CN103430844A - 栀子组织培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及栀子组织培养的方法，包括：（a）以栀子种子作为外植体，进行愈伤组织诱导；（b）将愈伤组织在液体分化培养基中分化，以得到带芽愈伤组织；（c）将带芽愈伤组织在芽增殖固体培养基中培养，以获得更多的再生芽；以及（d）将所得芽从基部切下，转接至生根培养基中以诱导生根。本发明以栀子种子为外植体，在含有不同激素配比的MS培养基上诱导愈伤组织形成；采用固体培养与液体培养相结合的方法，诱导芽及根的分化，获得栀子再生苗。本发明建立了以栀子生殖器官为外植体的组织培养体系，为进一步通过细胞培养获得栀子高含量有效成分及为栀子转基因研究构建了实验平台。

Description

栀子组织培养的方法

技术领域

本发明涉及茜草科药用植物栀子的组织培养方法，具体涉及利用栀子未成熟种子作为外植体进行组织培养的方法。 

背景技术

栀子（Gardeniajasminoides Ellis）为茜草科常绿灌木，其干燥成熟果实具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效（国家药典委员会，2010），为《中华人民共和国药典》（2010版）I部收载的临床常用中药材，也是生产“清开灵”、“安宫牛黄丸”等33种中成药的重要原料。栀子的活性成分为栀子苷、西红花苷、绿原酸等，其中西红花苷还是天然色素栀子黄色素的主要成分。培养植物细胞可以获得次级代谢产物，但培养的细胞来源不同，获得的次级代谢产物的种类和含量不一样。选择目的次级代谢产物含量高的植物组织作培养材料往往能获得高含量的目的次级代谢产物。栀子全果实、种子、果皮的栀子苷和西红花苷的含量较高，以这些器官为外植体进行细胞培养，有可能获得高含量的活性成分。木本植物的组织培养一般比较困难，目前还没有以栀子生殖器官为外植体进行愈伤组织诱导，进而分化再生成苗的报道。 

迄今为止，有关栀子组织培养的报道大致分三类：第一类是由栀子带腋芽茎段的外植体不经愈伤组织的分化，直接获得栀子的无菌苗；第二类是由胚轴、胚根、子叶、花苞作为外植体，诱导栀子愈伤组织，但未研究其分化；第三类以叶片为外植体，既诱导出愈伤组织，也成功使其分化。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种栀子的组织培养方法，该方法包括：（a）以栀子种子作为外植体，进行愈伤组织诱导；（b）将愈伤组织在液体分化培养基中分化，以得到带芽愈伤组织；（c）将带芽愈伤组织在芽增殖固体培养基中培养，以获得更多再生芽；以及（d）将所得芽从基部切下，转接至生根培养基中以诱导生根。 

在优选的方案中，所述种子是未成熟种子，该未成熟种子可取自未成熟或成熟栀子果实。 

在一个实施方式中，步骤（b）中的液体分化培养条件为温度25 ℃ ± 2 ℃，光照时间10-16 h·d^-1，光照强度20.1 ± 4.0 μmol·m^-2·s^-1，转速50-150 r·min^-1，培养基为以MS培养基为基础，添加NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和TDZ 0.05-0.15 mg·L^-1，或以MS培养基为基础，添加NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和6-BA 2.0 mg·L^-1，优选为MS培养基+NAA0.05 mg·L^-1+TDZ 0.10 mg·L^-1。 

在一个实施方式中，步骤（c）中的固体芽增殖培养基为以MS培养基为基础，添加琼脂以及NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和TDZ 0.05-0.15 mg·L^-1，或以MS培养基为基础，添加琼脂以及NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和6-BA 2 mg·L^-1，优选为MS培养基+琼脂+NAA 0.05 mg·L^-1 +TDZ 0.1mg·L^-1。 

在一个实施方式中，步骤（d）中的生根培养基为MS培养基+ NAA 0.5 mg·L^-1 + 6-BA 2.0 mg·L^-1。 

在一个实施方式中，步骤（d）中生根培养的培养条件：温度25 ℃ ± 2 ℃，湿度40%～60%，光照强度33.6 ± 0.7 μmol·m^-2·s^-1。 

在一个实施方式中，步骤（d）中从基部切下的芽的长度为1-2 cm。 

在一个实施方式中，步骤（a）中愈伤组织诱导使用的培养基为MS培养基+2,4-D 0.5-1 mg·L^-1+ 6-BA 0.25-1 mg·L^-1，优选为MS培养基+2,4-D 0.5-1 mg·L^-1+ 6-BA 0.25-0.5 mg·L^-1。 

本发明以栀子种子为外植体，在含有不同激素配比的MS培养基上诱导愈伤组织形成；采用固体培养与液体培养相结合的方法，诱导芽及根的分化，获得栀子再生苗。本发明建立了以栀子生殖器官为外植体的组织培养体系，为进一步通过细胞培养获得栀子高含量有效成分及为栀子转基因研究构建了实验平台。 

