CN110169324B - 一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，按照如下步骤实现：(1)选取稻曲病病粒：(2)制备稻曲病菌粗毒素溶液；(3)水稻种子发芽；(4)测定毒素对种子初生根的抑制，得到抑制率。通过比较各待测品种的抑制率对稻曲病抗性进行比较。本发明以主根长度一致的发芽水稻种质为材料，避免了由于种质间本身发芽特性差异带来的试验误差，提高了试验准确性，利用稻曲病菌粗毒素对稻种发芽的抑制水平与品种抗性之间存在相关性原理，采用稻曲病菌粗毒素作为选择压力筛选，比较和评价水稻种质稻曲病抗性，大大减少了工作量，7天左右即可完成，极大缩短鉴定周期，具有准确、快速、方便等优点，为稻曲病抗源筛选和抗性鉴定提供新途径。

Description

一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法

技术领域

本发明涉及一种水稻种质稻曲病抗性比较方法，尤其是指一种利用稻曲病菌粗毒素作为选择压力，快速比较水稻种质稻曲病抗性的鉴定方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

稻曲病(False Smut of Rice,FSR)是无性阶段半知菌亚门绿核菌属(Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak)引起的水稻穗部真菌性病害，广泛分布于亚洲、非洲、南美洲、欧洲等水稻主产区的40多个国家，在中国、菲律宾、日本发生较重，随着高产优质水稻的大面积推广，和施肥量不断提高，稻曲病在我国呈逐年加重趋势，在辽宁、黑龙江、湖南、云南、江苏、浙江、广东等省普遍发生，给水稻生产带来巨大损失。

危害：稻曲病导致空瘪率增加，千粒质量下降，降低水稻产量，病粒拌种能不同程度地降低水稻种子发芽率，同时稻曲病病原菌次生代谢物稻曲病菌毒素(Ustiloxins)，是一类具有阻断真核细胞有丝分裂活性物质，有较强的细胞毒性，对人畜和植物有毒害作用。

抗性遗传分析：不同年份、不同地理分布的稻曲病菌的遗传相似程度很高，同一地区遗传稳定，稻曲病菌与水稻品种不存在专化性互作，绝大多数抗源材料对稻曲病的抗性遗传为细胞核显性遗传，对F₂代单株分别采用0粒、1粒稻曲球两种抗感划分标准进行质量性状分析，得出抗病品系对稻曲病的抗性分别由1对、2对显性基因控制。目前关于水稻病害的抗病性研究，普遍采用病穗率或病情指数作为鉴定指标，但在分离群体中这种指标呈连续变异，表现出数量性状遗传特征，人为划分抗感标准存在一定难度，主观性较强，分析结果常存在争议，尤其是处于抗感分界附近的材料，难以判断是抗病还是感病。方先文等构建了P₁、P₂、F₁、F₂、B₁、B₂六世代数量性状遗传体系并对其进行人工注射接种稻曲病菌，采用章元明等提出的主基因多基因混合遗传模型分离分析方法以水稻单株抗病性为指标进行分析，并用IECM法计算估计分布参数，结果表明组合早光头粳/粤对稻曲病的抗性遗传符合E-1模型，即2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因遗传模型，第1对主基因以显性效应为主，加性效应次之，2对主基因以显性效应为主，加性效应不明显，按分离世代计算，主基因遗传率82.84％，李余生等构建了数量性状遗传体系，抗病、感病亲本及其F₁₀代重组自交系群体，人工接种稻曲病单孢菌株，以病情指数为指标，分析得出：稻曲病的抗性遗传符合遗传模型，即对主基因多基因混合遗传模型，两对主基因间表现为等加性效应，主基因遗传率为多基因遗传率为，抗性遗传主基因效应明显。提示抗稻曲病育种需要考虑主基因和多基因对抗病性的共同影响。他们通过定位检测到qFsr1、共个5抗稻曲病的位点，分别位于第1、4、10、11、12染色体上。

