CN104642111B - 一种金花茶种苗繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金花茶种苗繁育方法，所述方法包括以下步骤：果实预处理、果实灭菌处理、萌发诱导、初始继代、继代增殖、壮苗、炼苗、瓶外生根和综合管理。本方法具有快速获得大量无菌苗、操作简单、污染率低和萌发率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，特别是涉及一种金花茶的种苗繁育方法。
背景技术
金花茶组培快繁技术发展至今，有关金花茶离体培养的研究报道较少，研究主要集中于利用成年植株茎段为外植体诱导成苗，如郑若仙(1980)、廖汉刃(1987)、颜幕勤(1988)、林莉(2005)。然而，利用茎段作为外植体仍存在诸多问题，如茎段灭菌很难彻底，极易发霉；木本植物茎段极易褐变，通过延长流水冲洗时间、提高消毒液浓度和延长灭菌时间进行处理可以一定程度上缓解褐变，但效果并不理想；另一方面腋芽诱导难度大，不易掌握。金花茶生长缓慢，枝条比较珍贵，过度剪取枝条会影响母株的开花，利用茎段作为外植体，枝条消耗大，获得的无菌苗较少，且人力消耗大。
另外，有报道利用种子、子胚、叶片等作为外植体的研究，但此研究仅局限于诱导愈伤组织，且没有全面系统的报道愈伤组织分化成苗的研究。因此对于金花茶组培快繁技术的研究应当在保证诱导成活率的基础上尽可能的节省外植体材料，继而形成一套全面、高效、实用性强的金花茶组培快繁技术体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、污染率低、材料消耗低、诱导萌发率高的金花茶种苗繁育方法。
本发明是以如下方式实现的：
一种金花茶种苗繁育方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)果实预处理：选取尚未开裂，绿色，饱满，无病虫害的果实，用毛刷刷干净果实表面的杂质，然后用饱和洗衣粉水浸泡15-20min，流动清水冲洗20-30min；
(2)果实灭菌处理：在超净工作台上，用75％酒精浸泡15-20min，无菌水洗3-4次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1％升汞中浸泡5-10min，无菌水洗4-5次，最后在接种盘中，切开种皮，取出胚乳，接入诱导培养基中，将有胚芽的一端置于培养基底部，操作过程中不得伤及种子胚芽部分；
(3)萌发诱导：将胚乳接入诱导培养基中10-15d后，胚芽开始伸长生长，60d后萌发率达85-100％，胚芽可长至4-5cm；
(4)初始继代：将胚乳及胚芽取出，切掉顶芽以及部分胚乳，剩余部分接入继代培养基中60d后，从胚芽基部长出大量的丛生芽，增殖倍数达6-8倍；
(5)继代增殖：将丛生芽切成小块接入继代增殖培养基中60d后，单芽变壮，且长出更多小芽，增殖倍数达5-7倍；
(6)壮苗：将丛生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壮苗培养基中50d后，单芽伸长生长成无根健壮小苗，低于1.5cm的小丛芽继续接入继代增殖培养基中；
(7)炼苗：将小苗放置于炼苗室进行炼苗20d后，即可移栽，进行瓶外生根；
(8)瓶外生根：移栽前2天，打开瓶盖，让小苗适应外部空气湿度。然后取出小苗，洗去培养基，将小苗的基部置于750mg/L的IBA溶液中浸泡10-15min，然后种在黄泥：泥炭＝1:1的基质中；
(9)综合管理：调试自动喷淋系统，于8：00-18：00期间每间隔1h喷水1次，每次喷淋30-60s，根据不同季节进行调整，夏季喷淋时间长，冬季喷淋时间短。
作为优选，在本发明的技术方案中，步骤(2)和(3)中所述诱导培养基为MS+GA30.5-1.0mg/L。
作为优选，在本发明的技术方案中，步骤(4)中所述继代培养基为WPM+6-BA2.0-4.0mg/L。
作为优选，在本发明的技术方案中，步骤(5)中所述继代增殖培养基为WPM+6-BA1.0-3.0mg/L。
作为优选，在本发明的技术方案中，步骤(6)中所述壮苗培养基为MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.05-0.1mg/L。
