CN109418158A - 一种促进铁皮石斛无菌萌发的方法及其所用培养基与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进铁皮石斛无菌萌发的方法及其所用培养基与应用。本发明通过铁皮石斛胚胎发育学和果实成熟度的研究，筛选铁皮石斛无菌萌发条件，优化快繁体系，确定适宜铁皮石斛无菌萌发播种的种龄。将适宜种龄的铁皮石斛种子播种在改良固体培养基中，获得萌发率高、萌发状态整齐一致的原球茎。本发明的方法丰富了铁皮石斛的生殖生物学发育资料，为无菌萌发提供理论基础；选用适宜种龄的种子作为外植体进行组培快繁大大缩短了其繁殖和育种时间，在铁皮石斛规模化和产业化发展上更具有优势。在改良固体培养基中培养获得的原球茎萌发率高，萌发状态整齐一致，为铁皮石斛无菌萌发体系的建立及生产中获得优良种苗进而保护野生资源方面提供资料。

Description

一种促进铁皮石斛无菌萌发的方法及其所用培养基与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进铁皮石斛无菌萌发的方法及其所用培养基与应用。

背景技术

石斛属(Dendrobium)隶属于兰科(Orchidaceae)，属内植物多具有重要药用价值与观赏价值。石斛属约含1000余种植物，主要分布于亚洲热带和亚热带地区，我国石斛属植物集中分布于秦岭以南的省区，以云南省南部地区较多(陈心启，1999)，其中约有50余种可做药用(白音，2007)。2010版《中华人民共和国药典》将环草石斛(Dendrobiumloddigesii)、流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)、束花石斛(Dendrobium chrysanthum)、金钗石斛(Dendrobium nobile)与铁皮石斛(Dendrobium officinale)5种药用石斛收录其中，其中前4种植物被归在石斛类之下，而铁皮石斛则被单列，以区别于其他石斛，这也体现了铁皮石斛的重要药用价值。

铁皮石斛的药用历史悠久，在唐代医学经典著作《道藏》中被誉为“九大仙草”之首，可见其重要的药用价值早在古代就已被人类发现并利用。药典中记载铁皮石斛具滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效(中华人民共和国药典，2010)。近年来，经过深入的药理学研究发现其作用主要有：抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、增强机体免疫能力、降血糖、促进胃肠蠕动和胃酸分泌等(陈晓梅等，2001)。

铁皮石斛对生境要求十分严格，自然资源本就稀缺，加之长期盗采盗挖，近年又因环境污染和大量采伐树木，野生生境遭到严重破坏，导致铁皮石斛野生资源日益减少，濒临枯竭(Dixon KW,et al.,2003；Liu J,et al.,2003)。另外，铁皮石斛与其他兰科植物相同，种子微小且缺少胚乳组织，在自然环境中需与真菌共生才能萌发，导致萌发率较低；加之自身生长发育较为缓慢，叶面积小，光合强度低，这些原因限制了铁皮石斛自身的发展(郭顺星等，2000)。低的种子萌发率难以满足大规模人工栽培的需要，而传统的栽培方式如扦插、分株等繁殖方式的繁殖率也较低。因此，在生产中利用种子无菌萌发获得组培苗是快速繁殖的主要途径。了解铁皮石斛种子胚胎发育过程和特点则是提高其种子萌发率和建立高效快速繁殖体系的理论基础和实践依据，是开展铁皮石斛野生资源可持续利用的重要前提。

为保护野生濒危资源，目前生产上常采用组织培养技术来解决铁皮石斛的种苗供应问题。通过铁皮石斛组织培养进行快速繁殖的途径主要有以下2种：一种是通过适宜的外植体例如茎尖、叶片、幼芽等接种到基本培养基上形成丛芽进行快速繁殖；另一种是将种子作为外植体，播种到合适的基本培养基上进行无菌萌发后形成原球茎进行增殖，进而分化成完整的植株(金辉等,2009)。

兰科植物的种子数量较多，但成熟开裂的果实中种子萌发率低且难以预处理，播种后染菌率高，不利于规模化生产的需要。为获得较高的萌发率并确保萌发后原球茎发育状态均匀一致，确立铁皮石斛最适宜的基本培养基条件是非常必要的。目前对铁皮石斛的研究主要集中在快繁体系的建立上，其中无菌萌发使用的外植体主要是种子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何结合铁皮石斛种子的胚胎发育过程选取适宜种龄的种子进行快速繁殖获得原球茎。为了解决上述技术问题，本发明通过胚胎发育学方法研究铁皮石斛种子的胚胎发育过程及优化快繁体系，确定铁皮石斛无菌萌发体系中外植体的最适宜种龄和最适宜培养基，摸索得到获得铁皮石斛原球茎的一种优化繁殖方法。该方法可获得萌发率高、萌发状态整齐一致的原球茎。

本发明的第一个目的是提供一种铁皮石斛原球茎的繁殖方法。

本发明提供的铁皮石斛原球茎的繁殖方法包括如下步骤：将铁皮石斛种子在无菌萌发培养基中进行无菌萌发，得到铁皮石斛原球茎；

所述铁皮石斛种子是授粉120天后收获得到的种子；

所述无菌萌发培养基包括马铃薯汁、6-BA、NAA和活性炭；

上述方法中，所述无菌萌发培养基是将基础培养基、马铃薯汁、6-BA、NAA和活性炭混匀得到的固体培养基。

上述方法中，所述无菌萌发培养基中的基础培养基为B5基本培养基、MS基本培养基或1/2MS基本培养基；

所述马铃薯汁在所述无菌萌发培养基中的浓度为200mL/L；

所述6-BA在所述无菌萌发培养基中的浓度为1.0mg/L；

所述NAA在所述无菌萌发培养基中的浓度为0.5mg/L；

所述活性炭在所述无菌萌发培养基中的浓度为0.5g/L。

上述方法中，所述无菌萌发的时间为40天。

上述方法中，所述无菌萌发的条件：温度为25℃，光强为2000lx，光照时间为12h/d。

上述方法中，所述马铃薯汁是新鲜马铃薯去皮切块与水按1:1比例煮制，纱布过滤制得。

本发明的第二个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在制备铁皮石斛多糖中的应用。

本发明的第三个目的是提供上述无菌萌发培养基。

本发明的第四个目的是提供上述无菌萌发培养基的新用途。

本发明提供了上述无菌萌发培养基在制备铁皮石斛多糖中的应用。

本发明还提供了上述无菌萌发培养基在提高铁皮石斛种子萌发率中的应用。

本发明还提供了上述无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎干重中的应用。

本发明还提供了上述无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎鲜重中的应用。

本发明还提供了上述无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎多糖含量中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于繁殖铁皮石斛原球茎的产品。