本发明通过培养基种类和培养方式的改变，只有种子愈伤组织能够分化出芽，而果皮和种子团愈伤组织没有出现芽的分化。虽然经过液体培养能从种子愈伤组织中分化出芽，也尽管分化率只有8.75%，而同样的培养方式未能使果皮及种子团愈伤组织分化，说明以栀子的生殖器官为外植体获得的愈伤组织难以分化。如果是以栀子营养器官为外植体，目前只有少数报道称能从栀子叶片愈伤组织中分化出芽。 

具体实施方式

本发明选取栀子的果皮、种子团、种子作为外植体，分别进行愈伤组织诱导、分化、芽增殖和生根培养，从而评价果实的不同部分作为外植体时，栀子组织培养的可行性。 

1. 植物材料 

以栀子的果皮、种子团、种子作为外植体。栀子采自广东省梅州市平远县栀子GAP基地。将青色的、未成熟新鲜栀子果实分割为果皮、种子团（由胎座和未成熟种子组成）、种子，于自来水下冲洗，直至色素冲洗干净为止（2-3 h）。在超净工作台上将3种外植体一起放入70%乙醇中浸泡30 s，然后用0.1% HgCl₂浸泡9 min，最后用无菌水冲洗5-6次，转移至消毒好的无菌滤纸上吸干外植体表面的水分，备用。

2. 培养基成分和培养条件 

2.1 培养基成分

以MS培养基为基本培养基，附加蔗糖30 g·L^-1，pH5.8-6.0。各种培养基是在基本培养基中分别添加2,4-D（2,4-二氯苯氧基，购自Aladdin Chemistry Co. Ltd.）、NAA（萘乙酸，购自Aladdin Chemistry Co. Ltd.）、6-BA（6-苄氨基嘌呤，购自Aladdin Chemistry Co. Ltd.）、TDZ（N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲，购自上海源聚生物科技有限公司）等（表1、表2）。固体培养基含琼脂7.5 g·L^-1，液体培养基不含琼脂。

2.2 愈伤组织的诱导 

在无菌条件下将经消毒的果皮、种子团切成约5 mm × 5 mm的小块；将饱满、白色、大小约1-2 mm的未成熟种子从种子团中挑出，剥去种皮，随机切成两半。将三种外植体分别接种在愈伤组织诱导培养基（见表1）中，果皮、种子团每瓶接种1块，种子每瓶接种5块。在温度25 ℃ ± 2 ℃、湿度40%-60%的培养条件下暗培养。培养30 d天后，筛选生长良好的愈伤组织，继代3次，获得适合液体培养的愈伤组织。

2.3 愈伤组织的分化 

将继代所得愈伤组织块接种于液体培养基（见表2）中培养30 d。液体培养条件：温度25 ℃ ± 2 ℃，光照时间13 h·d^-1，光照强度20.1 ± 4.0 μmol·m^-2·s^-1，转速100 r·min^-1。

2.4 芽的增殖 

液体培养30 d后，将带芽愈伤组织块转移至芽增殖培养基中进行固体培养。每瓶接种4块带芽愈伤组织，每隔30 d继代一次。

2.5 生根培养 

将长1-2 cm的芽从基部切下，转接至生根培养基中诱导生根。培养条件：温度25 ℃ ± 2 ℃，湿度40%-60%，光照强度33.6 ± 0.7 μmol·m^-2·s^-1。

2.6 结果统计 

2.6.1 愈伤组织诱导率

分别在外植体培养第10、20、30、40 d，观察愈伤组织诱导情况，统计诱导率。诱导率 = （出愈外植体数/接种外植体总数）×100%。

2.6.2 愈伤组织分化率 

液体培养30 d，统计愈伤组织分化率。分化率 = （分化出芽的愈伤组织块数/愈伤组织总块数）×100%。

2.6.3 芽增殖系数 

液体培养后将芽转移至固体培养基中培养30 d，并继代一次，分别统计每次固体培养的全部的芽数。芽增殖系数 = 全部增殖芽数/接种芽数。

3. 结果与讨论 

3.1 不同激素组合对三种外植体的愈伤组织诱导的影响

不同培养基对三种外植体愈伤组织诱导的结果见表1。适宜果皮和种子脱分化形成愈伤组织的培养基激素组合都是MS-A，两者出愈时间大致相同；适宜种子团形成愈伤组织的是MS-D，出愈时间比果皮和种子的出愈时间稍长。果皮和种子在培养9-10 d后开始从切口边缘长出浅黄色愈伤组织；种子团培养15 d后才开始从切口面长出浅黄色愈伤组织。三种外植体形成的愈伤组织的质量不同。果皮出愈时间虽短，但极易褐化，较难进行继代培养；种子出愈时间与果皮相似，愈伤组织生长状态很好，且不易褐化；种子团出愈时间最迟，愈伤组织生长状态却很好，也不易褐化。

表1结果表明，果皮、种子两种外植体在MS-A培养基上诱导效果较好，诱导率分别达到83.3%和88.5%；种子团外植体在MS-D培养基上的诱导率则为78.1%。结果表明适当浓度的2,4-D和6-BA配比，对栀子果实各部分愈伤组织的诱导具有一定的促进作用。果皮、种子较适宜的诱导培养基为MS-A，种子团较适宜的诱导培养基为MS-D。 

