CN102144556A

CN102144556A - 瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法

Info

Publication number: CN102144556A
Application number: CN2011100331373A
Authority: CN
Inventors: 黄宁珍; 赵志国; 石云平; 付传明; 唐凤鸾
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-01-29
Filing date: 2011-01-29
Publication date: 2011-08-10

Abstract

瑶山苣苔(Dayaoshania cotinifolia W.T.Wang)组织培养及快速繁殖的方法，本发明以分布于广西金秀县老山林场的野生瑶山苣苔叶片为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现珍稀濒危植物瑶山苣苔种苗的快速繁殖，为该物种的生物学研究、遗传改良、种质资源保护和可持续利用奠定基础。

Description

瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖的方法。

背景技术

瑶山苣苔(Dayaoshania cotinifolia W.T.Wang)是苦苣苔科多年生草本植物，1983年由王文采命名发表的瑶山苣苔属植物新种，为中国广西特有植物。由于其居群数量少，分布范围狭窄，并受人为活动的影响，其种群数量和分布面积急剧减少。在1999年国务院颁布的《国家重点保护植物名录》(第一批)中被列为国家I级重点保护野生植物，被《中国物种红色名录》(第一卷，2004)定为极危种。瑶山苣苔是苦苣苔科较原始的种，具有较高的科研价值和经济价值，由于资源数量分布极其有限，生境特殊，其基础生物学研究近乎空白，更谈不上对其进行繁育及开发利用。因此，利用瑶山苣苔叶片为外植体，通过组织培养技术成功建立其快速繁殖技术体系，为该物种的生物学研究、遗传改良、种质资源保护和可持续利用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法。

瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法，以野外采集的瑶山苣苔植株叶片为外植体，按以下步骤进行组织培养和快速繁殖：

(1)不定芽的初代诱导：将瑶山苣苔植株叶片外植体经表面消毒后接种到诱导培养基上，在温度25±3℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养100～140天后，叶片外植体诱导形成愈伤组织和不定芽，其中，所用的初代诱导培养基为：MS+6-BA 0.1～0.4mg·L^-1+KT 0.1～0.4mg·L^-1+IAB 0.04～0.05mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0；

(2)芽的继代增殖：将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基上，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养50～60天，获得从生芽，繁殖系数4.6～5.0/60d，每60天继代一次，其中，所用的继代增殖培养基为：MS+2-ip 0.05～0.2mg·L^-1+KT0.05～0.1mg·L^-1+IAB 0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0；

(3)生根培养：将丛生芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后获得长好根的试管苗，其中，所用的生根培养基为：1/2MS+2-ip 0.01～0.05mg·L^-1+IAB 0.1～0.4mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳0.5～1.0g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0；

(4)试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫、湿润的原生环境下培养，其中，所用的移栽基质为：腐质土和椰糠按重量份1∶1混均，并添加Mg²⁺100mg/kg，将pH调至pH 4.5～5.5。

上述步骤(1)中所述初代诱导培养基优选为MS+6-BA 0.2mg·L^-1+KT 0.2mg·L^-1+IAB0.04mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。

上述步骤(2)中所述继代增殖培养基优选为MS+2-ip 0.1mg·L^-1+KT 0.05mg·L^-1+IAB0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。

上述步骤(3)中所述生根培养基优选为1/2MS+2-ip 0.02mg·L^-1+IAB 0.2mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳0.5g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。

所述培养基中的Mg²⁺由硫酸镁提供。

本发明所使用的植物材料：为分布于广西金秀县老山林场的野生瑶山苣苔叶片。

瑶山苣苔是一种对环境要求十分严格的植物，一旦离开原生地植株不能成活，目前为止，原生地之外地区的引种栽培尚未获得成功。本方法在对瑶山苣苔生境土壤进行详细研究的基础上，发现Mg²⁺对瑶山苣苔的生长起关键作用。因此，本发明利用瑶山苣苔叶片，通过向培养基添加Mg²⁺，利用组织培养和植株再生技术，成功地在原生地之外对其种苗进行试管快速繁殖，为瑶山苣苔异地引种奠定了基础。

本发明方法的优点在于：利用本方法繁育出的瑶山苣苔种苗，有繁殖速度快、生根率高、遗传稳定性好等特点，能在短期内迅速提高该物种个体数量，达到保护和可持续利用的目的。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下：

(1)叶片外植体的表面消毒：将从广西金秀县老山林场采集的野生瑶山苣苔叶片作为外植体，用1.0％的洗洁精浸泡10分钟，在流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用70％的酒精浸泡60秒，再用浓度0.1％的HgCl₂消毒3分钟，取出叶片，用无菌水浸洗5次；