本发明提供的用于繁殖铁皮石斛原球茎的产品包括上述无菌萌发培养基。

本发明的第六个目的是提供上述产品的新用途。

本发明提供了上述产品在制备铁皮石斛多糖中的应用。

本发明还提供了上述产品在提高铁皮石斛种子萌发率中的应用。

本发明还提供了上述产品在提高铁皮石斛原球茎干重中的应用。

本发明还提供了上述产品在提高铁皮石斛原球茎鲜重中的应用。

本发明还提供了上述产品在提高铁皮石斛原球茎多糖含量中的应用。

本发明的有益效果：

1)本发明选取适宜成熟度的果实来提高种子萌发率与利用率。在前期胚胎学研究中，60DAP时大多数种子已经形成二细胞原胚，此胚体虽然幼小但已经具有萌发能力。60DAP时有胚率可达到62.28％±3.36％，但此时期萌发率依然较低，仅为28.61％±8.83％，且初始萌发时间较长。本发明发现铁皮石斛种子萌发率在120DAP、150DAP与180DAP时萌发率较高。而120DAP的种子疏松易于播种操作，综合其较高的萌发率，且与150DAP与180DAP时在种子活力、萌发率与初始萌发时间无显著差异，因此将120DAP确定为最适采种时间。

2)本发明发现以B5、MS与1/2MS为基本培养基适宜铁皮石斛种子萌发，B5萌发率优于MS与1/2MS但无显著性差异，种子在三者上均可萌发一致，萌发后原球茎状态好。

3)本发明发现在基本培养基中添加马铃薯汁(200mL/L)可使铁皮石斛种子萌发状态整齐一致，萌发率也较高。

4)本发明发现在基本培养基中添加(0.5-1.0)mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA有利于提高铁皮石斛种子的萌发率。

本发明首先通过对人工授粉后铁皮石斛的胚胎发育学和果实成熟度进行研究，了解了铁皮石斛种胚发育过程和果实生长特性，然后通过筛选铁皮石斛无菌萌发条件，优化快繁体系，最终确定铁皮石斛无菌萌发体系中外植体的最适宜种龄和最适培养基。本发明还将筛选出的最适种龄的种子接种于最适培养基中进行无菌萌发，萌发形成的原球茎不经继代培养即可进行悬浮培养，并通过对铁皮石斛悬浮培养的原球茎干重、多糖含量与多糖产量3个指标的测定，最终确定铁皮石斛悬浮培养的最适培养基。本发明的繁殖方法大大缩短了铁皮石斛体外培养繁殖和育种时间，而且选用铁皮石斛种子作为外植体进行组培快繁在规模化和规范产业化上更具有优势，为生产上使用原球茎代替全草生产多糖和缩短生产周期提供理论依据和参考价值。

附图说明

图1为铁皮石斛果实和种子生长情况。(a)：0DAP果实横切图，示单室子房与胎座，比例尺＝500μm；(b)：15DAP果实横切图，子房内胎座脊形成乳白色突起，比例尺＝3.2mm；(c)：30DAP果实横切图，示胎座上开始形成种子，比例尺＝1mm；(d)：45DAP果实横切图，示胎座上种子个体开始分化，比例尺＝500μm；(e)：50DAP果实横切图，示透明种子，尚未形成胚，比例尺＝500μm；(f)：55DAP果实横切图，示少量种子形成淡黄色胚，比例尺＝500μm；(g)：60DAP果实横切图，示种胚形成尚未充满种皮，比例尺＝200μm；(h)：75DAP果实横切图，示种胚基本充满种皮，比例尺＝200μm：(i-j):90DAP与100DAP果实横切图，胚体膨大充满种皮后体积基本保持不变，比例尺＝200μm；(k)：120DAP果实横切图，示种子填满整个果实，比例尺＝2mm；(l)：135DAP果实横切图，示部分种子干燥脱离胎座、分散，比例尺＝1mm。

图2为铁皮石斛胚胎发育过程Ⅰ。(a)：0DAP的果实横切图，示侧膜胎座，二叉状胎座脊，比例尺＝500μm；(b)：15DAP果实纵切图，示3-5级指状突起，比例尺＝500μm；(c)：30DAP果实纵切图，箭头示孢原细胞，比例尺＝500μm；(d)：30DAP果实纵切图，示大孢子母细胞，比例尺＝200μm；(e)：30DAP果实纵切图，示内珠被开始分化及倒生胚珠，比例尺＝200μm；(f)：45DAP果实纵切图，示大孢子母细胞，箭头示退化的珠心细胞，比例尺＝200μm；(g)：45DAP果实纵切图，箭头示大孢子母细胞减数分裂Ⅰ中期，比例尺＝200μm；(h)：45DAP果实纵切图，箭头示大孢子母细胞减数分裂Ⅰ后期，比例尺＝200μm；(i)：45DAP果实纵切图，箭头示大孢子母细胞减数分裂Ⅰ末期，比例尺＝100μm；(j)：45DAP果实纵切图,箭头示大孢子母细胞减数分裂形成二核，比例尺＝200μm；(k)：45DAP果实纵切图，示珠孔端核退化，比例尺＝200μm；(l)：45DAP果实纵切图，箭头示合点端核减数分裂Ⅱ后期，比例尺＝200μm；(m)：45DAP果实纵切图,示合点端核分裂为二核，比例尺＝31μm；(n)：45DAP果实纵切图，示有功能的大孢子，箭头连续两次退化的珠孔端的核痕迹，比例尺＝200μm；(o)：45DAP果实纵切图，二核胚囊，比例尺＝200μm。

图3为铁皮石斛胚胎发育过程Ⅱ。(a)：50DAP的果实纵切图，示四核胚囊，比例尺＝31μm；(b)：55DAP的果实纵切图，示中央细胞，比例尺＝50μm；(c)：55DAP的果实纵切图，示卵器，比例尺＝50μm；(d)：55DAP的果实纵切图，示反足细胞，比例尺＝50μm；(e)：55DAP的果实纵切图，示双受精，箭头1示一精核与中央极核融合，箭头2示一精核向卵核靠近，比例尺＝50μm；(f)：55DAP的果实纵切图，示合子与未退化反足细胞，比例尺＝20μm；(g)：55DAP的果实纵切图，示初生胚乳核，比例尺＝50μm；(h)：55DAP的果实纵切图，示合子，比例尺＝50μm；(i)：60DAP的果实纵切图，示二细胞原胚，比例尺＝50μm；(j)：60DAP的果实纵切图，示T-型胚，比例尺＝100μm；(k)：60DAP的果实纵切图，示八分体，比例尺＝100μm；(l)：60DAP的果实纵切图，示球形胚，比例尺＝50μm；(m)：60DAP的果实纵切图，示胚柄退化，比例尺＝100μm；(n)：75DAP的果实纵切图，示充满种皮的胚体，比例尺＝50μm；(o)：100DAP的果实纵切图，示成熟胚，比例尺＝100μm。

图4为铁皮石斛不同发育时期果实及种子形态特征。(a)：60DAP的未成熟蒴果；(b)：90DAP的未成熟蒴果；(c)：120DAP的未成熟蒴果；(d)：150DAP的未成熟蒴果；(e)：180DAP的未成熟蒴果。

图5为不同发育时期铁皮石斛种子活力。(a)：染色后60DAP的种子，比例尺＝200μm；(b)：染色后90DAP的种子，比例尺＝20μm；(c)：染色后120DAP的种子，比例尺＝20μm

图6为不同基本培养基上铁皮石斛种子萌发率。注：图中数据平均值±标准误。各柱形上不同大写字母表示0.01水平上差异显著(N＝10)。

图7为不同基本培养基上120DAP铁皮石斛种子萌发情况。(a)：120DAP的铁皮石斛种子在B5基本培养基上播种40d后萌发情况；(b)：120DAP的铁皮石斛种子在1/4MS基本培养基上播种40d后萌发情况；(c)：120DAP的铁皮石斛种子在KC基本培养基上播种40d后萌发情况。

