CN1283799C - 禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，有性态Gibberella zeae)抗多菌灵的检测基因及其检测方法，专用于抗苯并咪唑类杀菌剂的禾谷镰孢菌的检测。本发明在国际上首次报道并命名了禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因，全长997个核苷酸，含有1个内含子，编码313aa，检测基因包含需检测的抗药性突变位点。对多菌灵中等抗性菌株的β2-微管蛋白基因第33位苯丙氨酸密码字TTT突变为酪氨酸的密码字TAT，是对多菌灵抗药性的主要突变类型，占多菌灵的抗药性菌株群体的99%以上；直接从田间采集回来的病穗用ASO-PCR检测整个过程只需6h，检测准确率达99%，达到对多菌灵中等抗药性菌株的快速、简便、准确、灵敏的检测。
Description
一、技术领域
本发明是禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，有性态Gibberella zeae)抗多菌灵的检测基因及其检测方法，属于植物病原菌抗药性亚群体的检测方法，专用于检测抗多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的禾谷镰孢菌。
二、技术背景
小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum引起的一种世界性病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，它们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用20年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性亚群体，使药剂防治完全失去效果。对苯并咪唑类药剂的杀菌机制和抗药性机制研究表明，药剂主要是结合在病菌的β-微管蛋白上从而阻止细胞的有丝分裂，达到抑制病菌生长的目的。已有的对几种植物病原菌的分子生物学研究表明，病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性自然突变体主要是其β-微管蛋白196～202位氨基酸的改变，这些改变使该蛋白质的三维构象发生改变，从而阻止了药剂与靶标结合，使病菌表现抗药性。在人工诱变菌株中除上述位点外还涉及其它一些位点，如165，257等的氨基酸变异。通过定点突变也确认了198和200位氨基酸类型与抗感性密切相关。但是禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性机制并非像其它丝状真菌一样由β-微管蛋白198位等氨基酸突变所致。
早期检测病原群体中抗药性亚群体/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理策略，是延缓抗药性亚群体的发展，防止抗药性病害流行危害最有效的措施。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，难以早期发现抗药性亚群体的存在，也不能用于当年的抗药性短期预测。在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变的原理，应用核酸技术如寡核苷酸—聚合酶链式反应(ASO-PCR技术)等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测大量样本，使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的在于提供禾谷镰孢菌抗多菌灵的检测基因及一种快速检测方法。现有研究中尚没有用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性监测的基因；也没有ASO-PCR技术用于禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性检测。
技术方案 用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性监测的基因：本专利发明人在已经获得禾谷镰孢菌γ-、α-，α2-微管蛋白基因和微管相关蛋白基因全序列与该病原菌对多菌灵抗药性无关，发现未命名微管蛋白基因发生基因突变从而导致该病原菌对多菌灵抗药性，并将该未命名蛋白基因命名为β2-微管蛋白基因。
根据小麦赤霉病参考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白全基因(基因编号：FG06611.1)序列设计引物获得了β2-微管蛋白基因全序列。β2-微管蛋白基因，长度为997bp，相应的编码β2-微管蛋白的313个氨基酸.用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性检测的基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因编码的第33位氨基酸的抗药性基因突变位点由碱基TTT突变为碱基TAT，由氨基酸Phe突变为氨基酸Tyr，基因全序列见SEQ ID NO.1。抗性菌株的β2-微管蛋白基因还存在第64位谷氨酸密码字GAG突变为亮氨酸密码字CTG或者赖氨酸密码字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密码字突变为酪氨酸密码字TAC的次要类型。β2-微管蛋白基因编码33、64或66位氨基酸的密码子发生点突变是导致禾谷镰孢菌产生抗药性的主要原因。
