CN112385547A - 一种通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法，包括以下步骤：首先取长筒石蒜无菌苗的健康叶片接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导，控制培养温度在24‑26℃，然后在光照时间10‑14h/天、光照强度为1400‑1800lx下培养30天，接着将所得长筒石蒜愈伤组织转入分化培养基中培养30天，最后将彩叶杨无菌苗接入生根培养基中进行生根培养20天。通过该方法能够有效的解决长筒石蒜离体快速繁殖的问题。
Description
技术领域
本发明涉及长筒石蒜组织培养繁殖方法，具体涉及一种通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法，属于草本观赏植物种苗繁殖的技术领域。
背景技术
长筒石蒜(Lycoris radiata （L’Her.）Herb.)是石蒜科石蒜属的一种。多年生草本植物。地下茎肥厚。叶舌形，于花期后自基部抽生。花葶高30-60厘米，伞形花序顶生，花鲜红，花筒较短，花被片狭倒披针形，向外翻卷，雄蕊及花柱伸出，姿态秀丽，花期7月~9月，盛开在七月，生长于夏日。性喜阴湿环境，怕强光直射，宜生长于疏松肥沃的沙壤土。原产于中国和日本，世界各地广为栽培。是优良的宿根草本花卉，园林中常用作背阴处绿化，可作花坛或花径材料，亦是美丽的切花。鳞茎有毒，入药有催吐、祛痰、消肿、止痛之效。
目前该品种种苗数量在国内非常少，相关研究表明石蒜属植物在自然状态下分球繁殖系数很低，而种子繁殖无法保证花色的遗传性状，因此长筒石蒜资源紧缺，其应用受到了限制。
有关长筒石蒜及其同属植物的组织培养，国内外鲜有报道。单卓以鳞茎为外植体，进行了香石蒜组培快繁的研究（香石蒜的组培快繁技术研究，园林科技，2012年第3期，8-11页）。朱锦等以石蒜的鳞茎为材料研究了小鳞茎的分化和增殖（石蒜组培繁殖技术的研究，浙江林业科技，2002年第4期，45-48页）。以往研究均得到了石蒜属其他种的增殖培养基和生根培养基，多以鳞茎为外植体，常出现污染率高和增殖率相对比较低的问题。而高增殖率低污染率的石蒜属植物组织培养快速繁殖方法尚未建立。
综上所述，采取组织培养繁殖长筒石蒜是解决长筒石蒜资源短缺的重要途径之一，对长筒石蒜的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是公开通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法。
为解决该技术采用如下的技术方案：
一种通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1）外植体选择与消毒：于8月底，选取长筒石蒜初花期的花轴顶点为外植体，消毒；
步骤2）不定芽的诱导：取消毒后的外植体接种于诱导培养基中进行不定芽诱导，控制培养温度在24-26℃；首先在黑暗中培养24h，然后进行红光培养1天+正常培养44天，
步骤3）继代培养与增殖：将步骤2）所得长筒石蒜不定芽苗切割后接入继代培养基中，进行继代培养；
步骤4）根的诱导：将步骤3）继代培养所得长筒石蒜试管苗接入生根培养基中进行生根培养15天，培养温度26℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx。
进一步地，
所述消毒为：用洗涤剂溶液振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.2%的升汞消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min；
进一步地，
所述正常培养为：光照时间14h/天，光照强度为1800lx，所述红光培养为：红光的强度为3000-5000lx。
进一步地，
所述诱导培养基为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L。
进一步地，
所述继代培养基为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L。
进一步地，
所述生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0 mg/L。
更进一步地，
所述红光的波长为600-760nm。
优选地，所述红光的波长为700nm。
本发明相对现有技术的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明在长筒石蒜外植体不定芽的诱导过程中，开拓性地在先采用高强度的红光处理后正常培养的条件，能够明显提高不定芽的诱导率，可能原因是一定强度和波长的红外光能够激活诱导外植体愈伤组织不定芽萌生需要的酶体系，从而促进了愈伤组织不定芽的诱导率，也可能是促进了6-BA 和NAA对外植体诱导作用。而继代增殖和根诱导过程中采用红光处理并没有正向促进作用。本发明还发现，在没有6-BA 和NAA存在的条件下，红光对外植体的诱导也没有实质影响。
长筒石蒜繁殖通常采用分植鳞茎繁殖，3-4年分栽一次，增殖率非常低。而采用组织培养的方法对长筒石蒜进行繁殖，能够有效的得到大量的长筒石蒜无菌苗，解决长筒石蒜快速繁殖的问题；通过对最佳外植体、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，能够使得诱导萌动率以及生根率大幅提升，能够高效的得到长筒石蒜无菌苗。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
外植体筛选实施例
以长筒石蒜鳞茎盘、花序轴基部、花序轴顶部和花瓣基部4个部位为外植体，比较不同部位外植体的污染率以及对长筒石蒜诱导不定芽的影响。
消毒方法均采用“洗涤剂溶液振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.2%的升汞消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min”。培养于诱导培养基MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L。每处理接外植体100个，45d后统计污染率、诱导率和诱导倍数。
试验结果见表1，从表1可以看出最佳外植体为花序轴顶部，不仅污染率低、诱导率高，不定芽倍数也是最高。
表1 外植体部位对长筒石蒜诱导不定芽的影响
| 外植体部位 | 污染率% | 诱导率% | 不定芽倍数 |
| 鳞茎盘 | 89 | 80 | 2.1 |
| 花序轴基部 | 84 | 40 | 1.5 |
| 花序轴顶部 | 45 | 94 | 3.9 |
| 花瓣基部 | 47 | 31 | 1.5 |
诱导培养基筛选实施例
以花序轴顶部为外植体，消毒处理后，接种于含不同激素（BA与NAA）配比的诱导培养基上，比较不同培养基对诱导不定芽的影响。观察外植体发育情况，45d后统计不定芽诱导率和诱导倍数。