作为优选，在本发明的技术方案中，步骤(7)中所述炼苗室的温度为25(±7)℃，光照强度为5000lx。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
1.本发明方法能快速获得大量无菌苗，采用未成熟果实，其种子的种皮比较软，在超净工作台上容易切开，操作简单，污染率低，萌发率高。
2本发明的方法在增殖过程中，采用不完全切除胚乳进行继代，胚乳可以继续向胚芽提供营养，从而加快胚芽增殖速度。
3本发明的方法在移栽阶段使用自动喷淋，使金花茶组培苗生长处于较稳定的湿度环境，有效提高成活率。
4本发明选取因暴风雨或其他原因掉落的未成熟果实作为外植体，可以有效减少材料的消耗。由于金花茶果实生长期一般为每年的7-10月，期间经常由于暴风雨或其他原因导致大量未成熟果实的掉落，而此类果实若用作常规栽培，萌发率低，而用作本发明的材料，萌发率则大大提高，从而提高材料的利用率。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种金花茶种苗繁育方法，按以下步骤进行操作：
(1)果实预处理
选取广西防城港市原生种金花茶的7-8成熟、尚未开裂、绿色、饱满、无病虫害的果实，用毛刷刷干净果实表面的杂质，然后用饱和洗衣粉水浸泡20min，流水冲洗30min；
(2)灭菌处理
在超净工作台上，用75％酒精浸泡15min，无菌水洗3次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1％升汞中浸泡7min，无菌水洗4次，最后在接种盘中，切开种皮，取出胚乳，接入诱导培养基中，将有胚芽的一端置于培养基底部，操作过程中不得伤及种子胚芽部分；
(3)萌发诱导阶段
诱导培养基为MS+GA31.0mg/L，10d后胚芽开始伸长生长，60d以后，萌发率为92％，胚芽可长至5cm左右；
(4)初始继代阶段
将胚乳及胚芽取出，切掉顶芽以及部分胚乳，剩余部分接入继代培养基WPM+6-BA3.0mg/L，60d后，从胚芽基部长出大量的丛生芽，增殖倍数达6倍；
(5)继代增殖阶段
将丛生芽切成小块接入继代增殖培养基WPM+6-BA1.5mg/L，60d后，单芽变壮，且长出更多小芽，增殖倍数达5倍；
(6)壮苗阶段
将丛生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壮苗培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，50d后，单芽伸长生长成无根健壮小苗，低于1.5cm的小丛芽继续接入继代增殖培养基中；
(7)炼苗阶段
将小苗放置于炼苗室进行炼苗，温度：25(±7)℃，光照强度5000lx，20d后，即可移栽，进行瓶外生根；
(8)瓶外生根
移栽前2天，打开瓶盖，让小苗适应外部空气湿度。然后取出小苗，洗去培养基，将小苗的基部置于750mg/L的IBA溶液中浸泡10min，然后种在黄泥：泥炭＝1:1的基质中；
(9)综合管理
调试自动喷淋系统，8：00-18：00期间每间隔1h喷水一次，每次喷淋30-60s，根据不同季节进行调整，夏季喷淋时间长而冬季短。
试验结果：60d后，植株健壮、长出新叶，成活率80％，生根率58％，平均根数25条，平均根长1.0cm，苗高6cm。
实施例2：
一种金花茶种苗繁育方法，按以下步骤进行操作：
(1)果实预处理
选取广西防城港市原生种金花茶的7-8成熟、尚未开裂、绿色、饱满、无病虫害的果实，用毛刷刷干净果实表面的杂质，然后用饱和洗衣粉水浸泡15min，流水冲洗20min；
(2)灭菌处理
在超净工作台上，用75％酒精浸泡20min，无菌水洗4次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1％升汞中浸泡5min，无菌水洗4次，最后在接种盘中，切开种皮，取出胚乳，接入诱导培养基中，将有胚芽的一端置于培养基底部，操作过程中不得伤及种子胚芽部分；
(3)萌发诱导阶段
诱导培养基为MS+GA30.8mg/L，15d后，胚芽开始生长伸长，60d以后，萌发率为88.5％，胚芽可长至5cm左右；
