CN103125393B

CN103125393B - 裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法

Info

Publication number: CN103125393B
Application number: CN201310079154.XA
Authority: CN
Inventors: 潘梅; 姜殿强; 云勇; 黄赛; 王景飞; 吕德任; 戚华莎
Original assignee: INSTITUTE OF GARDEN FLOWERS HAINAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF GARDEN FLOWERS HAINAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: CN103125393A

Abstract

本发明公开了裸花紫珠高效快速组织培养的方法。该方法选取裸花紫珠的成熟种子，经初代培养形成不定芽，利用不定芽进行继代增殖及生根培养。采用此组织培养方法繁殖裸花紫珠，操作简单，繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢的问题。该技术可用于工厂化生产，将对裸花紫珠的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。

Description

裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.ex Am)为马鞭草科紫珠属多年生小灌木植物，主产于中国海南，广东、广西也有分布，国外主要分布在越南、马来西亚和印度。裸花紫珠是一种珍贵的药材，始载于唐《本草拾遗》，其根、茎、叶均可入药，有消炎、收敛、止血、清热解毒等功效。裸花紫珠用途广泛，其药用历史悠长，作用广且疗效显著，目前医用临床上有裸花紫珠胶囊、裸花紫珠片、裸花紫珠栓等成品药剂，此外，裸花紫珠还用于制作牙膏，其叶可直接泡水饮用。由于裸花紫珠种子出苗率低，扦插繁殖系数较小，基本上没有大面积种植，其生产原材料主要依靠采挖野生资源，随着市场需求量的逐年增加，野生资源的逐年锐减，已远远不能满足生产的需求。而且由于人为无度的大肆采收，资源破坏严重。因此，进行裸花紫珠的人工繁殖极有必要，而采用组织培养技术是最为有效的人工繁殖途经。目前，有关裸花紫珠的研究主要集中在化学成分、药理作用及临床应用上，利用种子和枝条进行人工繁育的报道极少，而裸花紫珠的组织培养和快速繁殖尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供了裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，该方法操作简单、繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢问题。

　为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）材料与外植体消毒：选用裸花紫珠成熟种子，将裸花紫珠种子在自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用浓度为75%酒精浸泡10 s，无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1% HgCl₂溶液浸泡10 min，再用无菌水冲洗5次；

（2）种子诱导培养基的制备：以MS为基本培养基,添加蔗糖30 g/L、卡拉胶6 g/L，pH 5.8，配制后,于温度121℃、压力0.14 MPa高温高压灭菌20 min；

（3）种子的萌发：将已消毒好的种子接入步骤（2）种子诱导培养基中，培养25天后开始萌发，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d；

（4）丛生芽的诱导：切取小苗上端约1.0 cm长转入增殖培养基中，28～30天可分化出5～6个芽，萌发出的新芽即可用解剖刀切分转入相同的培养基中进行增殖培养;增殖培养基为MS+ 6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8；

（5）丛生芽继代增殖:丛生芽接入培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，置于温度为24～28℃，光照强度为1500 lx的培养室中培养，光照时间8 h/d，继代时间为30～40 d；

（6）生根培养：将高度达到2 cm的小苗进行生根培养，培养基为MS+NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d；

（7）组培苗的炼苗与移栽：无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高3～5 cm，根5条以上，将其移入拱棚内炼苗7～15天即可移栽;小苗从培养袋中取出后，用清水洗去根部残留的培养基，栽植于下列体积比为1:1:1混合基质中：河沙、珍珠岩和表土，种后浇透水，盖上透明塑料薄膜，注意遮阴， 20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理。

本发明提供了裸花紫珠高效快速组织培养的方法。该方法选取裸花紫珠的成熟种子，经初代培养形成不定芽，利用不定芽进行继代增殖及生根培养。采用此组织培养方法繁殖裸花紫珠，操作简单，繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢的问题。该技术可用于工厂化生产，将对裸花紫珠的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 材料与外植体消毒

材料为采自海南五指山的裸花紫珠成熟种子。将裸花紫珠种子在自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用75%酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl₂溶液浸泡10 min，无菌水冲洗5次，然后将种子接种到诱导培养基上。

1.2 培养基

以MS为基本培养基, 根据试验目的添加不同浓度的植物生长调节剂6-BA（6-苄基腺嘌呤）和NAA （萘乙酸），附加蔗糖30 g/L、卡拉胶6 g/L，pH 5.8，配制分装后,于温度121℃、压力0.14 MPa高温高压灭菌20 min。

1.3 丛生芽的增殖

1.3.1 生长调节剂组合对丛生芽增殖的影响设计6-BA和NAA2种生长调节剂4个浓度水平的配比，30天统计丛生芽增殖系数。培养温度为(26±2)℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d。

1.3.2 温度对丛生芽增殖的影响将丛生芽接入MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L培养基中，置于光照强度1500 lx，温度分别为22、25、28、32℃的培养室中培养，每种处理接种10袋，每袋3块丛芽，3次重复，定期观察记录，30天后统计丛生芽增殖系数。

1.3.3 光照强度对丛生芽增殖的影响将丛生芽接入MS+ 6-BA2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L培养基中，置于温度为28℃，光照强度分别为500、1000、1500、2000、2500 lx的光照培养箱中培养，每种处理接种10袋，每袋3块丛芽，3次重复，30天后统计丛生芽增殖系数，观察生长状况。

1.4 生根培养

将高度达到2cm的小苗进行生根培养，培养基中添加不同浓度的NAA共5种处理，每种处理接种6袋，每袋8株，3次重复，30天统计生根情况。培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d。