ASO-PCR技术用于禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性检测
提取的基因组DNA或病粒可直接用于ASO-PCR禾谷镰孢菌对多菌灵中抗水平菌株的基因检测，其β2-微管蛋白基因，长度为997bp，相应的编码β2-微管蛋白的313个氨基酸，检测基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因编码的第33位氨基酸的抗药性突变位点Phe(TTT)密码字突变为Tyr(TAT)密码字，序列见SEQ ID NO.1。
待测样品处理过程：方法一：将病穗上的病粒或病组织在无菌操作下挑至马铃薯蔗糖培养基上，25度条件下培养3-5天进行基因组DNA提取：
配制提取缓冲液：100mM LiCl；10mM EDTA；10mM Tris-HCl，PH8.0；10g/L SDS，蒸馏水补充到所需体积；
配制抽提液：苯酚∶氯仿∶异戊醇体积为25∶24∶1；
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20mg/L RNAase；基因组DNA的提取：刮取在马铃薯蔗糖培养基生长的气生菌丝，加入1.0mL提取缓冲液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃温浴10min，10000rpm离心4min后，上清液用等体积上述抽提液抽提1～2次，上清液加等体积异丙醇沉淀干燥后溶于200μL TE，37℃水浴10min，取2μl用0.7g/100L的琼脂糖电泳检测全部有亮带，说明已提取出该病穗的基因组DNA；紫外分光光度计检测其基因组DNA的含量，提取的基因组DNA直接用于ASO-PCR检测。
方法二：直接将长有粉红色分生孢子的病穗，轻轻挑取粉红色部分放入0.1mL重蒸水，猛烈振荡1min，取出病组织，将悬浮液煮沸15min，涡旋2min即可直接用于ASO-PCR检测。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)直接用禾谷镰孢菌的基因组DNA为模板扩增β2-微管蛋白基因部分片段。50μL反应体系中含100ng模板DNA或者5μL煮沸的分生孢子悬浮液，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反应在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上进行，反应条件：94℃ 5min； 56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35个循环；72℃ 15min；4℃保存。取10μL PCR产物于1.5％(g/L)琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察照相。供试病穗100个，其中48个病穗用引物对MBCRF/MBCRR3能扩增出281bp的条带，为小麦赤霉病对多菌灵中抗的菌株。
同上利用上游引物MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3′)和MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)用于扩增对多菌灵敏感的小麦赤霉病菌株。供试病穗100个，其中52个病穗用引物对MBCRF/MBCRR3能扩增出281bp的条带，为小麦赤霉病对多菌灵敏感的菌株。
有益效果 本发明禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因及其检测方法，具有如下优点和积极效果：
1、本发明是国际上首次报道的禾谷镰孢菌的多菌灵抗药性的检测基因，其中包括β2-微管蛋白第33位氨基酸的突变位点(Phe突变为Tyr)，为今后禾谷镰孢菌的多菌灵抗药性菌株检测提供理论依据。
2、提供了两种禾谷镰孢菌的多菌灵抗药性菌株检测的方法。用煮沸的分生孢子悬浮液进行ASO-PCR检测仅需6h即可获得结果；用基因组DNA为模板进行ASO-PCR检测则要经过采集病穗、室内分离培养4天、PS液体培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL)培养至少5天获得菌丝方可获得检测结果。
3、目前国内其他研究单位均采用菌丝生长法检测禾谷镰孢菌抗药性，但该方法涉及采样、分离培养需要3d和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长，工作繁琐，费时费力。
随着杀菌剂抗药性分子机制研究的深入，利用分子生物学技术的检测方法快速、简便、有效地检测杀菌剂抗性成为研究热点。本发明从基因组的提取到ASO-PCR整个检测过程只需6h即可，且操作简单易学。因此ASO-PCR技术使快速、简便地检测和监测田间抗药性菌株成为可能，且方法简便便于基层工作人员掌握。这对及时了解抗药性病原群体的发展动态，及时、合理地指导科学用药，有效治理抗药性，以及降低成本和减少环境污染具有现实意义。
4、发明对100个样品的检测结果表明，其中48个样品为抗药性菌株，52个为敏感菌株，检测准确率与菌丝生长法相比高达99％。
本发明是禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，有性态Gibberella zeae)抗多菌灵的检测基因及其检测方法，专用于抗苯并咪唑类杀菌剂的禾谷镰孢菌的检测。国际上首次报道禾谷镰孢菌与抗多菌灵的β2-微管蛋白基因，全长997个核苷酸，含有1个内含子，编码313aa，包含需检测的抗药性突变位点。直接从田间采集回来的病穗用ASO-PCR检测整个过程只需6h，检测准确率达99％，达到对多菌灵中等抗药性菌株的快速、简便、准确、灵敏的检测。该基因由申请者命名为β2-微管蛋白基因。