图8为不同有机添加物对铁皮石斛种子萌发率的影响。注：图中数据为3个种子发育时期7个添加物处理的平均值±标准误。各柱形上不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。X50表示香蕉汁50mL/L，X100表示香蕉汁100mL/L，Y50表示椰汁50mL/L，Y100表示椰汁100mL/L，T100表示马铃薯汁100mL/L，T200表示马铃薯汁200mL/L，CK表示不添加任何添加物处理(N＝10)。

图9为120DAP铁皮石斛种子在添加不同有机物时萌发情况差异。(a)：120DAP铁皮石斛种子在添加马铃薯汁200mL/L的基本培养基上萌发情况；(b)：120DAP铁皮石斛种子在添加椰汁100mL/L的基本培养基上萌发情况；(c)：120DAP铁皮石斛种子在添加香蕉汁100mL/L的基本培养基上萌发情况。

图10为不同激素浓度对铁皮石斛萌发率的影响。注：图中数据C1-C12与CK激素组合处理的平均值±标准误，各柱形上不同大写字母表示在0.01水平上差异显著(N＝10)。

图11为120DAP、150DAP与180DAP的种子固体培养所得原球茎对悬浮培养物鲜重影响。

图12为120DAP、150DAP与180DAP的种子固体培养所得原球茎对悬浮培养物干重影响。

图13为120DAP、150DAP与180DAP的种子固体培养所得原球茎对悬浮培养物多糖含量影响。

图14为120DAP、150DAP与180DAP的种子固体培养所得原球茎对悬浮培养物多糖产量影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的活性炭和TTC均购自北京易秀博古生物科技有限公司。

下述实施例中的DAP(days after pollination)代表授粉后天数。

下述实施例中所用的培养基(PH均调至5.8)如下：

1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素中的各组分的浓度减半，且保持MS培养基其他组分及浓度不变后得到的培养基。

1/4MS培养基是将1/2MS培养基中的大量元素中的各组分的浓度减半，且保持1/2MS培养基其他组分及浓度不变后得到的培养基。

花宝一号培养基(NO1，N：P：K配比为：7：6：19)是将花宝一号(购自北京宏达科莱科技有限公司)与蒸馏水混匀得到的培养基。其中，花宝一号在培养基中的浓度为0.3g/L。

KC培养基的配方如下：

B5培养基的配方如下：

N6培养基的配方如下：

WPM培养基的配方如下：

White培养基的配方如下：

以上各个培养基均添加蔗糖，蔗糖在各个培养基中的浓度均为20g/L，如果是固体培养基还需要添加琼脂，琼脂在培养基中的浓度为6g/L。

实施例1、铁皮石斛的胚胎发育研究及不同因素对铁皮石斛无菌萌发的影响

(一)铁皮石斛的胚胎发育研究

一、试验材料

试验材料采于广西农业科学院花卉植物研究所温室，2014年5月22日选择健壮的铁皮石斛植株统一进行人工授粉，按5d的时间间隔采集果实用于试验。

二、试验方法

1、体式显微镜形态观察

采集果实后，使用双面刀片横切果实，解剖后体式显微镜(Leica DFC500)下观察授粉后0-180天的果实及种子的形态特征与发育状况，分别选取具有典型形态特征的时期进行拍照，记录果实及种子的形态特征。

2、石蜡切片观察

将果实横切成0.5cm³左右的组织块，使用FAA固定液固定，反复真空抽气使固定液充分进入细胞组织。固定24h后于4℃冰箱内保存。通过酒精梯度浓度脱水，番红固绿染色等常规石蜡切片制片法制片。后用光学显微镜(Leica DM2500)观察制片并拍照。

三、结果与分析

1、果实生长状态观察

未授粉的铁皮石斛子房细而短小，横切未授粉的子房可见其内尚未发育的3个胎座脊(图1-a)。授粉后花粉刺激子房的发育，子房不断膨大并纵向伸长。15DAP时横切子房可见子房胎座上形成较多颗粒状乳白色突起，种子尚未充满胎座，果实中部留有较大空隙(图1-b)。30DAP时胎座上突起开始分化形成种子，此时种子近透明色，椭圆颗粒状(图1-c)。45DAP时种子数量不断增多，形状细长，种子个体分化明显(图1-d)，至50DAP时可观察到种子近乎透明，种子较前期纵径长，紧紧附着在胎座上，可见种皮上开始形成细条纹(图1-e)。55DAP时可见果实内极少数种子形成胚，幼嫩的胚为黄色位于种皮中央，种子长度较50DAP明显增加(图1-f)。60DAP时大多数种子内胚已形成，但此时胚体体积较小，尚未充满整个种皮，种子依旧成团，种皮上细条纹明显(图1-g)。至75DAP时，胚已充满整个种皮，少部分种子含水量减少、种皮出现两端皱缩(图1-h)。90DAP与100DAP时的种子，胚体继续膨大充满种皮后，体积基本保持不变，此时期大部分种子的种皮出现轻度皱缩(图1i-1j)。120DAP时种子填满整个果实，此时果实内部种子疏松(图1-k)。至135DAP时，解剖时种子轻抖即可脱落(图1-l)。

2、胚珠发育

(1)大孢子及雌配子体发生

铁皮石斛授粉之前子房短而细小，紧贴于萼片之下。授粉后子房不断膨大。铁皮石斛胎座为侧膜胎座，3心皮，单室，未授粉的子房横切面只是简单的二叉状分支的胎座脊(图2-a)。15DAP时果实生长为约1cm左右。此时蒴果内部形成3-5级分枝状系统即胚珠原基，形似指状突起(图2-b)，每个指状突起由一层表皮细胞包围着一单列细胞组成。指状顶端紧贴表皮细胞下方有一细胞体积大且染色明显深于周围其它细胞，此细胞为孢原细胞(图2-c)。

约30DAP时，孢原细胞不经分裂发育形成大孢子母细胞，细胞体积增大，细胞质变浓(图2-d)。此时位于大孢子母细胞下部3-4个细胞的位置，单层表皮细胞开始分裂并向上生长最终分化为内珠被(图2-e)。内珠被开始分化后，其基部表皮细胞分化，向上生长形成外珠被。内外珠被同时向上生长，最终包住珠心并在顶端形成珠孔，故铁皮石斛的胚珠具有双珠被。珠心细胞由孢原细胞外的表皮细胞发育而成，随着大孢子母细胞体积的增大，珠心细胞沿平周方向不断伸长。珠孔端的珠心细胞在大孢子母细胞分裂时期逐渐退化解体形成胚囊壁，而合点端珠心细胞并不解体，成为胚囊营养来源的通道。大孢子母细胞与珠心顶端无细胞层，因此铁皮石斛为薄珠心胚囊。胚珠发育早期为直立，30-45DAP期间珠柄弯曲，使胚珠珠孔逐渐向胎座靠拢，最终形成倒转的倒生胚珠。

