CN104186324A

CN104186324A - 樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法

Info

Publication number: CN104186324A
Application number: CN201410455348.XA
Authority: CN
Inventors: 梁艳; 沈海龙; 徐洪国; 高美玲; 范震宇; 朱琨; 陈阳; 金一峰; 娄丛艳
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2014-09-09
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-09
Also published as: CN104186324B

Abstract

樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，它涉及樟子松成熟胚体细胞胚胎诱导方法。本发明要解决利用未成熟合子胚诱导体胚发生受季节时间限制的问题。本发明方法：一、外植体消毒接种；二、胚性愈伤组织的诱导；三、胚性愈伤组织的增殖与保持；四、体胚的成熟诱导。本发明外植体取材方便，污染率控制在5％以内，樟子松胚性愈伤组织的诱导率高，愈伤组织增殖培养可以增殖3-4倍，并在添加脱落酸的培养基中成功的诱导了樟子松的体细胞胚胎。本发明采用的成熟合子胚外植体与已获得成功的樟子松未成熟合子胚作为外植体诱导体胚技术相比，成熟合子胚的体胚发生技术具有保存期长、材料丰富且不受季节、植物发育时期等因素限制。

Description

樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法

技术领域

本发明涉及一种林木种苗繁殖领域，尤其涉及一种樟子松成熟胚体细胞胚胎发生的诱导方法。

背景技术

樟子松(Pinus sylvestris Var Mongolica)是松科松属高大常绿乔木树种，是欧洲赤松的一个地理变种，具有根系发达，耐寒，耐旱，土壤适应性强，速生，材质优良等特点，是东北地区主要的针叶速生用材、防护绿化、水土保持的优良树种。

体细胞胚胎发生是一种有效的规模化无性繁殖的方法，体细胞胚胎发生可用于研究植物生长发育及器官分化的机制、遗传变异规律，也可用于体胚途径的人工种子规模化生产等。

樟子松结实周期长，籽粒空瘪率高，采用常规的种子繁殖途径进行种苗的生产不能满足目前市场上的大量需求，而体胚发生途径的组织培养技术可作为快速繁殖松属树种一条有效的途径，目前，国内外对樟子松体胚发生虽有研究，但主要是集中在采用未成熟合子胚作为外植体诱导体细胞胚胎，至今未有采用樟子松成熟合子胚作为外植体诱导体细胞胚胎的相关报道，然而相对未成熟合子胚，成熟合子胚较未成熟合子胚具有取材容易，数量充足，不受时间、季节限制等优点，因此，对樟子松通过成熟合子胚培养获得体细胞胚胎的研究具有一定的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的为了解决利用未成熟合子胚诱导体胚发生受季节时间限制，现有方法中采用樟子松的成熟合子胚培养获得体细胞胚胎尚未取得成功的问题，而提供一种樟子松成熟合子胚体细胞胚胎发生的方法。本发明提供的一种樟子松体细胞胚胎发生的方法，包括外植体的消毒接种及所述体胚发生培养包括的三个阶段：胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖与保持阶段、体细胞胚成熟阶段。

本发明的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎发生的方法，具体是通过以下步骤实现的：

一、外植体消毒接种：取当年收获冷藏保存的成熟樟子松种子，流水冲洗干净，再用40～50℃的温水浸泡2h后用质量百分含量为70％的酒精表面消毒0.5～1min，无菌水冲洗3～5次，置于质量百分含量为0.1％的升汞溶液中消毒5min后，用无菌水冲洗5～6次，于超净条件下剥去胚乳，取出成熟胚接种到培养基中；

二、胚性愈伤组织的诱导：将步骤一处理后的合子胚采用DCR培养基进行胚性愈伤组织的诱导，其中，DCR培养基含浓度为2mg/L的2,4-D、浓度为1mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；

三、愈伤组织的增殖与保持：将步骤二诱导培养15d获得的胚性愈伤组织置于DCR培养基中进行愈伤组织的保持和增殖，DCR培养基含浓度为1mg/L的2,4-D、浓度为0.5mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白和浓度为1000mg/L的肌醇、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；

四、体细胞胚成熟的诱导：将步骤三增殖的胚性愈伤组织置于DCR培养基中进行体胚成熟的诱导，即完成；其中，DCR培养基含浓度为1～2mg/L的ABA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为5％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。

本发明的有益效果：

1、本发明公开了一种樟子松成熟合子胚作为外植体的体细胞胚胎发生的诱导方法，本发明的诱导方法由于采用DCR培养基并添加不同浓度的2,4-D和6-BA，胚性愈伤组织诱导率高；同时在愈伤组织增殖阶段，采用降低激素浓度的方式增殖倍数可达3～4倍，体胚成熟阶段添加一定浓度的ABA获得了成熟的樟子松子叶胚。

2、本发明针对樟子松成熟合子胚外植体状态有明确的说明，同时对消毒处理接种方式及体胚诱导步骤方法有明确的阐述。本发明选取的樟子松成熟胚相对未成熟外植体具有保存期长、材料丰富且不受季节、植物发育时期等因素限制、取材方便、操作简单等优点，因此采用樟子松成熟合子胚作为外植体更利于开展樟子松高效再生体系及相关的研究。

附图说明

图1是实施例一在樟子松成熟合子胚的子叶和胚轴处长出的愈伤组织图；

图2是实施例一樟子松胚性愈伤组织的增殖图；

图3是实施例一樟子松体胚发生图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的樟子松成熟合子胚体胚发生的诱导方法，它包括以下步骤：