禾谷镰孢菌的β2-微管蛋白基因编码一种负责该菌对多菌灵敏感性的微管蛋白。14个敏感菌株和21个抗药菌株的β2-微管蛋白基因序列分析表明，中抗菌株的β2-微管蛋白基因第33位苯丙氨酸密码字TTT突变为酪氨酸的密码字TAT，是田间对多菌灵抗药性的主要突变类型，占田间多菌灵的抗药性菌株群体的99％以上；抗性菌株的β2-微管蛋白基因还存在第64位谷氨酸密码字GAG突变为亮氨酸密码字CTG或者赖氨酸密码字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密码字突变为酪氨酸密码字TAC的次要类型。
四、附图说明
图1禾谷镰孢菌对多菌灵敏感菌株的β2-微管蛋白基因全序列。
注：双、单下划线分别表示内含子的5′和3′，左、右数字分别表示氨基酸和核苷酸数目。与禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084相比较，差异的核苷酸用方框表示。
图2禾谷镰孢菌的β2-微管蛋白基因PCR扩增片段电泳图。
在(a)，(b)图中的目标片段分别由引物uktF1和uktF1，uktF2和uktR2扩增。“M”，“1”，“2”，“3”，“4”，“5”，“6”分别为DL2000(宝生物工程(大连)有限公司)，ZF43(S)，ZF2032(S)，ZF2054(MR)，ZF2052(MR)，ZF43-2-5(HR)，JT04(HR)。
图3禾谷镰孢菌用引物MBCRF/MBCRR3的PCR产物电泳图谱
M表Marker，1-17依次代表FQ1-FQ17，FQ12-17为敏感菌株，FQ1-12为对多菌灵中抗菌株。。
图4禾谷镰孢菌用引物MBCSF/MBCRR3的PCR产物电泳图谱
M表Marker，1-24依次代表YC1-YC24。YC1-YC12为敏感菌株，YC13-24为对多菌灵中抗菌株。
五、具体实施方式
实施例1 PCR扩增获得与禾谷镰孢菌抗多菌灵性相关的β2-微管蛋白基因
1、检测基因的获得：根据小麦赤霉病参考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白全基因(基因编号：FG06611.1)序列设计引物。引物见表2。50μL扩增体系中含d2H2O 37.5μL，dNTP 0.2μM，10×buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton 100)5μL，MgCl2 2mM，primer X(所需扩增片段的上游引物)1μM，primer Y(所需扩增片段的下游引物)1μM，Taq(申能博彩生物技术有限公司)2.5U，模板DNA 100ng。引物对uktF1和uktR1扩增条件为94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，36次循环；72℃15min(去引物二级结构，热启动)。引物对uktF2和uktR2扩增条件为94℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，36次循环；72℃15min(去引物二级结构，热启动)。
β2-微管蛋白基因，长度为997bp，相应的编码313个氨基酸，中抗菌株第33位氨基酸的抗药性基因突变位点由碱基TTT突变为碱基TAT，由氨基酸Phe突变为氨基酸Tyr，基因全序列见SEQID NO.1。抗性菌株的β2-微管蛋白基因还存在第64位谷氨酸密码字GAG突变为亮氨酸密码字CTG或者赖氨酸密码字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密码字突变为酪氨酸密码字TAC的次要类型。总之，β2-微管蛋白基因编码33、64或66位氨基酸的密码子发生点突变是导致禾谷镰孢菌产生抗药性的主要原因。
取10μL PCR产物于1.0％(g/L)琼脂糖胶上电泳，电极缓冲液为0.5×TBE，标准分子量用DL2000(大连宝生工)。
从琼脂糖凝胶上将目的条带切割下来，用牙签捣碎后，加300μL TE和300μL Tris饱和酚，混匀后在-20℃下冻融2次，离心后用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提1次，2倍无水乙醇沉淀，加20μL TE溶解。回收纯化的PCR产物用pGEM-T Easy Vector(Promaga)连接，10μL反应体系包括：5μL 10×连接缓冲液(400mMTris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，5mMATP)；1μL T4DNA连接酶(MBI公司)；100ng纯化好的外源片段；40ng T-vector。混匀后4℃下放置过夜，转化感受态细胞Ecoli DH5α，在含Amp(50μg/mL)、X-gal(1.6mg)和IPTG(1.6mg)的LB平板上筛选白色菌落，碱裂解法提取质粒DNA验证阳性克隆。重组DNA用M13测序引物进行双向测序：由上海联合基因公司完成。
序列分析用DNAclub软件，检索GeneBank、EMBL基因数据库，敏感菌株的β2-微管蛋白基因核苷酸序列与禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白基因(基因编号：FG06611.1)核苷酸序列同源性99.3％，存在7个位点核苷酸差异，氨基酸序列同源性100％，与15种常见真菌β-微管蛋白基因氨基酸序列同源性70～78％，因此命名为β2-微管蛋白基因。