45DAP左右时大孢子母细胞核大，质浓，无液泡，以备进行减数分裂(图2-f)。大孢子母细胞经过减数分裂I(图2-g)，完成分裂后形成二分体细胞(图2h-2j)，其中靠近珠孔端的细胞退化，合点端的继续发育。此时在切片上可以清晰的观察到珠孔端细胞逐渐退化的痕迹(图2-k)。紧接着合点端的细胞进行减数分裂Ⅱ，形成2个细胞移向珠心两极，与之前退化的珠孔端二分体细胞合称为三分体，三分体合点端有功能的细胞继续发育(图2l-2m)。

合点端的有功能的细胞发育为功能性大孢子，其体积增大，细胞核明显，为单核胚囊时期(图2-n)。功能性大孢子通过有丝分裂形成二核胚囊。两核分别位于胚囊的两极，核之间无细胞壁的存在，仅以一明显液泡相隔(图2-o)。约50DAP时，分别位于胚囊两极的二核各进行第二次有丝分裂，形成四核胚囊(图3-a)。四核胚囊再进行一次有丝分裂，约55DAP时最终形成两极各具4核的八核胚囊。八核胚囊继续发育，胚囊两极各有1核移向胚囊的中央，构成含有2核的中央细胞(图3-b)；珠孔端的4个核剩余的3个核组成卵器，其中包含1个卵细胞与2个助细胞(图3-c)；合点端的4个核中剩余的3个核形成反足细胞(图3-d)。铁皮石斛胚囊在约55DAP时发育成熟，发育类型为蓼型。

(2)胚胎发育

铁皮石斛授粉后当花粉管萌发伸长到胚囊时释放的2个精子，其中1个与卵细胞融合，受精后形成合子；另外1个精子与中央极核结合，受精后形成初生胚乳，因此铁皮石斛受精为双受精。通过连续切片，观察到在铁皮石斛的双受精过程中，精核与2个极核的融合比卵核的融合更早(图3-e)。形成合子后反足细胞依然存在，后期退化。合子极性较强，具有明显的细胞核，核偏向于合点端，珠孔端则形成明显液泡(图3-f)。2个精子中的另一精子与中央细胞(极核)融合。极核受精后发育成为初生胚乳核，逐渐向胚囊的合点端移动。初生胚乳核分裂为几个细胞组成的简单细胞团后，在胚发育的极早期迅速退化，导致种子成熟时缺少胚乳(图3-g)。受精后的合子具有明显的液泡化结构与母体相连(图3-h)。随后合子进行分裂，在合子中间形成横壁，分裂为一列两个细胞。近合点端的一个称为顶细胞，细胞质浓，细胞体积较基细胞小。近珠孔端的细胞称为基细胞，具有大液泡，其不参与胚的形成，而是之后与合子时期的液泡化结构发育为胚柄吸器与母体相连用来吸收营养(图3-i)。顶细胞与基细胞组成二细胞原胚。60DAP时大部分种子已经形成二细胞原胚，顶细胞横向分裂为2个细胞，基细胞形成一横壁分隔为纵向一列的2个细胞，这样形成由4细胞组成的T型胚(图3-j)。接着T型胚再进行1次横向的分裂及1次纵向的分裂，组成4细胞重叠2排的八分体原胚(图3-k)。然后八分体原胚的胚细胞继续进行分裂，胚细胞数量不断增加形成球形胚(图3-l)，此时胚柄吸器续存，但不再继续分裂。球形胚继续分裂，形成更多的胚细胞，逐渐填满胚囊腔。胚体的分裂不断从周围的表皮细胞中吸取营养，随后表皮细胞逐渐萎缩退化为角质化的种皮，此时胚柄吸器逐渐退化(图3-m)。至75DAP时胚胎基本发育成熟，此时胚细胞数量较多，约为40-70个(图3-n)。100DAP时，种胚发育成熟，胚细胞细胞质浓厚，细胞数量较75DAP减少(图3-o)。

授粉刺激铁皮石斛子房的发育，15DAP时可见到胎座上已经形成突起，倒生胚珠具双珠被，胚囊为薄珠心。约55DAP时胚囊发育成熟，成熟的胚囊为具有8核的蓼型胚囊。铁皮石斛胚囊前期发育过程与天麻(Gastrodia elata)(梁汉兴，1984)相似，都会形成三分体，但铁皮石斛的四核胚囊进行正常的有丝分裂，而天麻在四核胚囊时期合点端的两核退化只有珠孔端的2核继续分裂，最终成熟胚囊只具有4核。

胚囊的正常发育是双受精的关键，花粉管进入胚囊后，释放一大一小2个精子，精子与极核和卵细胞完成融合的现象即为双受精，双受精是被子植物特有的受精方式。在之前对兰科植物双受精的研究中，关于双受精的融合顺序研究较少，并未见能够证明双受精2个精子融合的先后顺序的清晰图示。本发明能够清晰地看到体积较大的精核先与2个极核接触融合，此时另一个体积相对较小的精核正处于向卵细胞移动的状态，即大的精核先和极核相融合，小的精核后于卵细胞融合。在合子形成之后仍可以看到3个助细胞的存在。

胚的发育是从合子分裂开始，经过发育和分化阶段，最后达到成熟。铁皮石斛的胚胎发育早期形成二细胞原胚，顶细胞横向分裂，基细胞形成一横壁分隔形成一列2个细胞，但不参与胚的形成而是发育为胚柄。根据胡适宜(2005)对胚胎发生的分类，铁皮石斛的胚胎发育类型为茄型。胚乳是双受精的产物，常作为营养组织在种子发育过程中为胚提供营养，然而兰科植物双受精后不形成胚乳结构，兰科的许多种类在三核合并之后，初生胚乳核随即退化或者只进行少数几次分裂即停止发育。铁皮石斛胚胎发育后期，初生胚乳核只分裂为几个细胞后停止分裂，在以后的发育中逐渐退化消失。受精完成后，合子继续发育，并逐渐填满整个种皮，成熟种胚仅为一团未分化的细胞团，之后种胚不再分化，停留在球形胚阶段。铁皮石斛种子细小，又缺乏胚乳组织，自然条件下需与真菌共生才能萌发，自然条件下种子的萌发率极低，不足3％(董芳，2008)。60DAP时大部分种子已经形成二细胞原胚，幼小的胚体具有萌发能力，可作为生产上最早的采种时期。

胚由胚柄固着在胚囊的珠孔端，胚柄在发育早期从周围组织获得营养物质供胚发育。胚柄是一个短命的构造，通常胚发育至球形或心形胚期达到最高发育程度，以后停止生长后退化。本发明发现铁皮石斛的合子在分裂为基细胞与顶细胞的二细胞原胚后，基细胞形成圆形泡状的胚柄吸器，在后期的胚体发育过程中退化消失。

