CN102246700B - 以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法 - Google Patents

Abstract

以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，属于植物组织培养方法。本发明采集滇杨3年生枝条水培后以嫩茎为外植体，无菌嫩茎平放入分化培养基，在愈伤上长出丛生不定芽，再分别接入增殖、生根培养基，移栽炼苗基质等。本发明取材方便快捷，各阶段的培养基和炼苗基质都分别进行筛选比较，为滇杨工厂化快速繁殖、育苗以及滇杨生理遗传性质研究提供了方法。

Description

以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养方法。

背景技术

滇杨（Populus yunnanensis）是杨柳科杨属青杨派树种，尚有的少量滇杨原始野生植株仅存于部分海拔较高的山区，现存滇杨林分主要以人工林为主，且基本由雄株组成，雌株极为少见。滇杨作为林木遗传育种中的模式植物，其组织培养包括基本培养基及外源激素选择，外植体选择、消毒、分化、增殖与生根培养及炼苗移栽等步骤。杨树外植体的选择上，与茎尖分生组织接连的腋芽、叶片、茎尖具有较强的形态发生能力，通常从优树上选取相应组织部分复幼后再取外植体。金顺玉等在“黑林1号杨(小黑杨×波兰15A)的组织培养与植株再生”（植物生理学通讯[J], 2003,39(6):639）中，利用叶片作为外植体，用75%乙醇消毒1min附加NaClO消毒2min获得了无菌苗。 “3个杨树品种叶片再生体系的建立”（沈周高，等.[J].中国农学通报, 2006, 22 (11):90-92.），对3种黑杨杂种叶片不同时长的消毒处理结果中，0.1%HgCl₂溶液消毒4min处理，叶片污染率为20%，出愈率为76%。经过诱导，外植体重新开始细胞分裂与器官分化，形成完整植株。

不同杨树的生长环境与生物学习性不同，导致适合其诱导、增殖及生根培养的培养基不同。例如，京2杨生长需要较高的营养，MS培养基更适于腋芽的启动和生长。（张蕾,苏晓华等.京2杨组培条件的优化及再生体系建立[J].林业科学研究, 2007, 20 (6) : 787-793）。欧美杨“山地一号”丛生芽的增殖以MH为基础培养基，用0.3-0.8mg/L浓度6-BA与0.05mg/L浓度的NAA混配（杨传平等，“欧美杨‘山地1号’组织培养再生系统的建立”[J].分子植物育种,2006,4(4): 579-582. ）。杨树的生根培养大都采用1/2MS为基础培养基，附加一定量的NAA、IAA、IBA。史绍林等诱导新西伯利亚银白杨的根，采用1/2MS+0.1 mg/LNAA +0.02 mg/LIBA作为根诱导培养基配方，生根率达90%，根数多，生长健壮。（“新西伯利亚银白杨组织培养基配方的筛选与应用”[J].防护林科技,2008,(6):25-26.）在杨树组培苗炼苗移栽过程中，韩玉琴等在“山新杨微繁工厂化配套生产技术”中选择黑土和草炭土附加少量草木灰、细沙、马粪为移栽基质（黑龙江农业科学[J],2005, (2) :59-60.）。康冰等在欧美速生杨炼苗移栽中，选用干净河沙为基质，保持温度26℃，相对湿度为85%，30d后成活率达到90%以上（“速生欧美黑杨愈伤组织诱导及植株再生”[J].植物生理学通讯, 2004, 40(5): 582.）。   

此外，光照作为杨树组织培养过程中重要的影响因子，不同强度和波长的光照将直接影响再生体系的建立。

与滇杨组织培养相关的文献中，有张春霞等以初春时采摘二年生滇杨枝条在室温下水培长出新叶，取水培新叶的叶柄消毒得到的无菌材料作为外植体，利用1/2MS基本培养基附加苯基噻二唑基脲(TDZ)、NAA等组成的三种培养基对叶柄诱导分化、增殖以及生根等进行离体再生的研究（“滇杨的组织培养和植株再生”，植物生理学通讯[J],2006,42(6):1131）。但该方法作为实验室研究，而在工业化条件下叶柄取材量大，基础培养基和外源激素要求较高，尤其是对叶柄进行的离体组织培养实验较为单一，未对不同生长因子或激素的可能组合的培养基进行对比。