2、禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因编码(申请者命名)序列分析
利用2对引物(表2)对禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因扩增的PCR产物见图2，其测序结果(图1)显示禾谷镰孢菌的β2-微管蛋白基因全长997bp(图3)。与该菌的其他微管蛋白基因相比，包含1个内含子，55bp。外显子G+C的mol％为53.86，有2个编码区，分别位于1～548bp、604～997bp之间，共942bp，编码313aa(图2)。敏感菌株的β2-微管蛋白基因核苷酸序列与禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白基因(基因编号：FG06611.1)核苷酸序列同源性99.3％，存在7个位点核苷酸差异，氨基酸序列同源性100％；与该菌其他微管蛋白基因同源性比较，发现与TBB_GIBFU tubulinβchain氨基酸同源性高达78％，与其它成员氨基酸同源性仅为29-36％(表3)；与15种常见真菌β-微管蛋白基因氨基酸序列同源性70～78％(表4)，因此命名为β2-微管蛋白基因。比较了禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感和抗药菌株β2-微管蛋白基因的全序列，表明禾谷镰孢菌对多菌灵产生抗药性可能是由于β2-微管蛋白基因第33位苯并氨酸(Phe)、第64位谷氨酸(Glu)和66苯并氨酸(Pbe)密码字为发生点突变所致(表1)。
3、禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性机制
禾谷镰孢菌对多菌灵敏感性存在多个水平，在遗传表型上表现为对多菌灵的中、高抗。不同遗传表型菌株的β2-微管蛋白基因序列突变的位点不同(表1)。中抗菌株的第33位氨基酸苯丙氨酸密码子突变成酪氨酸，前者是非极性氨基酸，它的非极性来自氨基酸的苯丙基，而它所突变的氨基酸酪氨酸是不带电荷的极性氨基酸，极性来自于苯环上的对羟基，因此推断中抗菌株对多菌灵的抗药性可能是由于第33位氨基酸从疏水性变为亲水性，造成微管蛋白三维构象的改变，导致β2-微管蛋白基因编码的蛋白与多菌灵亲和性的改变，使其产生抗药性。
高抗菌株的第64位谷氨酸突变成亮氨酸，在Ph为7的条件下，由于谷氨酸带有第二个羧基，谷氨酸带有净负电荷并且具有很好的亲水性，而亮氨酸是非极性的氨基酸。因此，高抗菌株对多菌灵的抗药性可能是由于第64位氨基酸的突变导致微管蛋白三维构象的改变，造成多菌灵作用环境的剧烈改变，使β2-微管蛋白基因编码的蛋白与多菌灵亲和性剧减，使其产生高抗表型。而有的高抗菌株在该位点由谷氨酸突变成赖氨酸，后者是在Ph为7的条件下带有净正电荷，它所引起的蛋白质三维构象的改变更大，使多菌灵的作用环境改变更为剧烈。第64位氨基酸从敏感菌株带净负电荷亲水的谷氨酸→非极性疏水的亮氨酸(高抗菌株)→带正电荷亲水的赖氨酸(高抗菌株)突变造成多菌灵的工作环境改变幅度依次增大。第66位苯并氨酸(Phe)氨基酸密码字(TTC)突变为酪氨酸(TAC)氨基酸，前者是非极性氨基酸，它的非极性来自氨基酸的苯丙基，而它所突变的氨基酸酪氨酸是不带电荷的极性氨基酸，极性来自于苯环上的对羟基，因此推断中抗菌株对多菌灵的抗药性可能是由于第66位氨基酸从疏水性变为亲水性，造成微管蛋白三维构象的改变，导致未命名微管蛋白与多菌灵亲和性的改变，使其产生抗药性。这样64和66位形成了一个类似于其他植物病原菌对多菌灵所形成的“苯并咪唑类杀菌剂抗性框”(“Benzimidazole-resistance Box”)，但是该阅读框所包含的突变类型仅是小麦赤霉病菌对多菌灵等杀菌剂不同遗传表型的一部分。
用dnaman软件比较对多菌灵敏感和高度抗药性的禾谷镰孢菌的β2-微管蛋白基因序列，确定多菌灵的中等抗药性的产生是由于β2-微管蛋白第33位氨基酸由Phe(TTT)突变为Tyr(TAT)所致。因此根据突变位点设计特异性引物进行多菌灵的中等抗药性菌株的ASO-PCR扩增以检测抗药频率。
实施例2 2004年江苏省盐城市小麦上的禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性菌株和敏感菌株抗药性的快速检测
将2004年采集回来的病穗，随机选择100个，每穗挑取一个粉红色病麦粒直接放入0.1mL重蒸水，猛烈振荡1min，取出病麦粒，将悬浮液煮沸15min，涡旋2min即可直接用于ASO-PCR检测。即用
上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)
下游引物MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)。50μL反应体系中5μL煮沸的分生孢子悬浮液，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反应在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上进行，反应条件：94℃ 5min；56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35个循环；72℃ 15min；4℃保存。取l0μL PCR产物于1.5％(g/L)琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察照相。供试病穗100个，其中47个病穗用引物对MBCRF/MBCRR3能扩增出281bp的条带，为小麦赤霉病对多菌灵中抗的菌株。