综合此阶段的研究，以铁皮石斛雌配子体及胚珠发育过程为依据，在60DAP时大部分种子已具有二细胞原胚，种子便具有萌发能力，因此可从此时期开始采种，进行萌发率试验。

(二)不同因素对铁皮石斛无菌萌发的影响

一、种龄对铁皮石斛无菌萌发的影响

1、试验材料

试验材料采于广西农业科学院花卉植物研究所，2014年5月22日选择健壮的铁皮石斛植株统一进行人工授粉，按30d时间间隔每次采集3个果实用于观察及无菌萌发试验。

2、试验方法

(1)果实及种子外部形态观察

分别采集60DAP、90DAP、120DAP、150DAP和180DAP的果实，剖开后观察种子形态，使用数码相机(佳能600D)拍照。

(2)种子预处理

将未开裂的果实除去表面杂物，使用牙刷将果实表面清洗干净，然后将果实置于烧杯内流水冲洗1h后转移到无菌操作台内进行灭菌。灭菌程序为：75％酒精30s；1％次氯酸钠溶液浸泡15min；无菌水冲洗5次，每次2min。将灭菌后的果实取出在无菌滤纸上吸干水分，切开后获得铁皮石斛种子，以备播种。

(3)种子无菌播种

使用MS培养基作为基本培养基，加入0.5g/L活性炭和200mL/L马铃薯汁(马铃薯汁是新鲜马铃薯去皮切块与水按1:1比例煮制，纱布过滤制得)进行改良，pH调制至5.8，得到改良后的培养基。将铁皮石斛种子均匀播种于改良后的培养基表面，置于光下、25℃进行培养。每个处理播种20瓶。统计种子播种总数和种子萌发数，按下式计算萌发率。萌发率＝(种子萌发数/种子总数)×100％。

(4)种子活力检测

采用常规TTC法进行种子活力检测。具体步骤如下：将播种后剩余的种子倒入带盖玻璃瓶中，加入浓度为1％的TTC溶液后摇匀，用锡纸将小瓶包裹置于25℃下，72h后使用细胞筛将种子转移到培养皿中，在体式显微镜(Leica DFC500)下选取10个视野观察种子。统计每个视野内种子总数、未败育种子数和染色种子数，按下式计算种子有胚率和活力。种子有胚率＝(视野下未败育种子数/种子总数)×100％。种子活力＝(视野下种子染色数/未败育种子数)×100％。

(5)数据统计与处理

试验所得相关数据使用SPSS19.0软件进行统计分析，检验不同种龄的铁皮石斛种子有胚率、染色率及萌发率等指标的差异显著性。

3、结果分析

(1)铁皮石斛不同发育时期的果实和种子形态特征变化

铁皮石斛不同发育时期的果实和种子形态特征变化如图4和表1所示。60DAP时果实解剖后可见种子成团，种子紧紧黏着在胎座上，湿润、充满整个果实，此时种子颜色较浅，已形成体积较小的种胚(图4-a)。90-120DAP期间种子含水量逐渐减少，90DAP时种子尚未脱离胎座，120DAP时果实中间部分种子疏松干燥、拨动可脱落(图4b-4c)。至150DAP时果实内种子颜色为深黄色，种子干燥，大部分种子解剖时脱离胎座，仅少部分种子黏着在胎座上(图4-d)。180DAP时种子棕黄色，全部脱离胎座，呈粉末状(图4-e)。

TTC染色后，可见60DAP时种子种皮透明，种胚位于种皮中央尚未充满种皮，大部分种子不被染色，染色的种子颜色也较浅(图5-a)。90DAP时种子种胚增大，透过种皮可观察到内部球形胚充满种皮，此时种子染色数增加，大部分正常胚都能着色但着色依旧较浅(图5-b)。至120DAP时正常发育的大部分胚都能染成深红色，较之前时期颜色深，证明此时胚具有良好的生活力(图5-c)。

表1、铁皮石斛不同发育时期果实及种子形态特征

(2)不同发育阶段铁皮石斛种子生活力及萌发率

铁皮石斛不同发育阶段的种子TTC有胚率、染色率和萌发率3个生理性状指标见表2。60DAP时种子幼嫩，种胚尚未充满种皮，有活力的种子着色也较浅，染色率低。90DAP时种子有胚率及染色率均增长较快，正常发育的种胚染色率较高，此时期种子有胚率与萌发率一直保持在90％以上，与60DAP比较具有显著差异性。

种子的发育程度是影响铁皮石斛萌发率的限制性因素。60DAP时种胚尚未充满种皮，胚未发育成熟且体积较小，种子颜色黄白相间。种子幼嫩紧密着生于胎座之上难以分离，播种时种子成团，不利于播种。播种后种子大部分褐化死亡或保持不萌发的原始状态，仅有少量种子能够萌发，此时期的种子萌发率仅为28.61％±8.83％。90DAP时种子依旧湿润成团着生在胎座上，但种子较60DAP时疏松，播种时虽成团但轻轻拨动可分散成小的种子团。此时期种胚膨大逐渐充满整个种皮，有胚率与染色率分别保持在97.14％±1.54％和91.03％±3.63％左右，说明大部分种子形成正常的种胚，萌发率也增长到76.85％±8.7％，3个指标均与60DAP时存在显著性差异。120DAP时种子胚染色较深，胚已充满种皮，胚被染成深红色。此时期种子依旧附着在胎座上，但种子较之前疏松干燥，着生在胎座上的种子轻轻抖动能够脱落。此种状态下的种子利于播种试验操作，能够均匀的散落在基本培养基上。120DAP时种子播种后10d即可大量萌发，形成的原球茎体积大，萌发率维持在97.38％±3.2％左右。150DAP时种子颜色变为深黄色，此时期种子含水量减少、干燥，大部分种子从胎座脱落。此阶段的种子播种后萌发率为92.52％±7.58％，与120DAP的萌发率相比有些许下降的趋势，但无显著性差异。至180DAP时铁皮石斛种子变为深黄色，种子萌发率也持续下降，但依旧维持在90％以上。120DAP、150DAP与180DAP的种子萌发率差异不显著。

根据前期试验100DAP时种胚成熟，但种子依旧湿润成团不方便生产上播种操作，而120DAP的种子疏松易于播种操作，综合其较高的萌发率，且与150DAP与180DAP时在种子活力、萌发率与初始萌发时间无显著差异，因此选择120DAP为最适采种时间。

表2、铁皮石斛不同发育时期种子生理特点

注：表中同列大写字母表示在0.01水平上差异显著，小写字母表示在0.05水平上差异显著(萌发率N＝20；种子活力与有胚率N＝10)。

二、基本培养基对铁皮石斛种子萌发的影响

1、试验材料

试验材料采于广西农业科学院花卉植物研究所，2014年5月22日选择健壮的铁皮石斛植株统一进行人工授粉，分别采集120DAP、150DAP和180DAP果实，每次采集3个果实用于无菌萌发试验。

2、试验方法

(1)种子预处理

同步骤一2中的(2)。

(2)种子无菌播种

分别以如下8种基本培养基作为基本培养基：MS、1/2MS、1/4MS、KC、B5、N6、WPM与花宝一号(NO1)，分别加入0.5g/L的活性炭与200mL/L马铃薯汁进行改良，分别pH调至5.8，分别得到改良后的培养基。将铁皮石斛种子均匀播种于各个改良后的培养基表面，置于光下、25℃进行培养。每个处理播种10瓶。统计种子播种总数和种子萌发数，并计算萌发率。