从表2可看出，在MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L培养基上，外植体发育最好，诱导率最高，诱导不定芽数最多。
表2 诱导培养基对长筒石蒜诱导不定芽的影响
| 培养基配方 | 诱导率% | 不定芽倍数 |
| MS+玉米素 2mg/L +NAA0.2 mg/L | 88 | 2.4 |
| MS+KT 2mg/L +NAA0.2 mg/L | 74 | 1.1 |
| MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L | 94 | 3.9 |
| MS+6-BA1mg/L +NAA0.2 mg/L | 80 | 1.7 |
红光诱导筛选实施例
以花序轴顶部为外植体，消毒处理后，接种于MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L培养基上，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常培养45天或者红光培养1天+正常培养44天，所述正常培养为：光照时间14h/天，光照强度为1800lx，所述红光培养为：红光具有620-760nm波长的电磁辐射，光强度为4800lx。由表3可以看出，红光具有700nm波长的电磁辐射，外植体发育最好，诱导率最高，诱导不定芽数最多，而常规正常培养45天的诱导率为83%，不定芽倍数为3.2。
表3 红光波长对长筒石蒜诱导不定芽的影响
| 波长 nm | 诱导率% | 不定芽倍数 |
| 620 | 88 | 3.4 |
| 640 | 87 | 3.5 |
| 660 | 90 | 3.7 |
| 680 | 92 | 3.6 |
| 700 | 94 | 3.9 |
| 720 | 93 | 3.8 |
| 740 | 91 | 3.8 |
| 760 | 91 | 3.7 |
实施例1
1、外植体选择与消毒：于8月底，选取长筒石蒜初花期的花轴顶点为外植体，消毒方法用洗涤剂溶液振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.2%的升汞消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min，共处理100个外植体；
2、不定芽的诱导：取消毒后的外植体以花轴顶点为中心位置上下各切割保留1cm长（几个分支长度相等），将外植体接种于诱导培养基MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L中进行不定芽诱导，控制培养温度在26℃，
首先在黑暗中培养24h，然后进行红光培养1天+正常培养44天，所述正常培养为：光照时间14h/天，光照强度为1800lx，所述红光培养为：红光具有720nm波长的电磁辐射，光强度为4800lx。45天后外植体污染率为45%，诱导率约为94%，即52个外植体上长出2-5个数目不等的不定芽，平均每个外植体增殖3.9个；
3、继代培养与增殖：将长筒石蒜不定芽苗切割后接入继代培养基MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L中，每瓶接种1个，共接201瓶，进行继代培养25天，培养温度26℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx，培养25天后，继代增殖倍数为3倍，可得无菌苗603株，再进行继代2次后（每次间隔25天，平均增殖3倍）可得无菌苗5427株；
4、根的诱导：将继代培养所得长筒石蒜试管苗接入生根培养基1/2MS+IBA 1.0 mg/L中进行生根培养15天，培养温度26℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx，生根率达92%，至此共得4993株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种通过愈伤途径建立长筒石蒜再生体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1）外植体选择与消毒：于8月底，选取长筒石蒜初花期的花轴顶点为外植体，消毒；
步骤2）不定芽的诱导：取消毒后的外植体接种于诱导培养基中进行不定芽诱导，控制培养温度在26℃；首先在黑暗中培养24h，然后进行红光培养1天+正常培养44天，
步骤3）继代培养与增殖：将步骤2）所得长筒石蒜不定芽苗切割后接入继代培养基中，进行继代培养；
步骤4）根的诱导：将步骤3）继代培养所得长筒石蒜试管苗接入生根培养基中进行生根培养15天，培养温度26℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒为：用洗涤剂溶液振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.2%的升汞消毒15min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常培养为：光照时间14h/天，光照强度为1800lx，所述红光培养为：红光的强度为3000-5000lx。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养基为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.2 mg/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0 mg/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红光的波长为600-760nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述红光的波长为700nm。
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| 穆红梅 等: "以花序轴为外植体的中国石蒜的组织培养研究", 《中国观赏园艺研究进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116369203A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-07-04 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种石蒜属植物花序再生培养基和花序再生方法 |
| CN116369203B (zh) * | 2023-03-20 | 2024-03-15 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种石蒜属植物小花再生培养基及小花再生方法 |
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| CN112385547B (zh) | 2022-04-01 |
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