抗病鉴定技术：选用抗性品种是预防稻曲病最经济、有效的方法，不同水稻品种对稻曲病的抗性差异很大，目前尚未发现对稻曲病免疫的品种。近年来，很多地方都进行了水稻品种抗稻曲病测试，筛选到一些不同抗性的品种，按品种类型统计，籼稻抗性好于粳稻，中早熟品种抗病性较强，晚熟品种易感病，穗型直立密穗的品种发病率高，水稻品种的抽穗时间越长，齐穗期越晚，发病越重。

近年来，稻曲病在我国呈显著上升趋势，已经成为水稻生产上的主要病害，因此，安全有效地控制稻曲病对我国粮食安全和食品安全具有重大意义。利用品种的抗病性粳型防治是最经济、有效的防治措施，而抗源的鉴定、筛选与评价是选育抗病品种的前提和关键，抗病性鉴定是对材料的抗病性进行评价与鉴定，是抗病育种的前提，目前稻曲病抗病性鉴定主要采用人工诱发鉴定，人工诱发鉴定主要是分离培养稻曲病菌，接种在待鉴定的材料上，田间调查发病情况并作统计分析，由于稻曲病的人工接种发病率较低，且重复性差，国内学者目前还没有研究出最合适接种技术，此外，品种对稻曲病的抗性鉴定目前也没有鉴别寄主及统一的抗性分级标准，接种鉴定的时期也没有定论，接种用的接种体也不一致，目前用于接种的接种体主要是厚垣孢子悬浮液、分生孢子悬浮液2种。病害分级标准尚未统一，有采用4级分类的，有采用5级分类的，有采用6级分类的，接种方法有注射接种、喷雾接种、涂抹接种等，由于缺乏有效的鉴定方法，人工接种存在周期较长、工作量大、发病率低、费用高等问题，给水稻种质稻曲病抗性鉴定带来困难，导致水稻稻曲病抗性遗传研究滞后，抗病育种工作开展缓慢，严重影响了抗病育种和抗性品种利用。

如马慧、刘培斌、刘少霞、陈丽静、姜明兰、钟文田在《辽宁农业科学》2001(2):40～41发表的《稻曲病菌粗毒素的初步研究》中研究了稻曲病菌粗毒素的制备及生物测定方法。结果表明，以PD为液体培养基振荡培养21d后经离心、过滤、高压灭菌制得的粗毒素对水稻种子的萌发、幼苗生长及愈伤组织的生长具有毒害作用。该技术的分离纯化后对粗毒素进行培养提取，分离纯化需要几个月的时间，粗毒素的培养提取需要21d的时间，周期较长，并且采用液体培养，成本高。

发明内容

本发明的目的是针对现有水稻稻曲病人工接种鉴定面临的接种发病率低、试验重复性差、生长周期长、鉴定成本高的问题，提供一种稻曲病抗性高效快速的鉴定比较方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是通过以下方式实现的：

一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，按照如下步骤实现：

(1)选取稻曲病病粒：在稻曲病发病水田，选取大小均匀的稻曲病粒，装入纸袋，存放4℃冰箱内备用；

(2)制备稻曲病菌粗毒素溶液；

(3)水稻种子发芽；

(4)测定毒素对种子初生根的抑制，得到抑制率。

进一步地，所述步骤(2)的具体步骤为：称取3.0g晒干的步骤(1)的稻曲病病粒，在研钵内充分碾磨至粉碎，转至250mL锥形瓶，加入100mL蒸馏水，置于摇床中130r/min振荡120min，然后用双层无菌纱布过滤，所得滤液4000r/min离心20min，收集上清液，将上清液重复离心1次所得上清液用0.22μm孔径的无菌过滤器过滤3次，得到粗毒素浓度为0.03g/mL无菌粗毒素溶液，将其分装后置于4℃冰箱中保存备用。

