号1〜4及び22〜33のいずれか記載の塩基配列若しくはその相補配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつパエシロマイセス バリオッティの検出に使用できる塩基配列をまとめて「本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列」ともいう。)
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているRNA又はDNAシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス バリオッティの検出に使用できるものであればよい。すなわち、パエシロマイセス バリオッティの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でパエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられ、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドからなるプライマーとしては、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列から選択される領域であって、(1)パエシロマイセス バリオッティ(Paecilomyces variotii)に固有の遺伝子の塩基配列が10塩基前後連続して現れる領域を含む、(2)オリゴヌクレオチドのGC含量がおよそ30%〜80%となる、(3)オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、(4)オリゴヌクレオチドのTm値(融解温度:melting temperature)がおよそ55℃〜65℃となる、の4つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドが好ましい。
PCR法により増幅反応を行い、パエシロマイセス バリオッティを検出するためには、下記の(c)又は(d)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いるのがさらに好ましい。
(c)配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明のパエシロマイセス バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド対は、前記(c)のオリゴヌクレオチドと前記(d)のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対である。
配列番号5及び配列番号6で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス バリオッティのDNAの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記(c)及び(d)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号1に記載の塩基配列のうち、それぞれ64位〜85位まで、306位〜325位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス バリオッティを特異的に検出することができる。
(e)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
前記(e)及び(f)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号22に記載の塩基配列のうち、それぞれ98位〜116位まで、266位〜285位までの領域に対応する。(e)及び(g)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号28に記載の塩基配列のうち、92位〜110位まで、261位〜280位の領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス バリオッティを特異的に検出することができる。
検体にパエシロマイセス バリオッティが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してPCR反応を行い、得られたPCR反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的なDNA断片の増幅が認められる。具体的には、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約250bpのDNA断片の増幅が認められ、下記(e)のオリゴヌクレオチド、並びに(f)のオリゴヌクレオチド及び/又は(g)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約200bpのDNA断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にパエシロマイセス バリオッティが含まれているかを確認することができる。
上記6つの塩基配列領域は、下記のように選定することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
対象となる菌種遺伝子の塩基配列のアライメントを行い、Primer Explorer V4(栄研化学HP)等のソフトウエアを用いて、複数のプライマーを設計する。それらを合成し、実際にLAMP反応を行い、パエシロマイセス バリオッティを特異的に検出することができるプライマーを採用した。
詳細には、
1. Clustal Xなどのアラインメントソフトを用いて対象となる菌種の標的領域の塩基配列情報のアライメントファイルを作成する。
2. アライメントファイル中の情報をもとにPrimer Explorer V4(栄研化学HP)を用いてプライマーを設計する。
3. 設計されたプライマーセットの候補の中からより安定(dimer構造をとりにくい)で、伸長方向の先端に変異(種特異的な変異)を多く含むプライマーセットを選択する。特にインナープライマーの伸長方向に多くの変異を含んでいると近縁な種とも区別ができる可能性が高まる。プライマーセットの候補ができない場合には、Tm値やプライマーの塩基数についての設定をゆるく幅を持たせるようにし設計する。
4. 実際に選択したプライマーセットを用いて試験を行い、有効性を確認する。有効性が確認された後、ループプライマーを設計し、より反応時間が短くなるようにする。
一方、「アウタープライマー」とは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」(例えば前記F2領域又はB2領域)の5'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、F3領域より選ばれた塩基配列を含むプライマー及びB3領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーが挙げられる。ここで、F3領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーF(以下、F3プライマー)、B3領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーB(以下、B3プライマー)と呼ぶ。
ここで、各プライマーにおけるFとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示であり、各プライマーにおけるBとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示である。
ループプライマーの塩基配列は、上記ダンベル構造の5’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的領域の塩基配列又はその相補鎖から選択されてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは1種類であっても、2種類であってもよい。
パエシロマイセス バリオッティ検出用プライマーセット1
LPae1F3プライマー:ACGATCCTATAGGCAGACCA(配列番号10)
LPae1B3プライマー:CCAGCGGCCTATTTATTGGT(配列番号11)
LPae1FIPプライマー:CGTCTCTCTCGATTCCGTGTCGCCTTGACGGCTCTGGTGT(配列番号12)
LPae1BIPプライマー:CTCCGACCTTCAGCTCGAGCGGAGCGTTCCTCTTGGGAT(配列番号13)
パエシロマイセス バリオッティを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記のプライマーを用いるのが好ましい。
パエシロマイセス バリオッティ検出用ループプライマー
LPae1LFループプライマー:TCCCCAGATATCGTGTACTTAC(配列番号14)
LPae1LBループプライマー:ACTTCAACGAGGTAGTTGTTG(配列番号15)
図1に、パエシロマイセス バリオッティIFM40913株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
パエシロマイセス バリオッティ検出用プライマーセット2
LPae2F3プライマー:CGATATCTGGGGATGCTTCG(配列番号16)
LPae2B3プライマー:CGTCCATGGTACCAGGCT(配列番号17)
LPae2FIPプライマー:ATGCGCTCGAGCTGAAGGTCCGGAATCGAGAGAGAGACGACT(配列番号18)