(3)数据统计与处理

试验所得相关数据使用SPSS19.0软件进行统计分析，检验不同种龄铁皮石斛种子在不同改良后的培养基上的萌发率的差异显著性。

3、结果与分析

120DAP、150DAP与180DAP的铁皮石斛种子在不同基本培养基上的萌发率如图6和图7所示。3个时期的铁皮石斛种子均在B5培养基上萌发率最高，萌发率维持在95％以上，种子利用率高；且在B5培养基上萌发形成的原球茎较其他培养基体积大，颜色深。120DAP的种子在B5培养基上萌发率为97.61％±2.73％，萌发率高于其他培养基，MS与1/2MS培养基较B5次之，萌发率分别可达到95.12％±3.20％和94.02％±7.23％，与B5培养基萌发率之间无显著性差异。MS与1/2MS培养基播种后40d种子萌发状态基本一致，萌发并形成大小一致的原球茎。1/4MS培养基播种后种子在播种后40d形成的原球茎顶端分化出小旗叶，存在一定数量体积较大的原球茎，萌发状态不一致，萌发率为92.43％±4.18％。NO1培养基的萌发率为92.61％±6.84％，与1/4MS培养基萌发率相近。N6培养基萌发率为86.07％±6.79％，与1/4MS和NO1培养基具显著性差异。播种后40d观察NO1与N6培养基上种子萌发状态，发现两种培养基上种子萌发状态均不一致，极少部分种子形成体积大的原球茎并长出旗叶，少部分种子形成小的原球茎，大部分种子仅是种胚膨大处于萌发状态。KC与WPM培养基上种子萌发率最低，仅为66.05％±5.55％和60.04％±6.04％，与其他培养基相比差异性显著。播种后70d在KC培养基上萌发的原球茎与其他培养基相比颜色浅，常出现黄色变异的原球茎；WPM培养基上的圆球茎状态不一，有的分化较早形成根而大部分原球茎为体积较小的原球茎。150DAP与180DAP的种子在8种基本培养基上的种子萌发率与120DAP的种子萌发率趋势基本一致。从3个时期的萌发率比较上看，B5、MS与1/2MS基本培养基萌发效果最好，萌发状态基本一致。其次为1/4MS、NO1与N6基本培养基，而在KC与WPM基本培养基的萌发率最差，差异极显著。可见基本培养基的选择对铁皮石斛种子的萌发率及萌发后原球茎生长状态效果影响显著。

三、有机添加物对铁皮石斛种子无菌萌发的影响

1、试验材料

同步骤二的1。

2、试验方法

(1)种子预处理

同步骤二2中的(2)。

(2)种子无菌播种

使用MS作为基本培养基，加入0.5g/L的活性炭和不同浓度的有机添加物进行改良，不同浓度的有机添加物设置分别如下：香蕉汁50mL/L(X50)、香蕉汁100mL/L(X100)、椰汁50mL/L(Y50)、椰汁100mL/L(Y100)、马铃薯汁100mL/L(T100)、马铃薯汁200mL/L(T200)，pH调至5.8，分别得到改良的培养基，同时以不添加有机添加物的基本培养基(MS)作为对照(CK)。其中，香蕉汁是新鲜香蕉去皮切块与水按1:1比例煮制，纱布过滤制得，椰汁是新鲜椰果中的椰汁。将铁皮石斛种子均匀播种于改良的培养基表面，置于光下、25℃进行培养。每个处理播种10瓶。统计种子播种总数和种子萌发数，并计算萌发率。

(3)数据统计与处理

试验所得相关数据使用SPSS19.0软件进行统计分析，检验不同种龄的铁皮石斛种子在不同改良后的培养基上的萌发率的差异显著性。

3、结果与分析

该试验选用120DAP、150DAP与180DAP的铁皮石斛种子进行了3次对比试验，结果如图8和图9所示，在基本培养基中添加椰汁与马铃薯汁对铁皮石斛的种子萌发均有一定的促进作用。添加马铃薯汁100mL/L、马铃薯汁200mL/L、椰汁100mL/L的基本培养基的种子萌发率与其他处理具有显著差异性。其中添加马铃薯汁200mL/L的萌发率最高且萌发状态整齐一致，120DAP、150DAP与180DAP的萌发率分别为97.38％±3.20％、92.52％±7.58％和90.74％±9.58％，而CK组萌发率仅为66.7％±6.80％、62.85％±6.64％、61.30％±8.23％。添加马铃薯汁100mL/L的促进作用略低于椰汁100mL/L，在添加椰汁100mL/L的基本培养基中120DAP、150DAP与180DAP的萌发率分别为90.12％±7.51％、88.68％±4.85％和85.96％±2.95％，比同浓度的马铃薯汁促进效果好但并不具有差异性显著，添加椰汁100mL/L的基本培养基种子萌发状态一致低于马铃薯汁200mL/L。而添加香蕉汁则降低了铁皮石斛种子萌发率，120DAP和150DAP的种子添加50mL/L的香蕉汁的萌发率与CK组无显著性差异，但香蕉汁添加量为100mL/L时铁皮石斛种子萌发率分别降为45.42％±4.72％和43.29％±4.40％，两个时期的CK组的萌发率为66.70％±6.80％和62.85％±6.64％。可见香蕉汁的添加抑制了铁皮石斛种子萌发率，马铃薯汁与椰汁促进铁皮石斛种子萌发，添加物的浓度也对铁皮石斛种子萌发率有一定的影响。添加200mL/L的马铃薯汁的铁皮石斛种子萌发率最高。

四、激素组合处理对铁皮石斛种子无菌萌发的影响

1、试验材料

试验材料采于广西农业科学院花卉植物研究所，2014年5月22日选择健壮的铁皮石斛植株统一进行人工授粉，采集180DAP的果实，每次采集3个果实用于无菌萌发试验。

2、试验方法

(1)种子预处理

同步骤一2中的(2)。

(2)种子无菌播种

使用MS作为基本培养基，加入0.5g/L活性炭和不同浓度的激素组合(6-BA与NAA)进行改良，不同浓度的激素组合及浓度如表3所示，pH均调至5.8，分别得到改良的培养基，同时以不添加激素的基本培养基(MS)为对照(CK)。将铁皮石斛种子均匀播种于改良的培养基表面，置于光下、25℃进行培养。每个处理播种10瓶。统计种子播种总数和种子萌发数，并计算萌发率。

表3、铁皮石斛基本培养基不同激素组合处理

处理序号	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)
			CK	0	0
C1	0.1	0.1
			C2	0.5	0.1
C3	1	0.1
			C4	2	0.1
C5	0.1	0.5
			C6	0.5	0.5
C7	1	0.5
			C8	2	0.5
C9	0.1	1
			C10	0.5	1
C11	1	1
			C12	2	1