同上利用上游引物MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3’)和MBCRR3(5’-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)用于扩增对多菌灵敏感的小麦赤霉病菌株。供试病穗100个，其中53个病穗用引物对MBCRF/MBCRR3能扩增出281bp的条带，为小麦赤霉病对多菌灵敏感的菌株。
传统的菌丝生长法相比准确率达99％(表5)，且从基因组的提取到ASO-PCR整个检测过程只需6h即可。
实施例3 2004年江苏省盐城等小麦上的禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性菌株和敏感菌株抗药性的快速检测
将2004年采集回来的病穗，随机选择80个，将病穗上的病粒或病组织在无菌操作下挑至马铃薯蔗糖培养基上，25度条件下培养3-5天进行基因组DNA提取：刮取在马铃薯蔗糖培养基生长的气生菌丝，加入1.0mL提取缓冲液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃温浴50min，10000rpm离心8min后，上清液用等体积上述抽提液抽提2次，上清液加等体积异丙醇沉淀干燥后溶于50μL TE，37℃水浴10min，取2μL用0.7g/100L的琼脂糖电泳检测全部有亮带，说明已提取出该病菌的基因组DNA；紫外分光光度计检测其基因组DNA的含量，提取的基因组DNA直接用于ASO-PCR检测。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3’)、MBCSF(5’-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3′)和下游引物MBCRR3(5’-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3’)直接以禾谷镰孢菌基因组DNA为模板扩增β-微管蛋白基因部分片段。50μL反应体系中含1-模板DNA，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反应在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上进行，反应条件：94℃ 5min； 56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35个循环；72℃ 15min；4℃保存。取10μLPCR产物于1.5％(g/L)琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察照相。
实施例4 2004年江苏省通州市小麦上的禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性菌株和敏感菌株抗药性的快速检测
将麦穗病变的部分分别切下一小块(30～50mg)，3.5％(mg/L)NaClO3消毒5min；在消毒后的禾谷镰孢病穗块中加入1.5mL提取缓冲液(100mmol/L LiCl；10mmol/L EDTA；10mmol/LTris-HCl，pH8.0；10g/L SDS，其余为水，高压灭菌)和0.2g已高压灭菌的石英砂，充分研磨；60℃温浴10min；10000rpm离心4min后；吸出700μL的上清液，用700μL的抽提液(苯酚、氯仿、异戊醇按体积比配制成25∶24∶1)抽提2次；再次吸出600μL的上清液，加600μL异丙醇；-20℃放置20min；10000rpm离心20min；弃上清液，干燥沉淀，溶于20μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20mg/L RNAase)，37℃水浴10min。3h内完成从病穗中直接提取基因组DNA。
将以上从病穗中提取的基因组DNA直接用于ASO-PCR检测。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)、MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGA TGGCCACC TT-3’)和下游引物MBCRR3(5’-CT TTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)直接以禾谷镰孢菌基因组DNA为模板扩增β-微管蛋白基因部分片段。50μL反应体系中含5μL模板DNA，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反应在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上进行，反应条件：94℃ 5min；56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35个循环；72℃ 15min；4℃保存。取10μL PCR产物于1.5％(g/L)琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察照相。传统的菌丝生长法相比准确率达96.25％，且从基因组的提取到ASO-PCR整个检测过程只需6h即可。
表1 负责小麦赤霉病菌对多菌灵不同敏感性水平的β2-微管蛋白基因的突变类型
*S，MR和HR分别表示小麦赤霉病野生菌株对多菌灵敏感、中抗和高抗。
表2 用于扩增β2-微管蛋白基因的PCR引物
| Primers | Primer Length | Nucleotide positions | Sequences 5’～3’ | Direction |
