CN105475143A - 一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，所述方法中主要包括以下步骤：步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。本发明利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，不仅使石蒜的外植体来源更为广泛易得，而且诱导成功率大幅度提高，诱导成功率达到80％以上，相对于传统的利用石蒜鳞茎为外植体进行诱导的方法提高至少30％，从根本上解决了石蒜的快速繁殖的技术问题。此外，通过该种方法诱导培养所得植株也更为健壮，成活率高，生长速度快。
Description
技术领域
本发明涉及植物快速繁殖技术领域，尤其涉及一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法。
背景技术
近年来市场上对石蒜属植物的需求量日益增加，但石蒜有性杂交结实率(禾谷类作物饱满谷粒占颖花总数的百分率)很低，大部分是花而不实；其自然分球繁殖系数低、速度慢，因而石蒜的快速繁殖技术成为迫切需要解决的问题。
目前对石蒜组织培养的研究较多，但一般以其鳞茎等为外植体，通过器官发生途径获得再生植株，但是这种方法的诱导率较低，一般不足50％。目前，还没有利用石蒜的种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株的技术。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，诱导率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，主要包括以下步骤：
步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；
步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤1中，诱导愈伤组织所用培养基为愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为30-38g/L、琼脂6.9-7.5g/L，pH值调为5.5-6.0。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为35g/L、琼脂7.1g/L，pH值调为5.8。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，以长筒石蒜的种子胚为材料诱导愈伤组织，具体的操作方法包括以下步骤：
步骤1.1.1、种子无菌材料的制备，将长筒石蒜种子顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得种子无菌材料；
步骤1.1.2无菌操作取出所述种子无菌材料中的完整种胚，即得种子胚；
步骤1.1.3将所述种子胚接种于所述愈伤组织诱导培养基上；
步骤1.1.4进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，以长筒石蒜的花朵为材料诱导愈伤组织；具体的操作方法包括以下步骤：
步骤1.2.1、花朵无菌材料的制备，将长筒石蒜花朵顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；取花朵的花被片、花丝或花茎，并切成4-6mm×4-6mm的小块，用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得花朵无菌材料；
步骤1.2.2将所述花朵无菌材料接种于所述愈伤组织诱导培养基上；
步骤1.2.3进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤2中诱导不定芽采用不定芽诱导培养基，所述不定芽诱导培养基的主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L；
不定芽诱导培养的温度为25±1℃，自然光照培养，培养时间5-25天。
优选的是，所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤2中生根诱导采用生根诱导培养基，所述生根诱导培养基的主要成分为：MS+NAA0.2mg/L；
生根诱导不定芽诱导培养的温度为25±1℃，自然光照培养，培养时间5-25天。
本发明至少包括以下有益效果：本发明利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，不仅使石蒜的外植体来源更为广泛易得，而且诱导成功率大幅度提高，诱导成功率达到80％以上，相对于传统的利用石蒜鳞茎为外植体进行诱导的方法提高至少30％，从根本上解决了石蒜的快速繁殖的技术问题。此外，通过该种方法诱导培养所得植株也更为健壮，成活率高，生长速度快。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，主要包括以下步骤：步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。
本发明利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，不仅使石蒜的外植体来源更为广泛易得，而且诱导成功率大幅度提高，诱导成功率达到80％以上，相对于传统的利用石蒜鳞茎为外植体进行诱导的方法提高至少30％，从根本上解决了石蒜的快速繁殖的技术问题。此外，通过该种方法诱导培养所得植株也更为健壮，成活率高，生长速度快。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤1中，诱导愈伤组织所用培养基为愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L。所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为30-38g/L、琼脂6.9-7.5g/L，pH值调为5.5-6.0。以MS为基本培养基，然后添加不同浓度的2,4-D及6-BA进行长筒石蒜愈伤组织的诱导，每种材料都用4种配方诱导作对比试验，不同愈伤组织诱导培养基配方下的诱导成功率见表1。
表1不同愈伤组织诱导培养基配方下的诱导成功率统计表
| 配方序号 | 培养基配方 | 诱导成功率 |
| 1 | MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L | 88.7％ |
| 2 | MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L | 82.5％ |
| 3 | MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L | 80.2％ |
| 4 | MS+2,4-D 2.5mg/L+6-BA 1.0mg/L | 81.1％ |