(2)不定芽的初代诱导：将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2×1.5cm小块，接种于初代诱导培养基MS+6-BA 0.4mg·L^-1+KT 0.1mg·L^-1+IAB 0.05mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养30～35天，叶片切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤组织，培养100天后，愈伤组织逐渐分化形成不定芽，不定芽的分化率为31.7％；

(3)芽的继代增殖：将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0.2mg·L^-1+KT0.01mg·L^-1+IAB 0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养30～35天，形成较多丛生小芽，再培养30～35天，丛生芽逐渐长成具有2～3片真叶的比较粗壮的无根苗，繁殖系数4.6/60d；

(4)生根培养：将长有2～3片真叶的比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基1/2MS+2-ip 0.05+IAB 0.4mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳1.0g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0中，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后，无根苗逐渐长出不定根，生根率90.7％，不定根较粗大，须根也较多；

(5)试管苗移栽：用有机质含量比较丰富的腐质土和椰糠按重量份1∶1比例混合，每公斤添加100mg Mg²⁺，pH调至5.0，配制移栽基质，将长好根的试管苗移出培养室外炼苗2～3天，洗净根际培养基，移栽到装有移栽基质的营养杯中，在原生环境林下搭建小拱棚，每天定期补充水分，保持湿度，培养60～65天，小苗长出新根。

实施例2

瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下：

(1)不定芽的初代诱导：将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2×1.5cm小块，接种于初代诱导培养基MS+6-BA 0.2mg·L^-1+KT 0.2mg·L^-1+IAB 0.04mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养35～40天，叶片外植体的切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤组织，培养120天后，愈伤组织有逐渐分化形成不定芽，不定芽分化率为32.0％；

(2)芽的继代增殖培养：将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0.1mg·L^-1+KT 0.05mg·L^-1+IAB 0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养30～35天，形成丛生芽，继续培养30～35天，丛生芽逐渐长出2～3片真叶，所形成的无根苗较壮，繁殖系数为4.7/60d；

(3)生根培养：将长有2～3片真叶、比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基1/2MS+2-ip 0.02+IAB 0.2mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳0.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0中，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后长出不定根，生根率93.6％，主根粗壮，须根发达。

其余均与实施例1相同。

实施例3

瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下：

(1)不定芽的初代诱导：将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2×1.5cm小块，接种于初代诱导培养基MS+6-BA 0.1mg·L^-1+KT 0.4mg·L^-1+IAB 0.05mg·L^-1+Mg²⁺mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养35～40天，叶片外植体的切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤组织，培养140天后，愈伤组织分化形成不定芽，不定芽的分化率为31.0％，所形成的不定芽较壮；

(2)芽的继代增殖培养：将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0.05mg·L^-1+KT 0.1mg·L^-1+IAB 0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1、pH 5.0上，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养30～35天，形成丛生芽，继续培养30～35天，丛生芽逐渐长出2～3片真叶，繁殖系数为5.0/60d；

(3)生根培养：将长有2～3片真叶、比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基1/2MS+2-ip0.01mg·L^-1+IAB 0.1mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳0.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0中，在温度25±3℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后长出不定根，生根率91.3％，根系发达，植株也较大。

其余均与实施例1相同。

上述实施例中所述培养基中Mg²⁺由硫酸镁提供。

下面表1至表3显示实例1至3中不同的激素种类、浓度和组合对诱导、继代和生根培养材料的影响。

表1不同激素浓度对瑶山苣苔初代诱导的影响

表2不同激素浓度对瑶山苣苔继代增殖的影响

表3不同激素和活性碳浓度对瑶山苣苔生根的影响

Claims

1.瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，以野外采集的瑶山苣苔植株叶片作为外植体，按以下步骤进行组织培养和快速繁殖：

(1)不定芽的初代诱导：将瑶山苣苔植株叶片外植体经表面消毒后接种到诱导培养基上，在温度25±3℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h/d的条件下，培养100～140天，叶片外植体诱导形成愈伤组织和不定芽，其中，所用的初代诱导培养基为：MS+6-BA 0.1～0.4mg·L^-1+KT 0.1～0.4mg·L^-1+IAB 0.04～0.05mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0；

(4)试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫、湿润的原生环境下培养，其中，所用的移栽基质为：腐质土和椰糠按1∶1混均，并添加Mg²⁺100mg/kg，将pH调至4.5～5.5。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述初代诱导培养基为MS+6-BA 0.2mg·L^-1+KT 0.2mg·L^-1+IAB 0.04mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述继代增殖培养基为MS+2-ip 0.1mg·L^-1+KT 0.05mg·L^-1+IAB 0.02mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述生根培养基为1/2MS+2-ip 0.02mg·L^-1+IAB 0.2mg·L^-1+Mg²⁺50mg·L^-1+活性碳0.5g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6g·L^-1，pH 5.0。