| uktF1uktR1uktF2UktR2 | 17bp25bp25bp17bp | 532～548976～9971～25606～590 | GCTTGTTCCGCCATCTTCTCGGGCTCCTCATGCTCCCAACTATGACGCACTCTCTCGGCGGTGGTACGGCTGGGAATTTCATT | +-+- |
表3 禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因与该菌其他微管蛋白基因同源性比较
| 基因编号 | 基因* | 氨基酸同源性(％) | EST序列核苷酸同源性(％) |
| FG00639 1FG00639.1FG09530.1FG09993.1 | TBA2_EMENI tubulin α2 chainTBA_SORMA tubulin αchainTBB_GIBFU tubulin β chainTBG_NEUCR Tubulin γ-chain(γ-tubulin) | 36337829 | 52497543 |
*http：//www.broad.mit.edu/cgi-bin/antion/fusarium/findfeatures.cgi？page＝showfeatures&FEATURETYPES＝GENE&GENEBYHMMER＝1&GENEPFAMNAME＝tubulin
表4 禾谷镰孢菌与其他重要真菌的β-微管蛋白基因的同源性比较
| 真菌 | 基因 | 氨基酸水平同源性 | 基因登陆号 | 内含子数目和大小 |
| MycosphaerellagraminicolaMicrobotryum violaceumPenicillium digitatumGibberella pulicarisMelampsora liniMicrobotryum violaceumBotryotinia fuckelianaGalactomyces geotrichumCoprinus cinereusColletotrichumgloeosporioides f.sp.aeschynomeneC.gloeosporioides f.sp.aeschynomeneAspergillus parasiticusM.piniSchizosaccharomycespombePleurotus sajorcajuGalactomyces geotrichum | β-tubulin(tub1)β-tubulintub2 genefbrβ-tubulinβ-tubulin(tub2)β-tubulin(tub1)β-tubulinβ-tubulin(benA)**β-tubulinβ1-tubulin**β-tubulin**(tub2)β-tubulintub1β-tubulin**β-tubulin(tub1)β-tubulin(nda3)β-tubulinβ-tubulin(gβ2) | 78707578727078717178727677737373 | AY547264AAS55060.1AF295595.1AAK97098.1D78154.1BAA11229.1AF484166.1AAN03787.1AF317682.1AAG33239.1AF323129.1AAL36620.1U27198.1AAB60307.1S69624.1AAB20556.2AB000116.1BAA19057.1U14138.1AAA62875.2M90977.1AAA33044.1L49386.1AAB41258.1AF044975.1AAC02112.1AF042827.1AAC21454.1AF132911.1AAD21093.1S69627.1AAB20557.1 | 6(49，67，60，57，65，47)14(93，303，71，97，65，88.7573，65，75，80，74，68，76)7(94，71，62，54，66，52，68)3(197，57，48)8(78，74，117，98，106，86，62，72)--------*6(135，53，69，56，52，56)4(74，102，56，85)8(76，65，179，62，54，51，58，54)6(94，58，71，56，71，53)3(73，44，55)7(128，70，111，81，63，60，54)5(128，57，58，59，54)5(36，51，41，89，75)9(67，63，53，53，56，56，58，56，56)1(41) |
*，因没有获得该基因的全序列，没有统计。**，对多菌灵的抗药性基因。
表5 二种方法检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性的比较
| 方法 | 总菌株数 | 表现抗药性菌株数 | 表现敏感性菌株数 | 与菌丝生长法比较的准确率(％) |
| 菌丝生长法ASO-PCR | l00100 | 4847 | 5253* | /99 |
*.多出的一个“敏感菌株”经过扩增，测序，确认为β2-微管蛋白基因的第66位苯并氨酸(Phe)氨基酸密码字(TTC)突变为酪氨酸(TAC)氨基酸，是多菌灵的抗性菌株。
序列表
<110>南京农业大学
<120>禾谷镰孢菌抗多菌灵的检测基因及其检测方法
<130>说明书
<140>0.0
<141>2005-01-24
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>997
<212>DNA
<213>禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，有性态Gibberella zeae)对多菌灵的中抗菌株
<220>
<221>β2-微管蛋白基因