由表1可知，诱导培养基配方对诱导成功率产生一定的影响，愈伤组织诱导培养基主要成分为MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L的配方诱导成功率显著高于其他配方，达到85％以上。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为35g/L、琼脂7.1g/L，pH值调为5.8。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，以长筒石蒜的种子胚为材料诱导愈伤组织，具体的操作方法包括以下步骤：步骤1.1.1、种子无菌材料的制备，将长筒石蒜种子顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得种子无菌材料；步骤1.1.2无菌操作取出所述种子无菌材料中的完整种胚，即得种子胚；步骤1.1.3将所述种子胚接种于所述愈伤组织诱导培养基上；步骤1.1.4进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，以长筒石蒜的花朵为材料诱导愈伤组织；具体的操作方法包括以下步骤：步骤1.2.1、花朵无菌材料的制备，将长筒石蒜花朵顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；取花朵的花被片、花丝或花茎，并切成4-6mm×4-6mm的小块，用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得花朵无菌材料；步骤1.2.2将所述花朵无菌材料接种于所述愈伤组织诱导培养基上；步骤1.2.3进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤2中诱导不定芽采用不定芽诱导培养基，所述不定芽诱导培养基的主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L；不定芽诱导培养的温度为25±1℃，自然光照培养，培养时间5-25天。
所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法中，步骤2中生根诱导采用生根诱导培养基，所述生根诱导培养基的主要成分为：MS+NAA0.2mg/L。
实施例1
1、长筒石蒜种子处理
挑选饱满、一致的长筒石蒜种子，用洗涤剂洗净后，流水冲洗1-2h。在超净工作台上，将种子置于已灭菌的玻璃瓶中，用75％乙醇处理1min，灭菌双蒸水冲洗3次，每次15s左右；随后用0.1％HgCl2处理15min，灭菌双蒸水清洗3次即为无菌材料。用解剖刀切开长筒石蒜种子，从中取出完整种胚。
2、将长筒石蒜的种胚水平接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿接种3-5个种子胚。
3、长筒石蒜愈伤组织的诱导
将长筒石蒜的种子胚诱导愈伤组织，诱导培养在黑暗条件，25±1℃下进行。实验重复3次，25d后统计结果。以MS为基本培养基，添加2,4-D1.0mg/L和6-BA1.0mg/L进行长筒石蒜愈伤组织的诱导，蔗糖浓度为35g/L、琼脂7.1g/L，pH值调为5.8。
4、对长筒石蒜愈伤组织诱导不定芽
在25±1℃温度组培室中和光照环境下，对种子胚诱导出的愈伤组织进行不定芽诱导培养，3次重复，25d后统计结果。培养基的主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L，蔗糖浓度为35g/L、琼脂6g/L，pH值调为5.8。
5、长筒石蒜生根培养
对长筒石蒜的不定芽进行生根诱导，培养基植物生长调节剂配比为：MS+NAA0.2mg/L。
实施例2
1、长筒石蒜花朵处理
采长筒石蒜野生苗的花朵为样品，用洗涤剂洗净后，流水冲洗1-2h。在超净工作台上，分别取其花被片、花丝或花茎切成5mm×5mm大小，放于已灭菌的玻璃瓶中，用75％乙醇处理1min，灭菌双蒸水冲洗3次，每次15s左右；随后用0.1％HgCl2处理15min，灭菌双蒸水清洗3次即为无菌材料，接种于已灭菌的诱导培养基上，每瓶接种3-5个材料。
2、长筒石蒜愈伤组织的诱导
将长筒石蒜的花被片、花丝或花茎诱导愈伤组织，诱导培养在黑暗条件，25±1℃下进行。实验重复3次，25d后统计结果。以MS为基本培养基，添加2,4-D1.0mg/L和6-BA1.0mg/L进行长筒石蒜愈伤组织的诱导，蔗糖浓度为35g/L、琼脂7.1g/L，pH值调为5.8。
4、对长筒石蒜愈伤组织诱导不定芽
在25±1℃温度组培室中和光照环境下，对长筒石蒜的花被片、花丝或花茎诱导出的愈伤组织进行不定芽诱导培养，3次重复，25d后统计结果。培养基的主要成分为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L，蔗糖浓度为35g/L、琼脂6g/L，pH值调为5.8。
5、长筒石蒜生根培养
对长筒石蒜的不定芽进行生根诱导，培养基植物生长调节剂配比为：MS+NAA0.2mg/L。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，所述方法中主要包括以下步骤：
步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；
步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。
2.如权利要求1所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，步骤1中，诱导愈伤组织所用培养基为愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基主要成分为：MS+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L。
3.如权利要求2所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为30-38g/L、琼脂6.9-7.5g/L，pH值为5.5-6.0。
4.如权利要求3所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基蔗糖浓度为35g/L、琼脂7.1g/L，pH值为5.8。
5.如权利要求3所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，以长筒石蒜的种子胚为材料诱导愈伤组织，具体的操作方法包括以下步骤：
步骤1.1.1、种子无菌材料的制备，将长筒石蒜种子顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得种子无菌材料；
步骤1.1.2无菌操作取出所述种子无菌材料中的完整种胚，即得种子胚；
步骤1.1.3将所述种子胚接种于所述愈伤组织诱导培养基上；
步骤1.1.4进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
6.如权利要求3所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，以长筒石蒜的花朵为材料诱导愈伤组织；具体的操作方法包括以下步骤：
步骤1.2.1、花朵无菌材料的制备，将长筒石蒜花朵顺次进行以下操作：流水冲洗1-2h；取花朵的花被片、花丝或花茎，并切成4-6mm×4-6mm的小块，用质量浓度为73-78％乙醇溶液浸泡1-3min；无菌双蒸水冲洗2-5次，每次10-30s；质量浓度为0.08-0.3％的HgCl2浸泡10-20min；无菌双蒸水清洗2-5次，得花朵无菌材料；
步骤1.2.2将所述花朵无菌材料接种于所述愈伤组织诱导培养基上；
步骤1.2.3进行暗培养，培养温度25±1℃，培养时间5-25d，即得所述愈伤组织。
7.如权利要求1所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，步骤2中诱导不定芽采用不定芽诱导培养基，所述不定芽诱导培养基的主要成分为：MS+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L；
不定芽诱导培养的温度为25±1℃，自然光照培养，培养时间5-25天。
8.如权利要求1所述的长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，其特征在于，步骤2中生根诱导采用生根诱导培养基，所述生根诱导培养基的主要成分为：MS+NAA0.2mg/L；
生根诱导不定芽诱导培养的温度为25±1℃，自然光照培养，培养时间5-25天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160413 |