LPae2BIPプライマー:TGATCCCAAGAGGAACGCCCCACGAGGAACGTACTTCTTGCC(配列番号19)
パエシロマイセス バリオッティを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記のプライマーを用いるのが好ましい。
パエシロマイセス バリオッティ検出用ループプライマー
LPae2LFループプライマー:GGAGGAGCCATTGTAGCTAA(配列番号20)
LPae2LBループプライマー:GAGCTCACCAATAAATAGGCC(配列番号21)
図2に、パエシロマイセス バリオッティIFM40913株及びIFM40915株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
また、本発明の別のパエシロマイセス バリオッティ検出用プライマーセットは、LAMP法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号20及び配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
上記プライマーセットを用いることにより、パエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むDNA断片をLAMP法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該DNA断片の増幅が確認された場合には、検体中にパエシロマイセス バリオッティが存在すると判断できる。
(a’)前記B2領域を3’側に有し、前記B1c領域を5’側に有する塩基配列
(b’)前記B3領域を有する塩基配列
(c’)前記F2領域を3’側に有し、前記F1c領域を5’側に有する塩基配列
(d’)前記F3領域を有する塩基配列
(e’)前記B1領域と前記B2領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
(f’)前記F1領域と前記F2領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
本発明のオリゴヌクレオチドは、LAMP法で用いられるプライマーとしてだけではなく、PCR法等のプライマー、核酸検出用プローブなどとしても用いることができる。
また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムが算出される。ピロリン酸マグネシウムが算出されると、反応液が肉眼で確認できる程度にまで白濁する。この白濁を指標として、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器を用いて検出できる。例えば、分光光度計を用いて400nmにおける吸光度の変化を確認することによって、核酸の増幅反応を検出することができる(国際公開第01/83817号パンフレット)。
検体からDNAを調製する方法としては、パエシロマイセス バリオッティの検出を行うのに十分な精製度及び量のDNAが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のRNAを逆転写して得られるDNAを用いることもできる。
例えば、本発明のキットには、LAMP法に用いることができる上記プライマーセット(好ましくは、配列番号10〜13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、配列番号10〜15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、配列番号16〜19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット、又は配列番号16〜21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセット)と、DNAポリメラーゼと、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含むdNTPとを含有する。好ましくは、前記プライマーセット、ループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド(好ましくは配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー)、核酸合成の基質となる4種類のdNTP(dATP、dCTP、dGTP及びdTTP)、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのDNAポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして含有される。本発明のキットには、本発明のプライマーによってLAMP反応が正常に進行することを確認するための陽性対照(ポジティブコントロール)を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだDNAが挙げられる。
また、本発明のパエシロマイセス バリオッティ検出用キットは、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対、前記の(e)及び(f)のオリゴヌクレオチド対、前記の(e)及び(g)のオリゴヌクレオチド対、又は前記の(e)、(f)及び(g)のオリゴヌクレオチド群からなる群より選ばれる少なくとも1対又は1群で示された検出用オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、PCR法によりパエシロマイセス バリオッティを検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素等)、酵素基質(dNTP,rNTP等)等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってPCR反応が正常に進行することを確認するための陽性対照(ポジティブコントロール)を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだDNAが挙げられる。
(1)標的遺伝子の解析
下記の方法によりパエシロマイセス バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
ポテトデキストロース寒天斜面培地にて供試菌を25℃で7日間、暗所培養した。菌体からGenとるくんTM(タカラバイオ(株)社製)を使用し、DNAを抽出した。目的とする部位のPCR増幅は、PuRe TaqTM Ready-To-Go PCR Beads(GE Health Care UK LTD製)を用いて、プライマーとしてBt2a(5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'、配列番号34)、Bt2b(5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'、配列番号35)(Glass and Donaldson,Appl Environ Microbiol 61:1323−1330,1995)を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度95℃、アニーリング温度59℃、伸長温度72℃、35サイクルで実施した。PCR産物は、Auto SegTM G−50(Amersham Pharmacia Biotech社製)を使用し精製した。PCR産物は、BigDye(登録商標)terminator Ver. 1.1(Applied Biosystems社製)を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC Ver.4”(Genetyx社製)を使用した。
上記で得られたパエシロマイセス バリオッティのβチューブリン配列、同様にして決定したハミゲラ アベラネラ(Hamigera avellanea)、タラロマイセス フラバス(Talaromyces flavus)、タラロマイセス ルテウス(Talaromyces luteus)、タラロマイセス トラキスパーマム(Talaromyces trachyspermus)、ビソクラミス ニベア(Byssochlamys nivea)、ビソクラミス フルバ(Byssochlamys fulva)のβチューブリン配列及び各種菌類の公知のβチューブリン配列をもとに、DNA解析ソフトウェア(Clustal W)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス バリオッティに特異的な塩基配列領域を決定した(配列番号1〜4及び22〜33)。