发明内容

本发明目的是用滇杨离体嫩茎作为外植体进行组织培养，建立以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，为滇杨离体的工厂化快速繁殖和育苗、以及滇杨生理遗传性质研究提供方法。

本发明目的通过下述方法实现：

以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取生长健壮、无病虫害的3年生滇杨枝条，摘除枝条上叶片，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体；

（2）将步骤（1）嫩茎置入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍； 

（3）用MS+6BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，将步骤（2）消毒后的无菌嫩茎平放入该培养基，20～25天生长出愈伤组织，约30天在愈伤上长出丛生不定芽； 

（4）用MS+6BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L作为滇杨增殖培养基，将步骤（3）诱导后产生的不定芽接入该培养基，25天左右培养一代； 

（5）用1/2MS+NAA0.02mg/L作为滇杨生根培养基，将步骤（4）增殖培养后的壮苗插入该培养基，培养生根苗，15天左右生根；

（6）将步骤（5）的生根瓶苗在组织培养室培养25天，转到普通实验室内闭瓶培养3天、开瓶培养2天进行炼苗前预处理，然后移栽到基质中炼苗；

以上步骤（2）～（5）消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为：温度25±2℃、光照1500-2000Lx、光照时间12h/d、湿度70%～80%。

所述方法的步骤（6）移栽炼苗基质的配方为：河沙:腐质土:珍珠岩=1:1:1。

所述方法的步骤（6）炼苗基质以0.3 %的高锰酸钾溶液淋溶消毒，盖上小棚膜，7天后移栽炼苗。

与现有技术相比，本发明具有的突出的进步和积极效果是：

1、本发明采集滇杨3年生枝条摘除老叶，水培复幼，取材方便快捷，且不受季节的限制；

2、以滇杨新生嫩茎为外植体，通过12种不同细胞分裂素和生长素配比的增殖培养基进行培养，生成愈伤组织后在愈伤上分化出丛生芽，筛选出嫩茎芽分化率较高的6BA和NAA培养基，其诱导发芽率高，更适合滇杨离体快繁及获取同一规格的组培苗；

3、本发明选用4种不同激素配比的生根培养基进行培养，通过主根和须均多且健壮的生根组培苗，获得了适合滇杨离体快繁生根的培养基，为后期移栽炼苗的高成活率提供保障；

并且，6-BA及NAA试剂均较为廉价；

4、本发明选用7种不同基质配比的移栽炼苗基质进行生根组培苗移栽炼苗，并进行死亡率、30天成活率、苗高及苗的地径生长情况分析，筛选出适合滇杨生根组培苗移栽炼苗的培养基质配方，首次筛选了滇杨组培苗的炼苗基质。

因此，本发明建立的滇杨离体培养再生体系，对滇杨离体快速繁殖和遗传改良有重要的意义。

附图说明

图1是不同炼苗预处理对组培苗成活率的影响图。

图2是不同基质中移栽死亡情况随时间的变化图

图3是不同基质对组培苗高生长的影响图。

图4是不同基质对组培苗地径的影响图。

具体实施方式

（一）外植体的消毒

取西南林业大学校园生长健壮、无病虫害的三年生滇杨枝条，将枝条上的叶片全部摘除后，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体材料。将嫩茎在烧杯中用自来水冲洗2h后，放入三角瓶中，加入2%的次氯酸钠，振荡8min后，取出嫩茎材料，用无菌水冲洗叶柄3遍；再用70%乙醇消毒嫩茎40sec，之后分别放入4个无菌瓶中，Ⅰ：+2%的次氯酸钠10min；Ⅱ：+10%H₂O₂10min；Ⅲ：+0.1%HgCl₂7min；Ⅳ：+0.1%HgCl₂7min+2%的次氯酸钠8min。用无菌水冲洗叶柄6遍。选用MS为基础培养基接种。MS配方如表1：

表1  MS培养基成分配方表：

十五天后统计污染率、死亡率，并进行数据分析。设计和效果见表2：

表2 不同消毒剂对滇杨嫩茎的消毒效果

处理号	消毒时间(s)	污染率(%)	成活率(%)
				Ⅰ	40+600	30.0	64.0
Ⅱ	40+600	44.0	50.0
				Ⅲ	40+420	16.0	80.0
Ⅳ	40+420+480	12.0	64.0

