CN116019011A - 一种栀子同源四倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物多倍体技术领域。本发明提供了一种栀子同源四倍体的诱导方法，包括如下步骤：(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。本发明得到的四倍体栀子与二倍体在叶面积指数、叶长、叶宽等叶片的形态指标均存在显著差异，为进一步开展栀子同源四倍体的遗传机理研究提供实验材料。
Description
技术领域
本发明涉及植物多倍体技术领域，尤其涉及一种栀子同源四倍体的诱导方法。
背景技术
栀子主产于江西、湖南、湖北、浙江等地，是茜草科植物栀子的果实。栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。栀子喜温暖湿润气候，生于海拔10～1500米处的旷野、丘陵、山谷、山坡、溪边的灌丛或林中，适宜生长在疏松、肥沃、排水良好、轻粘性酸性土壤中，抗有害气体能力强，萌芽力强，耐修剪。
药用植物多倍体育种是用适宜浓度秋水仙素或低温诱导处理萌发种子或幼嫩外植体，利用人工诱变或自然变异的方式增加染色体组来改造中药材的遗传基础，从而选育符合人们需要的优良品种。药用植物多倍体植株的特点是茎秆粗壮，具备更强的抗逆性，在形态上表现出“巨大性”，内在药用活性成分也会相应增加，在以收获全草、根茎、叶和花等营养器官为目的中药材提取物生产方面具有一定优越性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种栀子同源四倍体的诱导方法，为进一步开展栀子同源四倍体的遗传机理研究提供实验材料。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种栀子同源四倍体的诱导方法，包括如下步骤：
(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。
作为优选，步骤(1)中所述的消毒方法为：将栀子种子用70～80％的酒精浸泡25～35s，再用0.1～0.2％的HgCl2浸泡6～8min。
作为优选，步骤(1)中所述无菌培养基为：WPM+6-BA1.8～2.2mg/L+NAA 0.8～0.12mg/L，培育的时间为10～18d。
作为优选，步骤(2)中所述小块的大小为0.3～0.7cm×0.3～0.7cm。
作为优选，步骤(2)中所述愈伤诱导培养基为：MS+NAA 0.8～1.2mg/L+2,4-D 1.5～2.5mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，培育的时间为10～18d。
作为优选，步骤(3)中所述不定芽诱导培养基为：MS+6-BA 1.5～2.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖25～30g/L，培育的时间为10～18d。
作为优选，步骤(3)中所述处理时用秋水仙素溶液浸泡栀子不定芽，所述秋水仙素溶液的浓度为0.08～0.12％，处理的时间为66～78h。
作为优选，步骤(4)中所述生根培养基为：MS+IBA 0.4～0.6mg/L，培育的时间为10～18d。
作为优选，步骤(5)中所述培养基包括如下体积份的组分：蛭石1.5～2.5份、营养土0.8～1.2份、珍珠岩0.8～1.2份。
本发明提供了一种栀子同源四倍体的诱导方法，包括如下步骤：(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。本发明得到的四倍体栀子与二倍体在叶面积指数、叶长、叶宽等叶片的形态指标均存在显著差异，为进一步开展栀子同源四倍体的遗传机理研究提供实验材料。
附图说明
图1为栀子二倍体(左)和四倍体(右)根尖染色体数；
图2为栀子二倍体(左)和四倍体(右)无菌苗。
具体实施方式
本发明提供了一种栀子同源四倍体的诱导方法，包括如下步骤：
(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。
在本发明中，步骤(1)中所述的消毒方法优选为：将栀子种子用70～80％的酒精浸泡25～35s，再用0.1～0.2％的HgCl2浸泡6～8min，进一步优选为将栀子种子用75％的酒精浸泡30s，再用0.1％的HgCl2浸泡7min。
在本发明中，步骤(1)中所述无菌培养基优选为：WPM+6-BA1.8～2.2mg/L+NAA 0.8～0.12mg/L，进一步优选为WPM+6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L，培育的时间优选为10～18d，进一步优选为14d。
在本发明中，步骤(2)中所述小块的大小优选为0.3～0.7cm×0.3～0.7cm，进一步优选为0.5×0.5cm。
在本发明中，步骤(2)中所述愈伤诱导培养基优选优选为：MS+NAA 0.8～1.2mg/L+2,4-D 1.5～2.5mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，进一步优选为MS+NAA 1.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+琼脂7.2～7.3g/L+蔗糖27～28g/L，培育的时间优选为10～18d，进一步优选为14d。
在本发明中，步骤(3)中所述不定芽诱导培养基优选为：MS+6-BA 1.5～2.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖25～30g/L，进一步优选为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖27～28g/L，培育的时间优选为10～18d，进一步优选为14d。
在本发明中，步骤(3)中所述处理时优选用秋水仙素溶液浸泡栀子不定芽，所述秋水仙素溶液的浓度优选为0.08～0.12％，进一步优选为0.1％，处理的时间优选为66～78h，进一步优选为12h。
在本发明中，步骤(4)中所述生根培养基优选为：MS+IBA0.4～0.6mg/L，进一步优选为，培育的时间为10～18d，进一步优选为14d。
在本发明中，步骤(5)中所述培养基优选包括如下体积份的组分：蛭石1.5～2.5份、营养土0.8～1.2份、珍珠岩0.8～1.2份，进一步优选为蛭石2份、营养土1份、珍珠岩1份。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将栀子种子用70％的酒精浸泡35s，再用0.2％的HgCl2浸泡6min，后接种到无菌培养基(WPM+6-BA 2.2mg/L+NAA 0.8mg/L)中，培育18d得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成0.3cm×0.3cm小块并接种到愈伤诱导培养基(MS+NAA 0.8mg/L+2,4-D 2.5mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖25g/L)中，培育10d得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖25g/L)中，培育10d得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用0.12％秋水仙素溶液处理66h后接种到生根培养基(MS+IBA0.6mg/L)中，培育18d得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基(蛭石1.5份、营养土1.2份、珍珠岩1.2份)中，培育得到栀子同源四倍体。