进一步地，所述步骤(3)水稻种子发芽的具体步骤为：采用恒温箱法对待测种子进行发芽，取大发芽盒3个(尺寸为13cm×19cm)，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，随机取有代表性的种子样品900粒充分混匀，每个大发芽盒均匀摆放300粒种子，共3次重复，加足水后，盖上发芽盒盖，放置于恒温箱内，温度保持30℃的条件下，发芽48小时后，从3个发芽盒中共选取根长一致的发芽种子600粒备用。

进一步地，所述步骤(4)的具体步骤为：

a、取方形透明塑料发芽皿(尺寸为12cm×12cm)6个，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，将待测水稻种质的步骤(3)选取的发芽种子100粒均匀放于发芽皿内，在其中3个发芽皿中每个发芽皿用胶头滴管滴入30mL稻曲病菌粗毒素溶液，盖上发芽皿盖，放置于恒温箱内，30℃保湿培养，培养72h；

b、另外3个发芽皿内的发芽种子以无菌水处理作为对照，共3次重复，置于恒温箱内，30℃保湿培养72h，将粗毒素溶液和无菌水对照培养的发芽皿取出，置于滤纸上吸干多余的水分，采用0.1mm直尺分别测定粗毒素溶液处理后初生根的长度和对照培养后初生根的长度，计算抑制率，根生长抑制率越高，品种对毒素的敏感度越高，抗病性越差；

c、计算抑制率：抑制率(％)＝(对照培养后初生根的长度-毒素处理后初生根的长度)/(对照培养后初生根的长度-开始培养时对照初生根的长度)×100。

进一步地，所述步骤(1)中的选取大小均匀的稻曲病粒是指选取病粒直径为0.6cm-1.2cm的稻曲病粒。

进一步地，所述步骤(3)中：

所述有代表性的种子是指籽粒成熟度好，大小均一的种子；根长一致的发芽种子是指，采用直尺测量主根长，选取主根长长度相同的发芽种子。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用稻曲病粒直接制备粗毒素，因为稻曲病粒上本身就存在毒素，不再采用液体培养后提取粗毒素，粗毒素溶液的制备基本1天左右就可完成，缩短了粗毒素的培养周期以及降低了成本。本发明以主根长度一致的发芽水稻种质为材料，避免了由于种质间本身发芽特性差异带来的试验误差，提高了试验准确性，利用稻曲病菌粗毒素对稻种发芽的抑制水平与品种抗性之间存在相关性原理，采用稻曲病菌粗毒素作为选择压力筛选，比较和评价水稻种质稻曲病抗性，大大减少了工作量，7天左右即可完成，极大缩短鉴定周期，具有准确、快速、方便等优点，为稻曲病抗源筛选和抗性鉴定提供新途径。

附图说明

图1是本发明的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

参照图1，采用本发明的稻曲病抗性快速比较方法对黑龙江省粳稻品种五优稻四号、松粳6号、松粳9号、松粳14、松粳15的稻曲病抗性比较。上述水稻品种适宜黑龙江省第一积温带种植，但生产上对他们的稻曲病抗性一无所知，现采用本发明的稻曲病抗性快速比较方法进行稻曲病抗性比较。每个品种分别采用本发明的抗性快速比较方法得到对初生根的抑制率。

一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，按照如下步骤实现：

(1)选取稻曲病病粒：在稻曲病发病水田，选取大小均匀的稻曲病粒，病粒直径为0.6cm-1.2cm，装入纸袋，存放4℃冰箱内备用；

(2)制备稻曲病菌粗毒素溶液：称取3.0g晒干的步骤(1)的稻曲病病粒，在研钵内充分碾磨至粉碎，转至250mL锥形瓶，加入100mL蒸馏水，置于摇床中130r/min振荡120min，然后用双层无菌纱布过滤，所得滤液4000r/min离心20min，收集上清液，将上清液重复离心1次所得上清液用0.22μm孔径的无菌过滤器过滤3次，得到粗毒素浓度为0.03g/mL的无菌粗毒素溶液，将其分装后置于4℃冰箱中保存备用；