综合表2，70%乙醇+0.1%HgCl₂对滇杨嫩茎的消毒效果较好，污染率较低为16%且接种后的外植体发芽成活率高。

（二）滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养

设计正交试验如表3。用已灭菌的镊子将无菌嫩茎取出，切成1-2cm小段放入无菌水中；将消毒后的嫩茎平放入附加不同浓度的细胞分裂素6BA、生长素NAA、蔗糖30g/L以及琼脂4.5g/L的MS培养基（表1）中，pH值调至5.8-6.2作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，培养基分装在200mL玻璃瓶中，每瓶40-50mL，高温、高压灭菌20min后冷却凝固待用。组织培养室温度为25±2℃、光照1500-2000Lx、光照时间12h/d、湿度70%～80%。无尘、空气流通，定期蒸气密闭熏蒸喷雾消毒降尘。

试验共12个培养基处理，每瓶接种外植体4枚，每处理共接20瓶，每个处理重复3次，诱导不定芽。

表3滇杨嫩茎诱导芽分化培养基激素实验设计方案(单位:mg/L)

培养基处理	6BA	NAA
			1	0.5	0.05
2	0.5	0.08
			3	0.5	0.10
4	1.0	0.05
			5	1.0	0.08
6	1.0	0.10
			7	1.5	0.05
8	1.5	0.08
			9	1.5	0.10
10	2.0	0.05
			11	2.0	0.08
12	2.0	0.10

在培养室内进行光照培养30天后，对滇杨嫩茎不定芽的发生进行数据统计分析，并对芽的质量进行评价（表4）。

表4  NAA、6BA不同浓度配比对滇杨嫩茎不定芽诱导分化的影响

处理	6BA(mg/L)	NAA(mg/L)	芽分化率(%)	平均芽数	出芽质量
						1	0.5	0.05	20 a	20.1 a	芽粗壮，长势旺
2	0.5	0.08	15 b	7.3 c	芽粗壮，长势一般
						3	0.5	0.10	0 d	0.0 d	无芽
4	1.0	0.05	20 a	18.8 a	芽粗壮，长势一般
						5	1.0	0.08	10 c	10.3 b	芽长势不佳
6	1.0	0.10	0 d	0.0 d	无芽
						7	1.5	0.05	0 d	0.0 d	无芽
8	1.5	0.08	0 d	0.0 d	无芽
						9	1.5	0.10	0 d	0.0 d	无芽
10	2.0	0.05	0 d	0.0 d	无芽
						11	2.0	0.08	0 d	0.0 d	无芽
12	2.0	0.10	0 d	0.0 d	无芽

注：同列中不同小写字母表示组间差异达0.05显著水平。

结果（表4）显示12种激素组合对滇杨嫩茎丛生芽分化率影响极显著。再进一步对芽分化率进行多重比较分析发现，嫩茎的芽分化率最高的是1号与4号，且二者差异不显著，外植体接入20d后腋芽开始萌动，两侧基部开始膨大，切口处长出大量愈伤组织，30天左右长出丛生芽，有单芽也有丛生芽。其他培养基处理与1、4号处理差异均显著。另外1号处理平均分化芽数达到最高20.1，且产生的芽长势旺。可见，以芽分化率及出芽质量作为评价标准，MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L为滇杨茎段诱导发芽的较佳培养条件。

（三）不定芽的增殖培养

以MS作为诱导后产生的不定芽的增殖基础培养基，加入不同配比的细胞分裂素6BA与生长素NAA，正交试验设计如表5。所有处理均添加蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，最后用1mol/L的NaOH溶液调节培养基pH值至5.8-6.2。增殖培养试验共12个培养基处理，每瓶接种外植体4枚，每处理共接20瓶，每个处理重复数3。接种准备与培养条件同上。

表5 滇杨增殖培养基激素配比表（单位:mg/L）

处理	6BA	NAA
			1	0.1	0.02
2	0.1	0.05
			3	0.1	0.08
4	0.1	0.10
			5	0.2	0.02
6	0.2	0.05
			7	0.2	0.08
8	0.2	0.10
			9	0.5	0.02
10	0.5	0.05
			11	0.5	0.08
12	0.5	0.10