1.5 组培苗的炼苗与移栽

无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高3～5 cm，根5条以上，将其移入拱棚内炼苗7～15天即可移栽。小苗从培养袋中取出后，用清水洗去根部残留的培养基，分别栽植于下列基质中：①河沙:珍珠岩=1:1，②河沙:椰糠=1:1，③河沙:红土=1:1，④河沙:珍珠岩:表土=1:1:1，每种基质各栽种100株，种后浇透水，盖上透明塑料薄膜，注意遮阴，30天后统计成活率。每种基质随机选择30株，量取植株地上部分高度，统计高生长量。

1.6 统计方法

采用方差分析法，F测验显著后用新复极差法(SSR)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 种子的萌发和丛生芽的诱导

种子在诱导培养基（MS基本培养基）上培养25天后开始萌发，切取小苗上端约1.0 cm长转入增殖培养基中，30天左右可分化出5～6个芽，萌发出的新芽即可用解剖刀切分转入相同的培养基中进行增殖培养。增殖培养基为MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8；

2.2 丛生芽的增殖继代

2.2.1 植物生长调节剂组合对裸花紫珠丛生芽增殖的影响裸花紫珠丛生芽增殖培养的最优组合为丛生芽接入培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH5.8，置于温度为24～28℃，光照强度为1500 lx的培养室中培养，光照时间8 h/d，继代时间为30 d；丛生芽的增殖系数达10.87，而且丛生芽的生长状况也最好，芽苗健壮鲜绿较为整齐，高2.5 cm。

2.2.2 温度对丛生芽增殖的影响裸花紫珠丛生芽继代增殖最适宜的温度为28℃，丛生芽的增殖系数达10.48。

2.2.3 光照强度对丛生芽增殖的影响裸花紫珠丛生芽继代增殖培养的最适宜光照强度为1500 lx，丛生芽的增殖系数达10.18。

2.2.4 NAA浓度对生根的影响培养基为MS+NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d适于裸花紫珠的生根培养。结果：平均生根条数5.57～9.83条、平均根长1.75～1.92 cm、平均株高3.91～3.98cm、平均生根率100%、生长状况良好。

2.3 组培苗移栽

裸花紫珠组培苗移栽在河沙、珍珠岩和表土(1:1:1)的混合基质最好，20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理，移栽30天的成活达96%。裸花紫珠组培苗不仅成活率高，而且生长快。

3 结论

（1）裸花紫珠种子是适宜的外植体材料，其表面光洁，自身携带的杂菌少，灭菌较容易。种子用75%酒精预处理10 s，再用0.1% HgCl2浸泡10 min，灭菌效果最好，污染率低于30%。

（2）培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L能很好地诱导丛生芽，适宜继代增殖，30天的增殖系数为10.87，芽苗生长状况好。培养基中6-BA浓度过高或过低，丛生芽增殖系数较低长势弱，6-BA为3.00 mg/L时，出现玻璃化现象，因此，在继代增殖培养中，6-BA浓度不宜超过3.00 mg/L。

（3）裸花紫珠丛生芽继代增殖最适宜的培养温度是28℃，光照强度是1500 lx，在这样的培养条件下，丛生芽长势好，增殖系数高。过高、过低的培养温度和光照强度均不利于从生芽的生长，温度达到32℃时，出现玻璃化苗。

（4）培养基为MS+NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0g/L适宜诱导生根，生根率100%，根系质量好。NAA浓度超过1.00 mg/L会产生畸形根。

（5）裸花紫珠组培苗移栽基质要求通气保水性好而且富含营养，组培苗移栽于河沙、珍珠岩、表土按照1:1:1比例混合的基质中，成活率最高，达到96%，植株生长状态良好，而且较其他基质表现速生。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims

1.裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)材料与外植体消毒：选用裸花紫珠成熟种子，将裸花紫珠种子在自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用浓度为75％酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1％HgCl₂溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗5次；

(2)种子诱导培养基的制备：以MS为基本培养基,添加蔗糖30g/L、卡拉胶6g/L，pH 5.8，配制后,于温度121℃、压力0.14MPa高温高压灭菌20min；

(3)种子的萌发：将已消毒好的种子接入步骤(2)种子诱导培养基中，培养25天后开始萌发，培养温度为24～28℃，光照强度1500lx，光照时间8h/d；

(4)丛生芽的诱导：切取小苗上端0.8～1.0cm长转入增殖培养基中，28～30天可分化出5～6个芽，萌发出的新芽用解剖刀切分转入相同的培养基中进行增殖培养；增殖培养基为MS+6-BA 2.00mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.0g/L，pH 5.8；

(5)丛生芽继代增殖:丛生芽接入培养基MS+6-BA 2.00mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.0g/L，pH 5.8，置于温度为24～28℃，光照强度为1500lx的培养室中培养，光照时间8h/d，继代时间为30～40d；

(6)生根培养：将高度达到2cm的小苗进行生根培养，培养基为MS+NAA0.5～0.75mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.0g/L，pH 5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1500lx，光照时间8h/d；

(7)组培苗的炼苗与移栽：无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高3～5cm，根5条以上，将其移入拱棚内炼苗7～15天后移栽；小苗从培养袋中取出后，用清水洗去根部残留的培养基，栽植于下列体积比为1:1:1混合基质中：河沙、珍珠岩和表土，种后浇透水，盖上透明塑料薄膜，注意遮阴，20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理。