(3)水稻种子发芽：采用恒温箱法对待测种子进行发芽，取大发芽盒3个(大发芽盒的尺寸为13cm×19cm)，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，随机取有代表性的种子样品900粒充分混匀，每个大发芽盒均匀摆放300粒种子，共3次重复，加足水后，盖上发芽盒盖，放置于恒温箱内，温度保持30℃的条件下，发芽48小时后，从3个发芽盒中共选取根长一致的发芽种子600粒备用。

(4)毒素对种子初生根的抑制：

a、取6个方形透明塑料发芽皿(发芽皿的尺寸为12cm×12cm)，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，其中3个发芽皿内分别将待测水稻种质的步骤(3)选取的发芽种子100粒均匀放于发芽皿内，用胶头滴管滴入30mL稻曲病菌粗毒素溶液，盖上发芽皿盖，共3次重复，放置于恒温箱内，30℃保湿培养，培养72h；

b、另外3个发芽皿内的发芽种子以无菌水处理作为对照，共3次重复，置于恒温箱内，30℃保湿培养72h，将粗毒素溶液和无菌水对照培养的发芽皿取出，置于滤纸上吸干多余的水分，采用0.1mm直尺分别测定粗毒素溶液处理后初生根的长度和对照培养后初生根的长度，计算抑制率，根生长抑制率越高品种对毒素的敏感度越高，抗病率越差；

c、计算抑制率：抑制率(％)＝(对照培养后初生根的长度-毒素处理后初生根的长度)/(对照培养后初生根的长度-开始培养时对照初生根的长度)×100。

步骤(3)中所述有代表性的种子是指籽粒成熟度好，大小均一的种子；

根长一致的发芽种子是指，采用直尺测量主根长，选取主根长长度相同的发芽种子(该根长为开始培养时对照初生根的长度)，通过无菌发芽，选择长势一致的发芽种子。

(5)比较各品种的抑制率，对各水稻品种的稻曲病抗性进行比较，抑制率越高，抗病力越差。

通过上述方法对黑龙江省粳稻品种五优稻四号、松粳6号、松粳9号、松粳14、松粳15的初生根抑制率的鉴定结果如表1所示：

表1稻曲病菌粗毒素对不同水稻品种初生根抑制率

品种	松粳14	松粳6号	松粳9号	五优稻4号	松粳15
						初生根抑制率/％	51.7	66.8	67.2	72.3	74.4

由表1可见，不同水稻品种经稻曲病菌粗毒素溶液处理后初生根抑制率不同，品种间对稻曲病的抗性由强到弱顺序为松粳14＞松粳6号＞松粳9号＞五优稻4号＞松粳15，抑制率越高，品种对毒素的敏感度越高，抗病力越差。

在本发明的步骤(2)最终稻曲病菌粗毒素溶液浓度选定为0.03g/mL，稻曲病菌粗毒素溶液浓度的确定方法具体为：

选取松粳15、五优稻4号、松粳21、松粳3号、536、松粳12、松粘1号、松粳香2号、653、428为试验对象，每个试验对象分别制取了如表2所示的7个浓度梯度的稻曲病菌粗毒素溶液，具体制备方法如下：

选取稻曲病病粒：在稻曲病发病水田，选取大小均匀的稻曲病粒，病粒直径为0.6cm-1.2cm，装入纸袋，存放4℃冰箱内备用；

分别称取晒干的稻曲病粒0.5g、1g、2g、3g、4g、5g，记为1号、2号、3号、4号、5号、6号，另外1个用无菌水做空白对照，将6组稻曲病粒分别放在研钵内充分碾磨至粉碎，然后分别再转至250mL锥形瓶，每组中加入100mL蒸馏水，置于摇床中130r/min振荡120min，然后用双层无菌纱布过滤，所得滤液4000r/min离心20min，收集上清液，将上清液重复离心1次所得上清液用0.22μm孔径的无菌过滤器过滤3次，得到粗毒素浓度为0.005g/mL、0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL的无菌粗毒素溶液，将每个浓度的无菌粗毒素溶液分装后置于4℃冰箱中保存备用；