決定した領域のうち、3’末端側でパエシロマイセス バリオッティの特異性が特に高い領域から、1)種固有の塩基配列が数塩基前後存在している、2)GC含量が概ね30%〜80%となる、3)自己アニールの可能性が低い、4)Tm値が概ね55〜65℃程度となる、の4つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして配列番号5及び6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む5組のプライマー対を設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩性製品、0.02μmolスケール)、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス バリオッティとその他の耐熱性菌及び一般カビとしては、表1及び表2に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて一般カビは25℃、耐熱性菌は30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae1Fプライマー)等のフォワードプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae1Rプライマー)等のリバースプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)98℃、10秒間の熱変性反応、(ii)63℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを30サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から10μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果5組設計したプライマーセットのうち配列番号5及び6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いた場合、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含む試料では、設計したプライマー対から予想されるサイズに遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。配列番号5及び6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いた場合のアガロースゲルの電気泳動図を図3及び図4に示す。なお、図3は表1に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図4は表2に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含む試料では、約250bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。
(1)プライマーの設計及び合成
上記実施例1で特定したパエシロマイセス バリオッティに特異的な塩基配列領域(配列番号1〜4及び22〜33)をもとに、配列番号10〜15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E Genome order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号10及び11;5pmolスケール、配列番号12及び13;40pmolスケール、配列番号14及び15:20pmolスケール;全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス バリオッティとその他の耐熱性菌としては、表3に記載の菌類を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(商品名 PrepMan ultra、アプライドバイオ社製)を用いて、菌体からゲノムDNA溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬200μlに菌体を懸濁し、100℃、10分間の加熱処理で菌体を溶解させ、14800rpmで5分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムDNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。このゲノムDNA溶液を鋳型DNAとして、下記のLAMP反応に用いた。
2x Reaction Mix(Tris−HCl(pH8.8) 40mM、KCl 20mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO4 20mM、0.2%Tween20、Betaine 1.6M、dNTPs 2.8mM:栄研化学株式会社;Loopamp DNA増幅試薬キット)12.5μl、配列番号10に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1F3プライマー:5pmol/μl)1μl、配列番号11に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1B3プライマー:5pmol/μl)1μl、配列番号12に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1FIPプライマー:40pmol/μl)1μl、配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1BIPプライマー:40pmol/μl)1μl、配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1LFループプライマー:20pmol/μl)1μl、配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae1LBループプライマー:20pmol/μl)1μl、Bst DNA Polymerase(8U/25μL、栄研化学株式会社製)1μl、及び上記で調製した鋳型DNA 1μlを混合し、蒸留水を加えて全量25μlの反応液とした。
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Loopamp RT−160C(栄研化学株式会社製)にて、63±2℃で60分間DNAの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した(波長:400nm)。
DNAの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図5に示す。
その結果、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを鋳型とした系のみで、反応開始23分前後から濁度の上昇、すなわちDNAの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムDNAを用いた系では、反応開始後40分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始45分前後から、パエシロマイセス バリオッティ以外のゲノムDNAを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
(1)プライマーの設計及び合成
上記実施例1で特定したパエシロマイセス バリオッティに特異的な塩基配列領域(配列番号1〜4及び22〜33)をもとに、配列番号16〜21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E Genome order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号16及び17;5pmolスケール、配列番号18及び19;40pmolスケール、配列番号20及び21:20pmolスケール;全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス バリオッティとその他の耐熱性菌及び一般カビとしては、表4に記載の菌類を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて一般カビは25℃、耐熱性菌は30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(商品名 PrepMan ultra、アプライドバイオ社製)を用いて、菌体からゲノムDNA溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬200μlに菌体を懸濁し、100℃、10分間の加熱処理で菌体を溶解させ、14800rpmで5分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムDNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。このゲノムDNA溶液を鋳型DNAとして、下記のLAMP反応に用いた。
2x Reaction Mix(Tris−HCl(pH8.8) 40mM、KCl 20mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO4 20mM、0.2%Tween20、Betaine 1.6M、dNTPs 2.8mM:栄研化学株式会社;Loopamp DNA増幅試薬キット)12.5μl、配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2F3プライマー:5pmol/μl)1μl、配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2B3プライマー:5pmol/μl)1μl、配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2FIPプライマー:40pmol/μl)1μl、配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2BIPプライマー:40pmol/μl)1μl、配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2LFループプライマー:20pmol/μl)1μl、配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(LPae2LBループプライマー:20pmol/μl)1μl、Bst DNA Polymerase(8U/25μL、栄研化学株式会社製)1μl、及び上記で調製した鋳型DNA 1μlを混合し、蒸留水を加えて全量25μlの反応液とした。