表1 不同激素组合对三种外植体愈伤组织诱导的影响 

3.2 不同培养法对芽分化的影响

将三种外植体诱导形成的愈伤组织进行芽分化培养，采用不同的固体培养基进行了多次实验，都没有分化出芽。然而，将来自种子的愈伤组织进行液体培养，可以得到少量的芽。而将来自果皮和种子团的愈伤组织按同样的方法进行芽分化培养，却仍然不能获得再生芽。

3.3 不同激素组合对种子愈伤组织分化的影响 

将经过液体培养并且有芽形成的种子愈伤组织，转入芽增殖培养基中培养，结果见表2。结果表明，种子愈伤组织在不同的激素组合下进行液体培养，除Y-E和Y-F外，都能不同程度地分化出芽，但愈伤组织分化率都处于较低水平，说明种子愈伤组织也还是较难分化。Y-B培养基上的分化率最高，达8.75％。在五种可分化的培养基中，含TDZ的有三种，含6-BA的有一种，因而与6-BA相比，TDZ能较好地促进芽的分化，并呈现出浓度效应。值得注意的是，在没有添加TDZ和6-BA的Y-D培养基中也有一定比例的芽分化，然而，在芽增殖过程中，生长情况不好（见下文）。

表2  不同激素组合对种子愈伤组织芽分化的影响 

3.4 不同激素组合对再生芽增殖系数的影响

为了获得更多的再生芽，将芽转移至固体培养基中繁殖，结果见表3。第一次固体培养30 d后，来源于Y-C和Y-G的芽各有一个枯萎死亡，芽增殖系数低于1。继代培养后，来源于不同液体培养基的芽增殖系数差异较大。来源于Y-G培养基的增殖系数最大，达到7；而来源于Y-D培养基的增殖系数最小，只有1.5。不仅如此，来源于Y-D培养基的芽，颜色都呈现黄色，在进一步的增殖继代培养中枯萎死亡。来源于Y-B培养基的芽，在进一步的增殖继代培养中，芽生长良好，数量也多。因此，综合分化率和增殖系数分析，Y-B培养基是适合栀子种子外植体愈伤组织分化的最佳培养基。通过芽增殖培养，很好地弥补了愈伤组织分化率低导致的再生植株少的问题。

表3  不同激素组合对再生芽增殖系数的影响 

3.5 生根培养

经增殖培养继代1次后，可获得一定数量且生长良好的芽。将芽从基部切下，转移至生根培养基中培养。约15 d后，在切口处出现白色的突起；30 d后，由突起长成粗壮的根。

液体培养促进愈伤组织分化的原因，可能是通过液体培养调整了愈伤组织细胞的状态，使之适宜分化。本发明的愈伤组织诱导培养基中的生长素含量比分化培养基的高10倍，推测液体培养因使细胞较充分地接触培养基，可以降低细胞的生长素含量和固培方式下在细胞与培养基接触面累积的不利分化的物质。从种子诱导愈伤组织并分化成苗，有望构建高药效成分含量的转基因实验平台。 

Claims (10)

1.栀子组织培养的方法，包括：

（a）以栀子的种子作为外植体，进行愈伤组织诱导；

（b）将愈伤组织在液体分化培养基中分化，以得到带芽愈伤组织；

（c）将带芽愈伤组织在芽增殖固体培养基中培养，以获得更多再生芽；

（d）将所得芽从基部切下，转接至生根培养基中以诱导生根。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子是取自未成熟果实中的未成熟种子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（b）中的液体分化培养条件为温度25 ℃ ± 2 ℃，光照时间10-16 h·d^-1，光照强度20.1 ± 4.0 μmol·m^-2·s^-1，转速50-150 r·min^-1，培养基为以MS培养基为基础，添加NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和TDZ 0.05-0.15 mg·L^-1，或以MS培养基为基础，添加NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和6-BA 2.0 mg·L^-1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（c）中的芽增殖固体培养基以MS培养基为基础，添加琼脂以及NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和TDZ 0.05-0.15 mg·L^-1，或以MS培养基为基础，添加琼脂以及NAA 0.025-0.1 mg·L^-1和6-BA 2.0 mg·L^-1。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤（c）中的芽增殖固体培养基为MS培养基+琼脂+NAA 0.05 mg·L^-1 +TDZ 0.1mg·L^-1。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（d）中的生根培养基为MS培养基+ NAA 0.5 mg·L^-1 + 6-BA 2.0 mg·L^-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（d）中生根培养的培养条件：温度25 ℃ ± 2 ℃，湿度40%～60%，光照强度33.6 ± 0.7 μmol·m^-2·s^-1。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（d）中从基部切下的芽的长度为1-2 cm。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（a）中愈伤组织诱导使用的培养基为MS培养基+2,4-D 0.5-1 mg·L^-1+ 6-BA 0.25-1 mg·L^-1。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤（a）中愈伤组织诱导使用的培养基为MS培养基+2,4-D 0.5-1 mg·L^-1+ 6-BA 0.25-0.5 mg·L^-1。