<222>(1)..(997)
<223>
<400>1
atgacgcact ctctcggcgg tggtaccggt tccggtatgg gaacgcttct tctgtccaag 60
atccgcgagg agttccccga tcgcatgatg gccacctatt ccgttatgcc ctcgcccaag 120
gtttccgata ccgttgttga accttacaac gccactttgt ctctgaacca gctcgtcgag 180
aactctgacg agaccttctg tatcgataac gaggctctgt acgatatcta cgagaggacc 240
ctcaagatcg ccgatccttc gtacgccgat ctcaactacc tgatttctac cgtcatggcc 300
ggtgtgacga catgtttccg attccccgga cagctcaact cggatctgcg aaagctcgct 360
gttaacatga ttccgttccc ccgacttcac ttcttcatgg tcggatttgc ccctctgact 420
ggtcgcaaca tgaagacctt ccagcacgtt accgtccccg ggcttgctca gcagattttc 480
gacaacaaga acatcatggc cgctggcgat ttccgcaacg gacgatacct cgcttgttcc 540
gccatcttgt aagttttgaa actgaccaaa tttcaaaaac acaaaaacta atgaaattcc 600
cagccgtgga cgtctctcaa caaaggagat tgaggaccag atgctcaagg ttcagaccaa 660
gaactccgag tactttgtcg actggatccc caacaacgtc caaacttccg tctgttccgt 720
gcctccccgc ggtctcgaca tgtccgccac tttcgtcggc aactccaccg ccgtccagga 780
gatcttcaag cgtgtcgacg accagttctc agccatgttc cgtcgcaagg ctttcttgca 840
ttggtacaca agcgagggta tggacgagat ggaattcacc gaggcccagt ccaacttgca 900
cgacttggtt tccgagtacc agcaatacca agacgccgac atcgacgacg aggctgagga 960
gtacgaggag ggtgagcccg aggagtacga gggttga 997
Claims (2)
1、禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因，长度为997bp，由命名为β2-微管蛋白基因突变而来，相应的编码β2-微管蛋白的313个氨基酸，该基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因编码的第33位氨基酸的抗药性基因突变位点，其位点密码子由碱基TTT突变为碱基TAT，该位点密码子编码的氨基酸Phe突变为氨基酸Tyr，基因全序列见SEQ ID NO.1。
2、权利要求1所述禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因用于检测小麦赤霉病对多菌灵敏感的菌株的方法，包括待测样品处理、PCR扩增程序，其特征在于：
1)将病穗上的病粒或病组织在无菌操作下挑至马铃薯蔗糖培养基上，25℃条件下培养3-5天进行基因组DNA提取：
2)配制提取缓冲液：100mM LiCl；10mM EDTA；10mM Tris-HCl，PH8.0；10g/L SDS，蒸馏水补充到所需体积；
3)配制抽提液：苯酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1；
4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20mg/L RNAase；
5)基因组DNA的提取：刮取在马铃薯蔗糖培养基生长的气生菌丝，加入1.0mL提取缓冲液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃温浴10min，10000rpm离心4min后，上清液用等体积上述抽提液抽提1～2次，上清液加等体积异丙醇沉淀干燥后溶于200μLTE，37℃水浴10min，取2μL用0.7g/100L的琼脂糖电泳检测全部有亮带，说明已提取出该菌基因组DNA；紫外分光光度计检测其基因组DNA的含量，提取的基因组DNA用于寡核苷酸—聚合酶链式反应ASO-PCR检测；
6)或者将长有粉红色分生孢子的病穗，轻轻挑取粉红色部分放入0.1mL重蒸水，猛烈振荡1min，取出病组织，将悬浮液煮沸15min，涡旋2min即可直接用于ASO-PCR检测；
7)用引物对
上游引物MBCRF 5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′或
MBCSF 5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3’
下游引物MBCRR3 5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′
能扩增出281bp条带的为小麦赤霉病对多菌灵敏感的菌株。
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