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Loopamp RT−160C(栄研化学株式会社製)にて、63±2℃で60分間DNAの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した(波長:400nm)。
DNAの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図6に示す。
その結果、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを鋳型とした系のみで、反応開始20分前後から濁度の上昇、すなわちDNAの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムDNAを用いた系では、反応開始後50分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始60分前後から、パエシロマイセス バリオッティ以外のゲノムDNAを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
(1)プライマーの調製
上記実施例1で特定したパエシロマイセス バリオッティに特異的な塩基配列領域(配列番号1〜4及び22〜33)のうち、3’末端側でパエシロマイセス バリオッティの特異性が特に高い領域から、1)種固有の塩基配列が数塩基前後存在している、2)GC含量が概ね30%〜80%となる、3)自己アニールの可能性が低い、4)Tm値が概ね55〜65℃程度となる、の4つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして配列番号7〜9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む5組のプライマー対を設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちパエシロマイセス バリオッティとその他の耐熱性菌としては、表5に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)15μl、無菌蒸留水11μlを混合し、配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae4Fプライマー、20pmol/μl)1μl、配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae4R-1プライマー、20pmol/μl)1μl及び配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae1R-2プライマー、20pmol/μl)1μlを加え、30μlのPCR反応液を調製した。その他4組のプライマー対についても同様にPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2.5μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果、5組のプライマーセットのうち配列番号7〜9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いた場合、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含む試料では、設計したプライマー対から予想されるサイズに遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。配列番号7〜9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いた場合のアガロースゲルの電気泳動図を図7に示す。図中の番号は表5記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、パエシロマイセス バリオッティのゲノムDNAを含む試料では、約200bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、上記パエシロマイセス バリオッティの菌株のゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。
Claims (17)
- 下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、
下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、
下記オリゴヌクレオチド(e)及び(g)、
下記オリゴヌクレオチド(e)、(f)及び(g)、
下記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)及び(k)、
下記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及び(m)、
下記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)及び(q)、並びに
下記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)、(q)、(r)及び(s)
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を核酸プライマーとして用いてβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認して同定を行い、パエシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)を検出する、パエシロマイセス・バリオッティの検出方法。
(c)配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(h)配列番号10に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号11に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号12に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチド(c)が配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(d)が配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(e)が配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(f)が配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(g)が配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである、
請求項1記載の検出方法。 - 前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1又は2記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(g)、並びに前記オリゴヌクレオチド(e)、(f)及び(g)からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1又は2記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)及び(k)を核酸プライマーとして用いてループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及び(m)を核酸プライマーとして用いてループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)及び(q)を核酸プライマーとして用いてループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)、(q)、(r)及び(s)を核酸プライマーとして用いてループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1記載の検出方法。
- パエシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)検出用オリゴヌクレオチド対又はパエシロマイセス・バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド群であって、
前記オリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群がそれぞれ核酸プライマーであり、
下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、下記オリゴヌクレオチド(e)及び(g)、又は下記オリゴヌクレオチド(e)、(f)及び(g)からなり、
パエシロマイセス・バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス・バリオッティを特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る、パエシロマイセス・バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド対又はパエシロマイセス・バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド群。
