CN105191805B

CN105191805B - 一种南京椴的微繁方法

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Publication number: CN105191805B
Application number: CN201510717419.3A
Authority: CN
Inventors: 汤诗杰; 李乃伟; 束晓春; 王中伟; 王欢利
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2035-10-28
Also published as: CN105191805A

Abstract

本发明属于植物种苗繁殖技术领域，公开了一种南京椴的微繁方法，其包括如下步骤：A南京椴实生苗的培育，B不定芽诱导，C高压静电场处理，D继代及生根，E驯化炼苗，本发明可以大量获得南京椴易消毒外植体，初代成功率98％以上，增殖率为113倍，成活率达到95％，有效解决了南京椴市场资源的空缺，应用前景广阔。

Description

一种南京椴的微繁方法

技术领域

本发明属于植物种苗繁殖技术领域，具体涉及一种南京椴的微繁方法。

背景技术

南京椴，乔木，高20米，树皮灰白色；嫩枝有黄褐色茸毛，顶芽卵形，被黄褐色茸毛。叶卵圆形，长9-12厘米，宽7-9.5厘米，先端急短尖，基部心形，整正或稍偏斜，上面无毛，下面被灰色或灰黄色星状茸毛，侧脉6-8对，边缘有整齐锯齿；叶柄长3-4厘米，圆柱形，被茸毛。聚伞花序长6-8厘米，有花3-12朵，花序柄被灰色茸毛；花柄长8-12毫米；苞片狭窄倒披针形，长8-12厘米，宽1.5-2.5厘米，两面有星状柔毛，初时较密，先端钝，基部狭窄，下部4-6厘米与花序柄合生，有短柄，柄长2-3毫米，有时无柄；萼片长5-6毫米，被灰色毛；花瓣比萼片略长；退化雄蕊花瓣状，较短小；雄蕊比萼片稍短；子房有毛，花柱与花瓣平齐。果实球形，无棱，被星状柔毛，有小突起。花期7月。产于我国江苏、浙江、安徽、江西等省。较糠椴分布偏南。耐寒性不强，生长较慢。产江苏北部，连云港云台山等地，生长于山坡山沟或林中。浙江、安徽，江西等省也有分布，目前南京椴主要采用种子繁殖和扦插繁殖，但是种子繁殖的困难性，实生母树量少，实生苗出苗的不整齐给管理带来的难度等因素；采用扦插繁殖时，扦插成活率较低，一般在30％左右。

木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较大的发展。目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植株。关于椴树属植物组织培养的研究，最早的报道是Barker从美洲椴的不同组织中诱导出愈伤组织；Chalupa利用心叶椴幼树腋芽首次获得分化芽；日本的尹阳等先后开展心叶椴和紫椴的组织培养，并获得成功。我国的吕校石等研究了椴树组织培养中污染控制技术，得到较好的控制污染的方法；王彦彬等和张亚量、徐妙珍等筛选出紫椴芽芽分化的最佳培养基；陈罡等研究得到日本椴的组织培养和快速繁殖中最佳芽诱导培养基、增值培养基、壮苗培养基和生根培养基。

以往组织培养主要用于蝴蝶兰、菊花等花卉植物的快速繁殖。而随着园艺科技的发展，组织培养或微扦插作为工厂化培育苗木种苗最高效的方式，现已在国内逐渐普及。而关于南京椴的组织培养研究，发明人已报道过完整的培养体系。然而，进入工厂化生产阶段，其效果仍不尽人意，繁殖基数是影响工厂化规模的关键。而木本植物的初代污染控制与外植体材料极其相关，外植体发育老化会增加污染控制的难度，若过于幼嫩，玻璃化又会极其严重。因此，最佳的外植体准备(培育)方法，将对南京椴组织培养或微扦插具有重要意义，植物枝条的活性具有年龄效应，一般情况下，枝条的生根与萌发能力随着母树年龄的增加而降低，不同树种的年龄效应不等，1年生植株的茎段应该具有更强的组织生长与分化活性。同时，相比与室外环境培育，温室环境更适宜病虫害及微生物的控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大量获得含根南京椴微繁苗的方法，为大量扩繁南京椴植株提供技术支持。

通过本发明方法，成功获得南京椴微繁苗，初代成功率为98％以上，增殖率为113倍；能够高效的得到含根南京椴微繁苗，成活率达到95％以上。

为实现本发明目的，采用的技术方案如下：

一种南京椴的微繁方法，其特征在于包括如下步骤：A南京椴实生苗的培育，B不定芽诱导，C高压静电场处理，D继代及生根，E驯化炼苗；

其中A南京椴实生苗的培育具体为：

1)母本材料的选择：选用一年生实生苗作为微繁外植体的母本；

一年生实生苗培育方法为前一年采集种子时间为10月15日前，随采随播，采用沙藏法，种子萌发后，移栽至容器内培养；

2)培养环境：采用温室培养，光强范围20000-30000lx，温度范围为12-36℃；

3)水分控制：叶面湿度控制在20％-50％，土壤湿度控制在40％-90％；

4)栽培方法：使用容器栽培，容器脱离地面50cm，施用1/4Hoagland′s营养液，保持植株径段嫩绿色，腋芽不形成鳞片。

步骤B不定芽诱导具体为：

5)灭菌：采集一年生实生苗枝条，用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。

6)改良WPM培养基的制备：用KNO₃450mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄，另外添加活性炭浓度为500mg/L，其他组分均无变化。