(3)数据统计与处理

试验所得相关数据使用SPSS19.0软件进行统计分析，检验铁皮石斛种子在不同改良后的培养基上的萌发率的差异显著性。

3、结果与分析

结果图10所示，C6和C7激素组合处理下的铁皮石斛种子萌发率较高，与其他激素组合水平处理及CK组差异性显著，其中C7处理萌发率最高，其萌发率为98.18％±2.12％。在C1、C2、C3和C4激素组合处理中，此组内NAA浓度为0.1mg/L，6-BA在(0.1-1)mg/L浓度范围内种子萌发率随6-BA浓度的增大而不断上升，萌发率均略高于CK组的萌发率(74.06％±1.39％)，但差异并不显著。当激素组合处理为2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA时，种子萌发率为68.45％±4.01％，低于CK组。在C5、C6和C7(NAA 0.5mg/L)激素组合处理中，铁皮石斛萌发率随6-BA浓度的增加萌发率显著上升，其中C6与C7激素组合处理下萌发率其与他处理具极显著差异，萌发率均在90％以上，此两组合处理的6-BA浓度分别为0.5mg/L与1.0mg/L，证明此浓度下的6-BA与0.5mg/L NAA组合有利于种子的无菌萌发。在C9、C10、C11和C12的4个激素组合处理下的萌发率分别为67.03％±5.47％、73.48％±4.70％、67.18％±7.38％和60.04％±10.19％，其总体萌发率水平低于C1-C4、C5-C8激素组合处理的种子萌发率，说明高浓度的NAA(1mg/L)激素相比0.5mg/L浓度的NAA使铁皮石斛种子萌发率降低，低于CK组的萌发率，因此1mg/L浓度的NAA在一定程度上抑制种子萌发。在2mg/L 6-BA+1mg/L NAA浓度水平下种子萌发率为所有组合处理中最低，仅为60.04±10.19％，与CK组的差异为极显著，说明高浓度的6-BA与NAA抑制了种子的萌发。因此，(0.5-1.0)mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA的激素组合处理水平对铁皮石斛种子萌发有较好的促进作用。

综上所述，用于铁皮石斛种子固体培养的最适固体培养基是将B5基础培养基、马铃薯汁、6-BA、NAA和活性炭混匀得到的培养基，其中，马铃薯汁在最适固体培养基中的浓度为200mL/L、6-BA在最适固体培养基中的浓度为1.0mg/L、NAA在最适固体培养基中的浓度为0.5mg/L、活性炭在最适固体培养基中的浓度为0.5g/L。

实施例2、铁皮石斛悬浮培养生产多糖

一、固体培养原球茎材料

1、试验材料采于广西农业科学院花卉植物研究所，2014年5月22日选择健壮的铁皮石斛植株统一进行人工授粉，采集120DAP、150DAP与180DAP的果实，每次采集3个果实用于试验。

2、种子预处理

将未开裂的果实除去表面杂物，使用牙刷将果实表面清洗干净，将果实置于烧杯内流水冲洗1h后转移到无菌操作台内进行灭菌。灭菌程序为：75％酒精30s；1％次氯酸钠溶液浸泡15min；无菌水冲洗5次，每次2min。将灭菌后的果实取出在无菌滤纸上吸干水分，切开后以备播种。

3、固体培养原球茎材料

分别将铁皮石斛种子接种在实施例1获得的最适固体培养基中进行培养，置于光下、25℃培养40天，种子萌发为整齐一致的原球茎。

二、种龄对原球茎生长与多糖合成规律变化的影响

分别将步骤一获得的原球茎接种在液体培养基(液体培养基配方：1/2MS+30g/L蔗糖+1.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA+100mL/L马铃薯汁，pH为7.0)中，接种后置于摇床进行悬浮培养，悬浮培养条件如下：转速为110r/min，温度为25℃，光强为2000lx(12h/d)。每个处理接种10瓶。每隔10d检测原球茎鲜重、干重及多糖含量。取样时间为0-70d。

鲜重及干重量测定方法如下：将悬浮培养后的原球茎取出使用蒸馏水冲洗3次后用吸水纸吸干水分，测得原球茎鲜重。后平铺于培养皿上，105℃杀青30min后，80℃烘干至恒重，测得原球茎干重。干重以1L液体培养基所得计算。

多糖提取方法如下：将悬浮培养后烘干至恒重的原球茎研磨，过50目筛。精密称量干品粗粉1.0g使用滤纸包好，在索氏提取器中经石油醚(60-90℃)85℃水浴中脱脂1.5h，再用80％乙醇在95℃水浴中回流3h。后将滤纸包取出，置于烘箱中90℃烘干2h。将滤纸包内的样品使用5mL移液枪冲洗至150mL烧瓶中，料液比为1:20，于80℃水浴中提取2h，3次。将提取过滤液合并，后定容到100mL，得到提取液，摇匀。

多糖含量测定方法如下：精密吸取提取液50μL置于15mL玻璃带塞试管中，加蒸馏水补足至2.0mL，迅速加入苯酚试剂(配制：10g蒸馏苯酚溶于150mL去离子水)1.0mL摇匀，后加沿壁缓缓加入5mL浓硫酸，迅速混匀后置于室温下5min。后置于沸水中加热15min，流水冷却至室温。使用分光光度计(型号:UV-2102C)于490nm处比色，重复测3次。同时，以2.0mL蒸馏水做空白对照。将无水葡萄糖标准品置于烘箱中75℃中烘30min，制作葡萄糖标准曲线，获得线性回归方程为Y＝0.015X-0.002，R²＝0.999。通过线性回归方程获得提取液中多糖含量(mg/g)，并计算多糖产量。多糖产量计算公式如下：多糖产量(mg/L)＝原球茎干重量(g/L)×多糖含量(mg/g)。

结果如图11、图12、图13和图14所示。从图中可以看出，120DAP、150DAP与180DAP 3个不同时期种子培养获得的原球茎进行悬浮培养，在整个培养时期中原球茎鲜重逐渐增加，且3个时期生长趋势基本保持一致。最初悬浮培养10d内原球茎处于缓慢增长的状态，悬浮培养20-30d之间，原球茎鲜重迅速增加，为整个生长过程中鲜重增加最迅速的时期。这个时期内原球茎生长迅速，主要是因为培养基内养分充足，原球茎逐渐已适应液体培养的环境，且有害代谢物产物积累少，整个环境有利于原球茎的生长。以150DAP为例，培养20d后原球茎鲜重为152.64±32.13g/L，培养30d后原球茎鲜重可达443.09±36.73g/L，而悬浮培养30d之后原球茎增长缓慢，后期在培养瓶底部出现原球茎自溶的现象。原球茎干重在培养30d后达到最大值，后续培养中原球茎干重进入减数期，这可能是因为原球茎迅速增长，液体培养基中的养分被消耗殆尽，生长空间逐渐减少不利于培养瓶底部的原球茎接触空气。同样原球茎多糖含量也在培养后30d达到最大值，以150DAP为例，其原球茎多糖含量可达318.93mg/g，此时期原球茎产量也达到最大值为6075.33mg/L，此时期多糖含量与产量均达到最大值，因此在生产上可以选择悬浮培养30d后作为采集时期。后期多糖含量逐渐下降，这是因为在20-30d原球茎鲜重迅速增长导致后期基本培养基内养分消失殆尽，多糖作为一种碳源可供原球茎生长与合成代谢产物而被消耗，从而导致后期多糖含量逐渐下降。3个时期的原球茎鲜重、干重和多糖含量变化基本一致，但150DAP种子固体培养生成的原球茎多糖含量在20-50d培养过程中高于120DAP与180DAP，但差异并不明显。