(c)配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入若しくは置換されておりかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチド(c)が配列番号5に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(d)が配列番号6に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(e)が配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(f)が配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチド(g)が配列番号9に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである、
請求項9記載のオリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群。 - 請求項9又は10記載のオリゴヌクレオチド対又はオリゴヌクレオチド群を含む、パエシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)検出キット。
- パエシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)検出用オリゴヌクレオチド群であって、
前記オリゴヌクレオチド群がそれぞれ核酸プライマーであり、
下記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)及び(k)、下記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及び(m)、下記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)及び(q)、又は下記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)、(q)、(r)及び(s)からなり、
パエシロマイセス・バリオッティのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス・バリオッティを特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る、パエシロマイセス・バリオッティ検出用オリゴヌクレオチド群。
(h)配列番号10に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号11に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号12に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及び(m)からなるオリゴヌクレオチド群がパエシロマイセス・バリオッティをループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法で検出するのに用いるオリゴヌクレオチド群である、請求項12記載のオリゴヌクレオチド群。
- 前記オリゴヌクレオチド(h)、(i)、(j)及び(k)からなるオリゴヌクレオチド群がパエシロマイセス・バリオッティをループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法で検出するのに用いるオリゴヌクレオチド群である、請求項12記載のオリゴヌクレオチド群。
- 前記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)、(q)、(r)及び(s)からなるオリゴヌクレオチド群がパエシロマイセス・バリオッティをループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法で検出するのに用いるオリゴヌクレオチド群である、請求項12記載のオリゴヌクレオチド群。
- 前記オリゴヌクレオチド(n)、(o)、(p)及び(q)からなるオリゴヌクレオチド群がパエシロマイセス・バリオッティをループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション(Loop mediated isothermal amplification)法で検出するのに用いるオリゴヌクレオチド群である、請求項12記載のオリゴヌクレオチド群。
- 請求項12〜16のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド群と、
DNAポリメラーゼと、
dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含むdNTPと、
を含むパエシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)検出キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009130744A JP5670623B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-05-29 | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008141500 | 2008-05-29 | ||
JP2008141500 | 2008-05-29 | ||
JP2009130744A JP5670623B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-05-29 | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010004881A JP2010004881A (ja) | 2010-01-14 |
JP5670623B2 true JP5670623B2 (ja) | 2015-02-18 |
Family
ID=41377183
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009130744A Active JP5670623B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-05-29 | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9102987B2 (ja) |
EP (2) | EP2325309B1 (ja) |
JP (1) | JP5670623B2 (ja) |
CN (2) | CN103451285B (ja) |
WO (1) | WO2009145314A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102272305B (zh) * | 2008-11-11 | 2013-12-04 | 花王株式会社 | 属于Geosmithia属的菌类的检测方法 |
JP6880554B2 (ja) * | 2016-03-09 | 2021-06-02 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット |
WO2018090085A1 (en) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Baraja Pty Ltd | An optical beam director |
CN109897908B (zh) * | 2019-03-18 | 2022-05-27 | 浙江农林大学 | 用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的qLAMP方法及所用引物 |
CN112877452A (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-01 | 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司 | 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2734844B1 (fr) | 1995-06-02 | 1997-08-22 | Unir | Procede de mise en evidence de microorganismes thermoresistants pouvant contaminer certaines denrees alimentaires |
GB9805918D0 (en) * | 1998-03-19 | 1998-05-13 | Nycomed Amersham Plc | Sequencing by hybridisation |
DE69937223T3 (de) | 1998-11-09 | 2011-05-05 | Eiken Kagaku K.K. | Verfahren zur synthese von nukleinsäuren |
DE19931883A1 (de) * | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Bayer Ag | DNA kodierend für Beta-Tubulin und deren Verwendung |