7)不定芽的诱导：取步骤1)中经消毒后的枝条，切割为0.8cm长的茎段，每茎段带一腋芽，接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25℃，首先在黑暗中培养12小时，然后光照培养20天：光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx，所述不定芽诱导培养基为改良WPM培养基，添加的激素水平为：

ABT1号2mg/L+KT-30 2mg/L+玉米素0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L；

步骤C高压静电场处理具体操作为：

8)利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为20KV/m，时间0.5小时；

步骤D继代及生根具体操作为：

(9)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽切割后接入继代增殖培养基，进行继代培养20天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx，

继代增殖培养基为改良WPM培养基并添加玉米素0.2mg/L+KT-30 0.5mg/L+IBA0.1mg/L+GA₃0.2mg/L

(10)生根培养：将步骤(9)获得的南京椴无根试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000Lx，

生根培养基改良WPM培养基并添加IBA 1.0mg/L+ABT1号0.5mg/L；

步骤E驯化炼苗具体操作为：将步骤(10)所得南京椴带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2-3天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，所述基质成分为重量比1∶3∶2的黄心土、珍珠岩、草炭土。

组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，驯化容器采用50孔穴盘，放在通风阴凉处培养20-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网；

上述不定芽诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0g/L、蔗糖20g/L，且pH值为6.0。

本发明相对现有技术的有益效果为：

1申请人多年在南京椴组织培养繁殖工作，为满足生产方面的需求，我们对外植体准备的方法进行了改良，以达到降低初代污染率、增加采样次数，提高微繁生产基数目的。

实生苗培养方法，采集种子后随采随播，可保持种子活力，避免种子进入休眠，大大提高种子萌发率。种子沙藏方法筛选效果实验：

在南京椴种子基本成熟(9月30日)后，分别在成熟后1周、5周、9周和13周四个时间点进行种子沙藏。沙藏采用层积法，沙藏后用薄膜覆盖保湿，置于玻璃温室培养。各处理分别沙藏200粒，每隔3d观察种子发芽情况，以随机统计的30粒种子中有3粒种子开始发芽计为萌发时间，记录播种至萌发的天数。在次年3月底，统计发芽率，测量最长根的长度见表1。

表1

沙藏时间	1周	5周	9周	13周
					萌发时间	40d	80d	90d	次年
发芽率	50％	35％	20％	5％
					根长	15cm	12cm	8cm	5cm

从表1中可以看出成熟后1周播种的南京椴种子发芽情况最佳，萌发时间最短，发芽率最高，根长最长。随着播种时间的推迟，种子进入休眠状态的比例越大。因此，随采随播的方式大大提高了种子的发芽比例。

在温室内分别栽培1年生、2年生和3年生的南京椴实生苗和扦插苗。于6月下旬，剪取带芽茎段做为外植体。消毒、灭菌、接入诱导培养基。每瓶接1株，共接入50瓶。接种后10d，统计污染率和萌发率见表2。

污染率＝污染数*100％/接种数；萌发率＝萌发数*100％/(接种数-污染数)。

表2

从表2中统计数据可以看出，株龄和外植体母本对污染率和萌发率都有显著影响。

虽然栽培环境相同，实生苗的污染率低，萌发率高。扦插苗污染率高，萌发率低。此外，株龄越高污染率也会增加。

以1年生南京椴实生苗为试验材料，对比温室苗和室外苗对外植体消毒的影响。同时比较露地栽培和容器栽培。取样方法、消毒过程同上。每瓶接1株，共接入50瓶。接种后10d，统计污染率和萌发率见表3。

表3

处理方法	污染率	萌发率
			温室露地栽培	60％	86％
温室容器栽培	2％	96％
			室外露地栽培	90％	30％
室外容器栽培	78％	27％

从表中统计数据可以看出，温室栽培优于室外栽培，容器栽培优于露地栽培，差异显著。

2在WPM培养基上培养时，外植体不定芽不易分化出枝梢，外植体上只爆芽而不伸长，而在MS培养基上，不定芽分化为叶芽，对继代增值没有作用。在B5中生长缓慢，不定芽瘦弱，将WPM培养基改良后，改变了NPK比例，另外添加活性炭浓度，其他组分均无变化，能够显著促进不定芽的分化及生长。