然后分别用不同浓度的稻曲病菌粗毒素溶液对松粳15、五优稻4号、松粳21、松粳3号、536、松粳12、松粘1号、松粳香2号、653、428进行初生根的抑制实验(本发明的步骤(4))，得出不同浓度的稻曲病菌粗毒素溶液对各水稻品种的初生根抑制率如表2所示：

表2添加梯度浓度稻曲病菌粗毒素各水稻品种的初生根抑制率

由表1，稻曲病菌粗毒素对水稻种质发芽存在明显的抑制作用，不同抗性种质抑制率不同，随着粗毒素溶液浓度的升高，抑制作用越强，毒素对初生根抑制率越高，但是在0.03g/mL浓度作用下的抑制率与其他浓度下的抑制率差异显著，因此，我们将浓度为0.03g/mL粗毒素溶液定为稻曲病抗性快速鉴定选择压力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，按照如下步骤实现：

(1)选取稻曲病病粒：在稻曲病发病水田，选取大小均匀的稻曲病粒，装入纸袋，存放4℃冰箱内备用；

(2)制备稻曲病菌粗毒素溶液；

(3)水稻种子发芽；

(4)测定毒素对种子初生根的抑制，得到抑制率；

所述步骤(2)的具体步骤为：称取3.0g晒干的步骤(1)的稻曲病病粒，在研钵内充分碾磨至粉碎，转至250mL锥形瓶，加入100mL蒸馏水，置于摇床中130r/min振荡120min，然后用双层无菌纱布过滤，所得滤液4000r/min离心20min，收集上清液，将上清液重复离心1次所得上清液用0.22μm孔径的无菌过滤器过滤3次，得到粗毒素浓度为0.03g/mL无菌粗毒素溶液，将其分装后置于4℃冰箱中保存备用。

2.如权利要求1所述的一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，其特征在于，所述步骤(3)水稻种子发芽的具体步骤为：采用恒温箱法对待测种子进行发芽，取大发芽盒3个，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，随机取有代表性的种子样品900粒充分混匀，每个大发芽盒均匀摆放300粒种子，共3次重复，加足水后，盖上发芽盒盖，放置于恒温箱内，温度保持30℃的条件下，发芽48小时后，从3个发芽盒中共选取根长一致的发芽种子600粒备用。

3.如权利要求1所述的一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体步骤为：

a、取方形透明塑料发芽皿6个，垫入双层发芽纸，用水充分湿润后倒去多余的水，将待测水稻种质的步骤(3)选取的发芽种子100粒均匀放于发芽皿内，在其中3个发芽皿中每个发芽皿用胶头滴管滴入30mL稻曲病菌粗毒素溶液，盖上发芽皿盖，放置于恒温箱内，30℃保湿培养，培养72h；

b、另外3个发芽皿内的发芽种子以无菌水处理作为对照，共3次重复，置于恒温箱内，30℃保湿培养72h，将粗毒素溶液和无菌水对照培养的发芽皿取出，置于滤纸上吸干多余的水分，采用0.1mm直尺分别测定粗毒素溶液处理后初生根的长度和对照培养后初生根的长度，计算抑制率，根生长抑制率越高，品种对毒素的敏感度越高，抗病性越差；

c、计算抑制率：抑制率(％)＝(对照培养后初生根的长度-毒素处理后初生根的长度)/(对照培养后初生根的长度-开始培养时对照初生根的长度)×100。

4.如权利要求1所述的一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，其特征在于，所述步骤(1)中的选取大小均匀的稻曲病粒是指选取病粒直径为0.6cm-1.2cm的稻曲病粒。

5.如权利要求2所述的一种水稻种质稻曲病抗性快速比较方法，其特征在于，所述步骤(3)中：

所述有代表性的种子是指籽粒成熟度好，大小均一的种子；根长一致的发芽种子是指，采用直尺测量主根长，选取主根长长度相同的发芽种子。

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