三、3种基本培养基对原球茎生长和多糖合成规律变化的影响

选择180DAP的铁皮石斛种子按照步骤一中的方法进行无菌萌发培养，得到原球茎。然后将原球茎分别接种在不同的液体培养基中进行悬浮培养；不同的液体培养基的配方如下：液体基本培养基+30g/L蔗糖+1.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA+100mL/L马铃薯汁，其中液体基本培养基分别为1/2MS、N6和White，pH均调至7.0。接种后置于摇床，悬浮培养条件如下：转速为110r/min，温度为25℃，光强为2000lx(12h/d)。每个处理接种10瓶。悬浮培养30d后测定原球茎的干重、多糖含量及多糖产量。

3种基本培养基对原球茎干重、多糖含量和多糖产量的影响如表4所示。由表中可以看出，原球茎悬浮培养30d后在1/2MS、White与N6基本培养基中，原球茎干重量为1/2MS>N6>White，多糖含量与多糖产量顺序均为N6>1/2MS>White。通过对生产上最主要的指标多糖产量的数据分析发现，3种液体培养基获得的多糖产量差异性显著。铁皮石斛原球茎多糖含量在White基本培养基中增长较快，原球茎悬浮培养20d后多糖含量为73.84±0.15mg/g，至悬浮培养30d时可达148.56±0.15mg/g，但此时多糖产量仅为1612.40±1.67mg/L。与其他2种基本培养基比较，White基本培养基不适于原球茎的生长，悬浮培养到40d时多糖含量有所下降，但因原球茎干重的增加多糖产量有所增长，可达1849.16±23.03mg/L，但低于1/2MS、N6基本培养基的最初培养20d时的多糖产量。1/2MS基本培养基中原球茎干重量高于N6，但多糖含量与多糖产量均低于同时期的N6基本培养基。N6基本培养基的原球茎多糖含量与多糖产量在悬浮培养30d后可达347.53±1.69mg/g和6602.99±32.18mg/L，比1/2MS在培养30d时高出70.97mg/g和1003.33mg/L。因此，在铁皮石斛原球茎悬浮培养中，综合干重、原球茎多糖含量、原球茎多糖产量可选择N6作为基本培养基用于目的产物多糖的获得。

表4、不同液体基本培养基对铁皮石斛原球茎生长和多糖合成的影响

注：图中数据平均值±标准误，不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。

四、3种不同添加物对原球茎生长和多糖合成规律变化的影响

选择180DAP的铁皮石斛种子按照步骤一中的方法进行无菌萌发培养，得到原球茎。然后将原球茎分别接种在不同的液体培养基中进行悬浮培养；不同的液体培养基配方如下：1/2MS+30g/L蔗糖+1.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA+100mL/L添加物，添加物分别为椰汁、香蕉汁和马铃薯汁。pH均调至7.0。接种后置于摇床，悬浮培养条件如下：转速为110r/min，温度为25℃，光强为2000lx(12h/d)。每个处理接种10瓶。悬浮培养30d后测定原球茎的干重、多糖含量及多糖产量。

不同添加物对铁皮石斛原球茎生长和多糖合成的影响试验结果如表5所示。从表中可以看出，添加椰汁的培养基获得的原球茎多糖产量高于添加香蕉汁与马铃薯汁获得的原球茎多糖产量，三者之间具有显著差异性。初期悬浮培养20d后，添加椰汁的培养基获得的原球茎多糖含量与添加马铃薯汁获得的原球茎多糖含量差异较小，多糖含量较添加马铃薯汁高0.40mg/g，而多糖产量高1208.44mg/L，这主要是因为椰汁对原球茎的干重影响较大。悬浮培养30d时3种添加物椰汁、马铃薯汁和香蕉汁的培养基获得的原球茎多糖产量差异最为明显，添加香蕉汁的培养基获得的原球茎多糖产量仅为2221.45±4.42mg/L，而添加椰汁与马铃薯汁的培养基获得的原球茎多糖产量分别为6390.72±5.76mg/L和5564.85±9.30mg/L。添加香蕉汁的培养基不利于原球茎多糖的积累，而且在生产过程中，原球茎量少，且原球茎呈黄绿色，生长状况不良，透明状原球茎较多。因此，以多糖含量为指标来衡量，在基本培养基中添加椰汁与马铃薯汁两者均可获得多糖含量较高的原球茎；以多糖产量为指标来衡量，在基本培养基添加椰汁最为合适，可获得较高的多糖产量。因此，椰汁作为有机添加物，可获得较高原球茎多糖产量。但椰汁价格较高，生产上考虑生产成本，可选用马铃薯汁，也可获得多糖含量相对较高的原球茎。

表5、不同添加物对铁皮石斛原球茎生长和多糖合成的影响

注：图中数据平均值±标准误，不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。

综上所述，用于铁皮石斛原球茎悬浮培养的最适培养基是由N6基础培养基、马铃薯汁或椰汁、6-BA、NAA和蔗糖混匀得到的液体培养基，其中，马铃薯汁或椰汁在最适培养基中的浓度为100mL/L；6-BA在最适培养基中的浓度为1.0mg/L；NAA在最适培养基中的浓度为0.5mg/L；蔗糖在最适培养基中的浓度为30g/L。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛原球茎的繁殖方法，包括如下步骤：将铁皮石斛种子在无菌萌发培养基中进行萌发，得到铁皮石斛原球茎；

所述铁皮石斛种子是授粉120天后收获得到的种子；

所述无菌萌发培养基包括马铃薯汁、6-BA、NAA和活性炭。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述无菌萌发培养基是将基础培养基、马铃薯汁、6-BA、NAA和活性炭混匀得到的固体培养基。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述无菌萌发培养基中的基础培养基为B5基本培养基、MS基本培养基或1/2MS基本培养基；

所述马铃薯汁在所述无菌萌发培养基中的浓度为200mL/L；

所述6-BA在所述无菌萌发培养基中的浓度为1.0mg/L；

所述NAA在所述无菌萌发培养基中的浓度为0.5mg/L；

所述活性炭在所述无菌萌发培养基中的浓度为0.5g/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述无菌萌发的时间为40天。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述无菌萌发的条件：温度为25℃，光强为2000lx，光照时间为12h/d。

6.权利要求1-5中任一所述的方法在制备铁皮石斛多糖中的应用。

7.权利要求1-5中所述的无菌萌发培养基。

8.权利要求7所述的无菌萌发培养基在制备铁皮石斛多糖中的应用；

或，权利要求7所述的无菌萌发培养基在提高铁皮石斛种子萌发率中的应用；

或，权利要求7所述的无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎干重中的应用；

或，权利要求7所述的无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎鲜重中的应用；

或，权利要求7所述的无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎多糖含量中的应用；

或，权利要求7所述的无菌萌发培养基在提高铁皮石斛原球茎多糖产量中的应用。

9.一种用于繁殖铁皮石斛原球茎的产品，其包括权利要求7所述的无菌萌发培养基。

10.权利要求9所述的产品在制备铁皮石斛多糖中的应用；

或，权利要求9所述的产品在提高铁皮石斛种子萌发率中的应用；

或，权利要求9所述的产品在提高铁皮石斛原球茎干重中的应用；

或，权利要求9所述的产品在提高铁皮石斛原球茎鲜重中的应用；

或，权利要求9所述的产品在提高铁皮石斛原球茎多糖含量中的应用；

或，权利要求9所述的产品在提高铁皮石斛原球茎多糖产量中的应用。