滇杨不定芽进行增殖培养时间30天后进行观察、记录数据，并进行统计分析，结果见表6。

表6 不同生长调节剂组合对试管苗增殖及生长的影响

Table 10 The effects of the different concentrations on the proliferations and growths of plantlets

处理	6BA	NAA	平均增殖芽数	茎增高 (cm)	试管苗生长状况
						1	0.1	0.02	4.7 a	1.6 a	茎叶嫩绿色，腋芽抽生多，从生芽多，苗生长高而健壮
2	0.1	0.05	4.3 a	1.3 ab	茎叶多数嫩绿色，腋芽抽生多，苗茎生长高
						3	0.1	0.08	4.1 a	0.98 b	茎叶嫩绿色有极少茎叶红色，腋芽抽生多，苗生长一般
4	0.1	0.1	2.2 b	0.56 c	茎叶嫩绿色有极少茎叶红色，苗茎矮小瘦小，老化
						5	0.2	0.02	2.8 b	1.26 ab	茎叶较多红色，苗茎长高
6	0.2	0.05	2.4 b	0.98 b	茎叶多数嫩绿色有极少茎叶红色，叶狭长
						7	0.2	0.08	2.0 bc	0.94 b	茎叶红色，植株细弱
8	0.2	0.1	1.5 c	0.68 c	茎叶多数嫩红色，莲座状，植株较矮小
						9	0.5	0.02	0.0 d	0.00 d	黄化死亡
10	0.5	0.05	0.0 d	0.00 d	黄化死亡
						11	0.5	0.08	0.0 d	0.00 d	黄化死亡
12	0.5	0.1	0.0 d	0.00 d	黄化死亡

注：同列中不同小写字母表示组间差异达0.05显著水平。

表6显示，一定范围内较低的6-BA和NAA浓度有利于滇杨不定芽的增殖，当6-BA浓度高于0.5mg/L，组培苗全部黄化后死亡。多重比较结果表明：从增殖芽数来看，1、2、3号培养基间差异不显著，且均具有较高的增殖芽数。而其他9种培养基均与上述3种培养基存在显著差异。从增殖苗的茎高来看，1、2号培养基间差异不显著，且均具有较高的茎高生长，其他10种培养基处理均与1、2号培养基存在显著差异。综合分析，在12个增殖培养处理中，增值系数和增殖苗茎高生长值最高的是1号培养基，并且1号培养基中的丛生苗茎叶嫩绿色，腋芽抽生多，从生芽多，苗生长高而健壮。因此，适合滇杨组织培养增殖生长的最佳培养基是：MS+6BA 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L。

（四）4种不同培养基对滇杨无菌苗生根培养的影响

滇杨的生根培养采用单因素试验设计，以1/2MS培养基作为基本培养基，加入不同浓度植物生长调节剂NAA，激素的质量浓度设为3个水平，以1/2MS基础培养作为对照，其中不添加任何植物生长调节剂，蔗糖均为30g/L，琼脂4.5g/L，培养基pH值调至5.8-6.2，培养基激素设计方案见表7。

当继代培养的组培苗长高到2～3cm左右时，将生长健壮的无根组培苗切除基部的愈伤组织，接种于事先配制好的生根培养基上，共设计4个培养基处理，每个处理接种20瓶，每瓶4棵，重复3次，接种准备与培养条件同上。

表7 滇杨生根培养基激素浓度表(单位:mg/L)

处理	培养基配方
		1	1/2MS
2	1/2MS+NAA 0.01
		3	1/2MS+NAA 0.02
4	1/2MS+NAA 0.05

生根效果主要统计生根率。在生根培养一周后，开始每隔两天观察记录其生根时间顺序与生根数量、粗壮程度、根长等等。转接10天后调查不同培养基中无菌苗的生根率、生根状况，并统计数据，其结果列于表8。

表8 不同组分的培养基对组培苗生根的影响(单位：mg/L)

Table 11 Different components of the medium on effect of rooting (Unit:mg/L)