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的步骤一中樟子松成熟种子为当年9月采收于4℃保存1年内健康饱满均匀的成熟樟子松种子。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的步骤一中流水冲洗干净，再用45～50℃的温水浸泡2h，用70％的酒精表面消毒0.8～1min，无菌水冲洗3～5次，置于0.1％的升汞溶液中消毒5min。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的步骤二中DCR培养基含浓度为2mg/L的2,4-D、浓度为1mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的步骤三中DCR培养基含浓度为1mg/L的2,4-D、浓度为0.5mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白和浓度为1000mg/L的肌醇、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述的步骤四中DCR培养基含浓度为1～2mg/L的ABA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为5％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中胚性愈伤组织的诱导的培养条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15d。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中愈伤组织的增殖与保持的条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15d。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中体细胞胚成熟的诱导的条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15-20d。其它与具体实施方式一至八之一相同。

通过本实施例验证本发明的有益效果：

本实施例樟子松成熟合子胚体细胞胚胎发生的诱导方法，按以下步骤进行：

一、取当年收获冷藏保存的成熟樟子松种子(不超过1年)，先用洗衣粉水浸泡10min后流水冲洗干净后用40-50℃的温水浸泡2h；再用70％的酒精表面消毒0.5-1min，无菌水冲洗3-5次，置于0.1％的升汞溶液中消毒5min后，用无菌水冲洗5-6次，于超净下置于无菌滤纸上吸干水分，然后先在种子珠孔位置用无菌的解剖刀划开后去掉种皮，再用无菌镊子剥去胚乳，取出成熟合子胚水平接种到下一步的诱导培养基(DCR培养基)中；

二、胚性愈伤组织的诱导：将步骤一处理后的樟子松成熟合子胚采用DCR培养基进行胚性愈伤组织的诱导，其中DCR培养基含2mg/L2,4-D，1mg/L6-BA，500mg/L酸水解酪蛋白，质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；培养条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％，黑暗条件下培养；

三、愈伤组织的增殖与保持：将步骤二诱导培养15d获得的胚性愈伤组织进行愈伤组织的保持和增殖，注意继代培养时切去胚根部位的非胚性愈伤组织，仅保留胚轴与子叶处的愈伤组织继代培养，采用DCR培养基为基本培养基，添加1mg/L2,4-D，0.5mg/L6-BA，500mg/L酸水解酪蛋白，1000mg/L肌醇，质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。培养条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％，黑暗条件下培养；

四、体细胞胚的成熟诱导：将步骤三增殖两次的(15d一次继代)胚性愈伤组织进行体胚成熟的诱导，其中DCR培养基含1-2mg/LABA，500mg/L酸水解酪蛋白，质量百分含量为5％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。培养条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％，黑暗条件培养。

结果分析：

本实施例步骤二的胚性愈伤组织的诱导12～15d后，长出白色透明粘性的愈伤组织为胚性愈伤组织，结果如图1所示；培养15d时统计胚性愈伤组织诱导率为96.67％。

本实施例步骤三的愈伤组织继代培养15d时胚性愈伤组织增殖倍数可达增殖培养之初体积的3～4倍(如图2所示)。

本实施例的诱导方法由于采用DCR培养基并添加不同浓度的2,4-D和6-BA，胚性愈伤组织诱导率高；同时在愈伤组织增殖阶段，采用降低激素浓度的方式增殖倍数可达3～4倍，体胚成熟阶段添加一定浓度的ABA获得了成熟的樟子松子叶胚。

本实施例针对樟子松成熟合子胚外植体状态有明确的说明，同时对消毒处理接种方式及体胚诱导步骤方法有明确的阐述。本实施例选取的樟子松成熟胚相对未成熟外植体具有保存期长、材料丰富且不受季节、植物发育时期等因素限制、取材方便、操作简单等优点，因此采用樟子松成熟合子胚作为外植体更利于开展樟子松高效再生体系及相关的研究。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于它包括以下步骤：

一、外植体消毒接种：取当年收获冷藏保存的成熟樟子松种子，流水冲洗干净，再用40～50℃的温水浸泡2h后用质量百分含量为70％的酒精表面消毒0.5～1min，无菌水冲洗3～5次，置于质量百分含量为0.1％的升汞溶液中消毒5min后，用无菌水冲洗5～6次，于超净工作台中剥去胚乳；

2.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于所述的步骤一中樟子松成熟种子为当年9月采收于4℃保存1年内健康饱满均匀的成熟樟子松种子。

3.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于所述的步骤一中流水冲洗干净，再用45～50℃的温水浸泡2h，用70％的酒精表面消毒0.8～1min，无菌水冲洗3～5次，置于0.1％的升汞溶液中消毒5min。

4.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于所述的步骤二中DCR培养基含浓度为2mg/L的2,4-D、浓度为1mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。

5.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于所述的步骤三中DCR培养基含浓度为1mg/L的2,4-D、浓度为0.5mg/L的6-BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白和浓度为1000mg/L的肌醇、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。

6.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于所述的步骤四中DCR培养基含浓度为1～2mg/L的ABA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为5％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8。

7.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于步骤二中胚性愈伤组织的诱导的培养条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15d。

8.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于步骤三中愈伤组织的增殖与保持的条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15d。

9.根据权利要求1所述的樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于步骤四中体细胞胚成熟的诱导的条件：温度23℃～25℃、湿度60％～70％和黑暗条件下培养15-20d。