实施例2
(1)将栀子种子用80％的酒精浸泡25s，再用0.1％的HgCl2浸泡8min，后接种到无菌培养基(WPM+6-BA 1.8mg/L+NAA 0.12mg/L)中，培育10d得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成0.7cm×0.7cm小块并接种到愈伤诱导培养基(MS+NAA 1.2mg/L+2,4-D 1.5mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L)中，培育18d得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L)中，培育18d得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用0.08％秋水仙素溶液处理78h后接种到生根培养基(MS+IBA0.4mg/L)中，培育10d得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基(蛭石2.5份、营养土0.8份、珍珠岩0.8份)中，培育得到栀子同源四倍体。
实施例3
(1)将栀子种子用75％的酒精浸泡30s，再用0.1％的HgCl2浸泡7min，后接种到无菌培养基(WPM+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L)中，培育15d得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成0.5cm×0.5cm小块并接种到愈伤诱导培养基(MS+NAA 1.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖27g/L)中，培育14d得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖28g/L)中，培育14d得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用0.1％秋水仙素溶液处理72h后接种到生根培养基(MS+IBA0.5mg/L)中，培育15d得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基(蛭石2份、营养土1份、珍珠岩1份)中，培育得到栀子同源四倍体。
试验例(以实施例3培育的栀子同源四倍体为对象)
1.栀子根尖染色体鉴定结果
采用根尖染色体鉴定，经秋水仙素诱变后的疑似四倍体和二倍体在卡诺固定液(乙醇：冰醋酸＝3:1)常温固定12h，在1mol/L的盐酸60℃解离1min，卡宝品红染色7min，压片镜检。经过形态学和解刨学鉴定的栀子植株，进行根尖染色体鉴定，栀子二倍体染色体数为2n＝2X＝22，同源四倍体植株染色体数为2n＝4X＝44
表1不同秋水仙素浓度对栀子多倍体芽体的诱导效果
2.栀子四倍体形态鉴别结果
由表2可知，经秋水仙素诱变后的外形变异较大的植株叶面积指数、叶长、叶宽均显著增加，且叶厚是亲本的2.3倍。与二倍体相比，疑似四倍体栀子在试管苗阶段出现叶片大且厚，叶色深绿的特点，而且同一生长时期的四倍体植株的根系比二倍体粗大。
表2二倍体和同源四倍体栀子叶片比较
| 植株类型 | 叶面积指数 | 叶长(cm) | 叶宽(cm)) | 叶厚(mm) |
| 二倍体栀子 | 1.3±0.7 | 1.8±0.37 | 1.3±0.2 | 1.9±0.6 |
| 四倍体栀子 | 2.1±1.1 | 2.3±0.5 | 1.7±0.3 | 4.0±1.2 |
3.不同激素浓度对不定芽增殖的影响
表3不同激素浓度对不定芽增殖的影响
由以上实施例可知，本发明提供了一种栀子同源四倍体的诱导方法，包括如下步骤：(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。本发明得到的四倍体栀子与二倍体在叶面积指数、叶长、叶宽等叶片的形态指标均存在显著差异，为进一步开展栀子同源四倍体的遗传机理研究提供实验材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种栀子同源四倍体的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将栀子种子消毒后接种到无菌培养基中，培育得到栀子无菌苗；
(2)将栀子无菌苗的叶片切成小块并接种到愈伤诱导培养基中，培育得到栀子愈伤组织；
(3)将栀子愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，培育得到栀子不定芽；
(4)将栀子不定芽用秋水仙素处理后接种到生根培养基中，培育得到栀子试管苗；
(5)将栀子试管苗移栽到培养基中，培育得到栀子同源四倍体。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒方法为：将栀子种子用70～80％的酒精浸泡25～35s，再用0.1～0.2％的HgCl2浸泡6～8min。
3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，步骤(1)中所述无菌培养基为：WPM+6-BA1.8～2.2mg/L+NAA0.8～0.12mg/L，所述培育的时间为10～18d。
4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，步骤(2)中所述小块的大小为0.3～0.7cm×0.3～0.7cm。
5.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，步骤(2)中所述愈伤诱导培养基为：MS+NAA0.8～1.2mg/L+2,4-D1.5～2.5mg/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，培育的时间为10～18d。
6.根据权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，步骤(3)中所述不定芽诱导培养基为：MS+6-BA1.5～2.5mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+蔗糖25～30g/L，培育的时间为10～18d。
7.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，步骤(3)中所述处理时用秋水仙素溶液浸泡栀子不定芽，所述秋水仙素溶液的浓度为0.08～0.12％，处理的时间为66～78h。
8.根据权利要求7所述的诱导方法，其特征在于，步骤(4)中所述生根培养基为：MS+IBA0.4～0.6mg/L，培育的时间为10～18d。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的诱导方法，其特征在于，步骤(5)中所述培养基包括如下体积份的组分：蛭石1.5～2.5份、营养土0.8～1.2份、珍珠岩0.8～1.2份。
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