培养基	生根率	平均主根量	主根平均长度(cm)	须根平均长度(cm)
					1/2MS+NAA0.00	93%	2.1	3.4	0.5
1/2MS+NAA0.01	97%	2.6	2.4	0.3
					1/2MS+NAA0.02	100%	2.4	2.6	0.8
1/2MS+NAA0.05	80%	1.9	2.7	1.2

比较4种培养基中不同激素含量对滇杨无菌苗生根的影响（表8）。在不添加激素的培养基中，无菌苗的根系数量少，而且相对细长、瘦弱；添加植物生长调节剂NAA的培养基中的幼苗生根均较多，根短而粗，须根也较粗壮，植株叶色浓绿，长势旺盛。可以看出，添加少量的生长素更有利于根系的生长与发育。因此，在这4种培养基中，滇杨生根生长培养的最佳培养基是：1/2MS+NAA0.02mg/L。

（五）不同炼苗预处理对组培苗移栽成活率的影响

移栽前进行一定天数的炼苗预处理往往影响移栽成活率，设计4种不同的炼苗处理：（1）将接入生根培养基的组培苗在培养室中培养30天。（2）将接入生根培养基的组培苗在培养室中培养25天，普通实验室闭瓶炼苗5天。（3）将接入生根培养基的组培苗在培养室中培养25天，普通实验室闭瓶炼苗3天再打开瓶盖进行炼苗2天。（4）将接入生根培养基的组培苗在培养室中培养25天，普通实验室开瓶炼苗5天。每组处理30株，重复3次，处理期间保持瓶内湿度，防止组培苗萎蔫死亡。处理结束后，移栽入经灭菌后的基质中。如图1，组培苗预处理后移栽成活率的高低顺序为：处理3>处理2 >处理1>处理4。将组培苗放在普通实验室闭瓶炼苗3天再打开瓶盖进行炼苗2天，这种处理效果最佳，组培苗成活率为93.3%。其次是，将组培苗放在普通实验室闭瓶炼苗5天，炼苗效果降低，从而导致滇杨幼苗的抵抗力差，移栽后成活率降低。将组培苗放在普通实验室开瓶炼苗5天，该处理成活率最低，甚至比不进行炼苗处理的对照低。说明炼苗时间长，导致空气中细菌和病毒污染，幼苗移栽后适应能力差，成活率低。

（八）基质的筛选

用红土、河沙、珍珠岩、腐质土、蛭石配置7种不同的基质，基质配比:（1）河沙；（2）河沙:腐质土=1:1；（3）河沙:腐质土:蛭石=1:1:1；（4）珍珠岩；（5）珍珠岩:腐质土=1:1；（6）红土；（7）红土:腐质土=1:1。移栽瓶苗前，将基质装入穴盘，用0.3 %的高锰酸钾溶液淋溶消毒，盖上小棚膜，熏蒸一个星期后使用。

将在普通实验室内预处理后的组培苗，移栽入上述基质中，每种基质移栽组培苗15株，每个处理作3次重复。

如图2所示，滇杨移栽死亡主要集中在移栽后的30天内，移栽后15天死亡率最高，其次是移栽15-30天，在移栽45-60天时，死亡率为0。其平均成活率、苗高、地径方差统计结果以及苗的生长情况列于表9。

表9 不同基质对组培苗移栽成活率及生长的影响

基质编号	平均成活率(%)	平均苗高(㎝)	平均地径(㎜)	苗木生长状况
					1	80.0 b	5.07 c	1.41 c	生长缓慢，长势一般，叶黄绿色
2	91.1 a	6.83 a	1.48 b	生长较快，长势良好，叶绿色
					3	93.3 a	7.43 a	1.55 a	生长旺盛，苗木粗壮，叶深绿
4	73.3 c	5.03 c	1.35 d	生长缓慢，长势一般，叶黄绿色
					5	86.7 ab	6.20 b	1.48 b	生长快，长势良好，叶绿色
6	73.3 c	4.60 c	1.42 c	生长缓慢，长势较差，叶黄绿
					7	84.4 ab	6.77 a	1.49 ab	生长快，长势良好，叶绿色