(4)初始继代阶段
将胚乳及胚芽取出，切掉顶芽以及部分胚乳，剩余部分接入继代培养基WPM+6-BA4.0mg/L，60d后，从胚芽基部长出大量的丛生芽，增殖倍数达7倍；
(5)继代增殖阶段
将丛生芽切成小块接入继代增殖培养基WPM+6-BA2.0mg/L，60d后，单芽变壮，且长出更多小芽，增殖倍数达6倍；
(6)壮苗阶段
将丛生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壮苗培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L，50d后，单芽伸长生长成无根健壮小苗，低于1.5cm的小丛芽继续接入继代增殖培养基中；
(7)炼苗阶段
将小苗放置于炼苗室进行炼苗，温度：25(±7)℃，光照强度5000lx，20d后，即可移栽，进行瓶外生根；
(8)瓶外生根
移栽前2天，打开瓶盖，让小苗适应外部空气湿度。然后取出小苗，洗去培养基，将小苗的基部置于750mg/L的IBA溶液中浸泡10min，然后种在黄泥：泥炭＝1:1的基质中；
(9)综合管理
调试自动喷淋系统，8：00-18：00期间每间隔1h喷水一次，每次喷淋30-60s，根据不同季节进行调整，夏季喷淋时间长，冬季短。
结果表明：60d后，植株健壮、长出新叶，成活率85％，生根率45％，平均根数30条，平均根长1.1cm，苗高5cm。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (2)
1.一种金花茶种苗繁育方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)果实预处理：选取尚未开裂，绿色，饱满，无病虫害的果实，用毛刷刷干净果实表面的杂质，然后用饱和洗衣粉水浸泡15-20min，流动清水冲洗20-30min；
(2)果实灭菌处理：在超净工作台上，用75％酒精浸泡15-20min，无菌水洗3-4次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1％升汞中浸泡5-10min，无菌水洗4-5次，最后在接种盘中，切开种皮，取出胚乳，接入诱导培养基中，将有胚芽的一端置于培养基底部，操作过程中不得伤及种子胚芽部分；
(3)萌发诱导：将胚乳接入诱导培养基中10-15d后，胚芽开始伸长生长，60d后萌发率达85-100％，胚芽可长至4-5cm；
(4)初始继代：将胚乳及胚芽取出，切掉顶芽以及部分胚乳，剩余部分接入继代培养基中60d后，从胚芽基部长出大量的丛生芽，增殖倍数达6-8倍；
(5)继代增殖：将丛生芽切成小块接入继代增殖培养基中60d后，单芽变壮，且长出更多小芽，增殖倍数达5-7倍；
(6)壮苗：将丛生芽取出，把高于1.5cm的小芽切出，接入壮苗培养基中50d后，单芽伸长生长成无根健壮小苗，低于1.5cm的小丛芽继续接入继代增殖培养基中；
(7)炼苗：将小苗放置于炼苗室进行炼苗20d后，即可移栽，进行瓶外生根；
(8)瓶外生根：移栽前2天，打开瓶盖，让小苗适应外部空气湿度，然后取出小苗，洗去培养基，将小苗的基部置于750mg/L的IBA溶液中浸泡10-15min，然后种在黄泥：泥炭＝1:1的基质中；
(9)综合管理：调试自动喷淋系统，于8：00-18：00期间每间隔1h喷水1次，每次喷淋30-60s，根据不同季节进行调整，夏季喷淋时间长，冬季喷淋时间短；
步骤(2)和(3)中所述诱导培养基为MS+GA30.5-1.0mg/L；
步骤(4)中所述继代培养基为WPM+6-BA2.0-4.0mg/L；
步骤(5)中所述继代增殖培养基为WPM+6-BA1.0-3.0mg/L；
步骤(6)中所述壮苗培养基为MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.05-0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述金花茶种苗繁育方法，其特征在于：步骤(7)中所述炼苗室的温度为25±7℃，光照强度为5000lx。
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