以下为相同激素条件，不同培养基筛选部分方案：

表4

3不定芽诱导生长周期中因受损伤、营养状况、环境因子的限制和影响呈S型生长曲线，但是静电场的处理影响了膜的通透性及其它极性分子的运动，改善了细胞的吸收和转运物质能力，从而能够促进组织的生长，使得继代延迟期缩短，很快进入对数生长期。利用静电场处理，不同的强度和时间组合会产生不同的效果，如果处理电场强度过大，或处理时间过长，会使得植物细胞受到伤害甚至死亡，而电场强度过小或时间过短，又会造成处理效果不明显，本申请发明人经过大量实验得出对南京椴不定芽采用强度为20KV/m，时间为半小时的静电场处理可以显著改善生长状况，鲜重增加明显，生长速度较之相同条件提高21％，大大促进了细胞的分裂和生长，缩短了离体培养的时间。

4对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选出改造的WPW培养基不定芽诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基分别为：

改良WPM培养基+ABT1号2mg/L+KT-30 2mg/L+玉米素0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L；

改良WPM培养基+玉米素0.2mg/L+KT-30 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+GA₃0.2mg/L；

改良WPM培养基+IBA 1.0mg/L+ABT1号0.5mg/L；

改良的WPM培养基，添加适量的活性炭，吸附植株分泌出的有毒次生代谢物，使植株生长活力保持旺盛，起到遏制褐化的作用；

采用本发明的组织培养繁殖方法，最终增殖率为113倍；其中采用采用诱导培养基，不定芽诱导率为96％，能够高效的得到含根南京椴组培苗，成活率达到95％以上。

具体实施方式

实施例1

一种南京椴的微繁方法，其包括下述步骤：

1)母本材料的选择：选用50株一年生实生苗作为微繁外植体的母本；

灭菌后污染率仅为2％，初代存活率达到98％。

7)不定芽的诱导：取步骤1)中经消毒后的枝条，切割为0.8cm长的茎段，每茎段带一腋芽，接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25℃，首先在黑暗中培养12小时，然后光照培养20天：光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx，每瓶接入3株，共接80瓶，所述不定芽诱导培养基为改良WPM培养基，添加的激素水平为：

ABT1号2mg/L+KT-30 2mg/L+玉米素0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L；

步骤C高压静电场处理具体操作为：

外植体接入培养基5天后，腋芽开始萌动，至20天时，萌发率为96％，共获得230株初代无菌苗，无菌苗生长良好，较绿，分化出4-5条嫩梢茎段，基本不褐化。

(9)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽切割后(每段带一个腋芽)接入继代增殖培养基，进行继代培养20天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx，

接入继代培养基4天后，腋芽开始出梢，20天后，增值率达到12倍，获得2760株继代增值无根试管苗。

(10)生根培养：将步骤(9)获得的南京椴无根试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养25天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000Lx，

生根培养基改良WPM培养基并添加IBA 1.0mg/L+ABT1号0.5mg/L；

25天后，生根率达到93％，至此，从外植体接种到获得完整无菌苗，共计需要65天，获得无菌苗5650株。

将步骤(10)所得南京椴带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2-3天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，所述基质成分为重量比1∶3∶2的黄心土、珍珠岩、草炭土。

经本发明方法获得的南京椴无菌苗驯化后成苗率高达95％，且经移栽大田两年后，长势强健，抗病，能够安全过冬，有效解决了南京椴市场资源的空缺，具有广阔的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种南京椴的微繁方法，其特征在于包括如下步骤：A南京椴实生苗的培育，B不定芽诱导，C高压静电场处理，D继代及生根，E驯化炼苗；

所述步骤B不定芽诱导具体为：

首先制备改良WPM培养基：用KNO₃450mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄，另外添加活性炭浓度为500mg/L，其他组分无变化；

其次，不定芽的诱导：取步骤A的外植体，消毒后，切割为0.8cm长的茎段，每茎段带一腋芽，接种于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25℃，首先在黑暗中培养12小时，然后光照培养20天：光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx，所述不定芽诱导培养基为改良WPM培养基，添加的激素水平为：

ABT1号2mg/L+KT-30 2mg/L+玉米素0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L；

所述步骤C高压静电场处理具体操作为：

利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为20KV/m，时间0.5小时；

所述步骤D继代及生根的具体操作为：

将经高压静电场处理的不定芽切割后接入继代增殖培养基，进行继代培养20天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000lx；然后接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度为25℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为2000Lx；

所述继代增殖培养基为改良WPM培养基并添加玉米素0.2mg/L+KT-30 0.5mg/L+IBA0.1mg/L+GA₃ 0.2mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A南京椴实生苗的培育具体为：

选用一年生实生苗作为微繁外植体，前一年采集种子时间为10月15日前，随采随播，采用沙藏法，种子萌发后，移栽至容器内培养，培养环境为采用温室培养，光强范围20000-30000lx，温度范围为12-36℃，叶面湿度控制在20％-50％，土壤湿度控制在40％-90％；栽培方法：使用容器栽培，容器脱离地面50cm，施用1/4Hoagland′s营养液，保持植株茎段嫩绿色，腋芽不形成鳞片。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤E驯化炼苗具体操作为：

将步骤D所得南京椴带根无菌苗露天培养2-3天，然后移入基质中，所述基质为黄心土、珍珠岩、草炭土按照重量比1∶3∶2混合而得。