注：同列中不同小写字母表示组间差异达0.05显著水平。

 方差分析结果(表9)表明，不同基质对滇杨组培苗成活率存在有一定差异，部分基质间差异达显著水平。据此，可以把基质分为3类：组培苗成活率最好的是2号和3号基质，其次是1号、5号和7号基质，生长较差的有4号和6号基质。而2号与3号基质在0.05水平上无显著差异，由此可见，就滇杨组培苗的成活率而言，可筛选出2号和3号基质为较佳移栽基质；不同基质在组培苗的高生长方面差异显著。结合图3和表9可见，2号、3号和7号基质上幼苗生长较高，且在5%水平上无显著差异；因此，就滇杨组培苗的在不同基质上移栽高生长而言，可筛选出2号、3号7号基质为较佳基质。分析图4及表9可得，不同基质在组培苗的地径生长方面存在显著差异。3号及7号基质中，幼苗地径生长较好，且二者效果不存在显著差异。由此可知，就滇杨组培苗的在不同基质上移栽地径生长而言，可筛选出3号和7号基质为较佳基质。从表9中我们还可以看出，3号叶片颜色深绿色，2号、5号和7号叶片为绿色，1号、4号及6号为黄绿色。综合比较不同基质上组培苗的成活率、苗高、地径及叶片颜色等各生长性状，我们可以得出滇杨组培苗在3号基质上生长最佳，所以，3号练苗基质为7种练苗基质中最佳的，其次是2号和7号基质，6号基质最差。

（八）移栽环境基本情况

大棚长30m，宽6m，高3.5m，钢管构架，用白色塑料薄膜覆盖，在大棚两侧高50cm处开高60cm的换气带，用防虫网隔离，大棚都用砖块隔离分区，设左右两个部分，长约30m，宽2.5m。在移栽区搭上两个高80cm的小拱棚，在离地2.5m高处搭一层遮阳网。

为预防病菌引起病害，滇杨组培苗取出后用0.1％高锰酸钾溶液浸泡1-2分钟，或用掺入75％的百菌清浸泡。在此阶段，清洗干净琼脂，避免幼苗腐烂。一般情况下，气温到30℃以上或湿度高于95%时，揭开大棚两侧薄膜通风透气。土壤湿度和大棚空气湿度以苗床表层土壤保持湿润为宜，土壤持水量保持在85%左右；3-4叶后如果植株生长过旺，要通过控制土壤水分控制幼苗生长，防止徒长。幼苗每周喷施一次水肥，及按照通常管理进行日常基本护理和病虫害防治。

附：以上结果评价指标包括：

丛芽增殖倍数≥0.5cm的芽苗总数/接种外植体数

      增殖芽数=发生增殖的芽数/接种时的总芽数

      增殖芽平均增殖芽数=增殖芽总数/发生增殖芽数

      愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的块数/接种的总块数×100%

      出芽率=产生芽的愈伤组织块数/愈伤组织总块数×100%

      生根率=生根苗数/培养总苗数×100%

      移栽成活率=成活苗数/移栽总苗数×100%

      死亡率=植株死亡的个数/植株总数×100%

      变异率=形态发生变异的株数/植株总数×100%

Claims (2)

1.以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取生长健壮、无病虫害的3年生滇杨枝条，摘除枝条上叶片，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体；

（2）将步骤（1）嫩茎置入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍； 

（3）用MS+6BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，将步骤（2）消毒后的无菌嫩茎平放入该培养基，20～25天生长出愈伤组织， 30天在愈伤上长出丛生不定芽； 

（4）用MS+6BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L作为滇杨增殖培养基，将步骤（3）诱导后产生的不定芽接入该培养基，25天培养一代； 

（5）用1/2MS+NAA0.02mg/L作为滇杨生根培养基，将步骤（4）增殖培养后的壮苗插入该培养基，培养生根苗，15天生根； 

（6）将步骤（5）的生根瓶苗在组织培养室培养25天，转到普通实验室内闭瓶培养3天、开瓶培养2天进行炼苗前预处理，然后移栽到基质中炼苗；

步骤（6）用于炼苗的基质的配方为：河沙:腐质土:珍珠岩=1:1:1；

以上步骤（2）～（5）消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为：温度25±2℃、光照1500-2000Lx、光照时间12h/d、湿度70%～80%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤（6）用于炼苗的基质以0.3 %的高锰酸钾溶液淋溶消毒，盖上小棚膜，7天后移栽炼苗。

 

 

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