JP4437856B2 (ja) | 2000-02-29 | 2010-03-24 | 栄研化学株式会社 | 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法 |
DE60119533T2 (de) | 2000-05-01 | 2007-05-16 | Eiken Kagaku K.K. | Verfahren zur erkennung des produkts einer nukleinsäuresynthetisierungsreaktion |
DE60139331D1 (de) | 2000-09-19 | 2009-09-03 | Eiken Chemical | Verfahren zur polynukleotidsynthese |
JP4726548B2 (ja) | 2004-07-29 | 2011-07-20 | 日清食品ホールディングス株式会社 | 酵母及びカビ検出用のプライマー、酵母及びカビの検出方法、及び酵母及びカビ検出用キット |
CN1283799C (zh) * | 2005-01-31 | 2006-11-08 | 南京农业大学 | 禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因及其检测方法 |
JP4771755B2 (ja) | 2005-03-28 | 2011-09-14 | アサヒ飲料株式会社 | オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法及び同定方法 |
JP2009511086A (ja) * | 2005-10-17 | 2009-03-19 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出するための組成物及び方法 |
JP2007117022A (ja) * | 2005-10-28 | 2007-05-17 | Kirin Brewery Co Ltd | リステリア・モノサイトゲネス検出のためのプライマーセットおよび方法 |
JP2007174903A (ja) | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Mitsui Norin Co Ltd | 食品汚染糸状菌の鑑別方法及び鑑別キット |
JP2007189980A (ja) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Kirin Brewery Co Ltd | 黄色ブドウ球菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 |
JP2007274934A (ja) * | 2006-04-04 | 2007-10-25 | Nippon Meat Packers Inc | プライマーセット及び食中毒細菌の検出方法 |
JP2008005779A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-01-17 | Kirin Holdings Co Ltd | ラクトバチルス・ブレビス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 |
-
2009
- 2009-05-29 JP JP2009130744A patent/JP5670623B2/ja active Active
- 2009-05-29 CN CN201310381467.0A patent/CN103451285B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-29 EP EP09754822.6A patent/EP2325309B1/en not_active Not-in-force
- 2009-05-29 US US12/994,571 patent/US9102987B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-29 WO PCT/JP2009/059891 patent/WO2009145314A1/ja active Application Filing
- 2009-05-29 CN CN200980126162.7A patent/CN102083976B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-29 EP EP14161498.2A patent/EP2765191B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103451285A (zh) | 2013-12-18 |
US20110104699A1 (en) | 2011-05-05 |
EP2325309A4 (en) | 2011-12-14 |
EP2765191B1 (en) | 2015-12-30 |
EP2325309B1 (en) | 2014-10-22 |
WO2009145314A1 (ja) | 2009-12-03 |
EP2765191A1 (en) | 2014-08-13 |
JP2010004881A (ja) | 2010-01-14 |
US9102987B2 (en) | 2015-08-11 |
EP2325309A1 (en) | 2011-05-25 |
CN102083976B (zh) | 2014-05-07 |
CN103451285B (zh) | 2015-05-06 |
CN102083976A (zh) | 2011-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2009145279A1 (ja) | 耐熱性菌類の検出方法 | |
JP5670623B2 (ja) | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 | |
JP5548345B2 (ja) | 耐熱性菌類の検出方法 | |
US8748093B2 (en) | Method of detecting fungi belong to genus Geosmithia | |
JP5934038B2 (ja) | サーモアスカス属真菌の検出方法 | |
JP5654265B2 (ja) | ビソクラミス属に属する菌類の検出方法 | |
JP5548357B2 (ja) | アスペルギルスフミガタス(Aspergillusfumigatus)類縁菌の検出方法 | |
JP5548387B2 (ja) | タラロマイセス属に属する菌類の検出方法 | |
JP5548388B2 (ja) | ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルスフミガタスの検出方法 | |
JP5548389B2 (ja) | ビソクラミス属に属する菌類の検出方法 | |
JP5912425B2 (ja) | タラロマイセス属真菌の検出方法 | |
JP5697881B2 (ja) | パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 | |
JP5548386B2 (ja) | ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法 | |
JP5764619B2 (ja) | アスペルギルス・フミガタス(Aspergillusfumigatus)類縁菌の検出方法 | |
JP5799139B2 (ja) | パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 | |
JP5873356B2 (ja) | モニリエラ属真菌の検出方法 | |
JP5820658B2 (ja) | ネオサルトリア属真菌の検出方法 | |
JP2015195774A (ja) | アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法 | |
JP2015195773A (ja) | アスペルギルス・カーボナリウスの検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20110310 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120307 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140124 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140124 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140812 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141028 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20141028 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20141105 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141209 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141218 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5670623 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |