CN105766655B

CN105766655B - 绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法

Info

Publication number: CN105766655B
Application number: CN201610271956.4A
Authority: CN
Inventors: 刘克明; 田学辉
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: CN105766655A

Abstract

本发明公开了绒毛皂荚(Gleditsia vestita Chun et How ex B.G.Li.)组织培养再生体系的建立方法。以绒毛皂荚(Gleditsia vestita Chun et How ex B.G.Li.)无菌苗的子叶为外植体，通过愈伤组织诱导、不定芽增殖、生根和驯化移栽，建立绒毛皂荚组织培养的快速繁殖体系。结果表明：(1)绒毛皂荚子叶在MS+6‑BA3.0mg/L+KT0.4mg/L+IAA0.3mg/L培养基上同步诱导出愈伤和芽，平均诱导率达到90.5％；(2)不定芽增殖的最佳培养基为1/2MS+6‑BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+NAA0.2mg/L，增殖倍数为4.0；(3)MS+NAA0.5mg/L+IAA0.25mg/L条件下，生根率高达100％；移栽后植株长势好，成活率高达90％以上。

Description

绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及绒毛皂荚(Gleditsia vestita Chun etHow ex B.G.Li.)组织培养再生体系的建立方法。

背景技术

绒毛皂荚(Gleditsia vestita Chun et How exB.G.Li.)又名毛果皂荚，为湖南特有种，是国家二级保护植物。野生绒毛皂荚比“植物界熊猫”之称的银杉还稀少，现原生种仅存4株于南岳山麓，其中有一株已经空心腐朽。从分类学意义上来说，绒毛皂荚是豆科植物中较为原始的种，在研究整个豆科植物进化分类上有重要价值。同时绒毛皂荚还具有较高的经济价值：果实中含有丰富的胰皂素，可作为丝绸和家具的洗涤剂，将来可以作为新型环保洗涤材料的原料；从外形上看绒毛皂荚树形优美，植物体上长有枝刺十分奇特，春季花叶同放，开花时花量大，密满花相，结果时，果实金光闪闪十分好看，为园林上不可多得的庭院树种；相对来说绒毛皂荚生长速度较快，而且木质坚硬，不易扭曲可作为家具材料。

绒毛皂荚种子结果量多，一个豆荚内大约有20至30粒种子，由于其豆荚和种皮的特殊生理结构，种子在自然条件下很难发芽成苗，自然更新十分缓慢。国内学者为了保护这一珍稀树种，增加其种群数量，进行了大量研究，但有关组织培养快繁技术体系的研究尚少见报道。本发明以种子为外植体，通过正交设计，探索不同激素浓度组合对绒毛皂荚愈伤诱导、分化、增殖、生根的影响，建立了绒毛皂荚组织培养的快速繁殖体系，对保护绒毛皂荚种质资源具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供快速高效的绒毛皂荚(Gleditsia vestita Chun et How exB.G.Li.)组织培养再生体系的建立方法。

绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，包括以下步骤：

1)外植体消毒及无菌苗的培养

将采集的绒毛皂荚种子于超净工作台消毒清洗备用，将消毒后的种子接种在培养基上培养无菌苗；

2)愈伤组织的诱导

取种子无菌苗子叶，切成适当大小接种在MS+6-BA3.0mg/L+KT0.3-0.6mg/L+IAA0.1-0.3mg/L培养基上同步诱导出愈伤组织和芽；

3)不定芽的增殖

将不定芽接种于1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+NAA0.2-0.6mg/L培养基中进行增殖培养；

4)不定芽生根培养和驯化移栽。

步骤1)所述的外植体消毒过程如下：将采集的绒毛皂荚种子于超净工作台70％酒精处理30s，再用0.1％升汞消毒30min，无菌水清洗5次备用；所述的无菌苗的培养过程如下：将消毒后的种子接种在MS培养基上,18-22℃进行发芽试验，待培养至无菌苗长至5-7cm时用于步骤2)。

步骤2)取种子无菌苗子叶，将子叶切成1cm²大小，用于接种，步骤2)的MS培养基中蔗糖为3％，琼脂为0.5％，pH值为5.90-5.95。

步骤3)中待不定芽的幼苗长至1～2cm时接种于培养基中进行增殖培养。

步骤2)和3)培养时每日补充光照12h，光照强度为2000-2500lx，温度22±2℃。

步骤4)待不定芽长至2.0～4.0cm时，接种到MS+IAA 0.25mg/L+NAA 0.5mg/L生根培养基上，温度控制在24±2℃，光照12h/d，光强2000lx。

步骤4)将已经生根的苗置于炼苗室炼苗，炼苗床基质配比为园土与椰糠泥沙体积比为1:2:1。

步骤2)优选将绒毛皂荚子叶在MS+6-BA3.0mg/L+KT0.4mg/L+IAA0.3mg/L培养基上同步诱导出愈伤和芽。

步骤3)中不定芽增殖的培养基优选为1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+NAA0.2mg/L。

本发明根据观察发现绒毛皂荚结实量较为丰富，但种子不易成苗，而且嫩茎中富含萜类、酚类物质用生汞消毒后较易褐化，消毒不彻底易生菌。摘取当年生种子进行破皮处理，在无菌条件下进行萌发，获得无菌的外植体能大大缩短实验时间，降低实验难度；愈伤组织的诱导与不定芽的分化在同一培养基中进行，可以减少染菌机会，而且缩短实验时间。本发明发现6-BA对绒毛皂荚愈伤诱导，不定芽分化，不定芽增殖都有较大影响，不同的浓度对绒毛皂荚的作用各不相同。不同浓度的6-BA产生愈伤组织的类型各不相同，6-BA浓度为1.0mg/L时形成的愈伤组织结构松散，颜色淡黄色，6-BA浓度为2.0mg/L时，诱导的愈伤组织颜色为嫩绿色，结构较松散，6-BA浓度为3.0mg/L时诱导形成的愈伤组织结构致密，颜色为绿色。

不同部位的外植体对培养基敏感程度也各不相同，在此次探究中，相对来说子叶诱导愈伤组织分化不定芽较易。胚轴诱导愈伤较快，但是愈伤组织不能继续分化出不定芽，可能是培养基浓度与组合不适合胚轴形成愈伤组织的分化，可以在以后的研究中继续探讨对胚轴的最适合培养基组合，

本发明绒毛皂荚再生体系的建立和优化是可行和高效的。对影响绒毛皂荚愈伤组织诱导、愈伤组织分化及增殖培养因子进行优化，初步探明了愈伤诱导、植株再生、增殖的主要影响因子，形成一套完整的再生体系，为绒毛皂荚的保护提供一种新的思路。另外，本发明摸索出的组织培养体系的优势还体现在丛生芽长期继代而增殖系数基本不下降，此技术体系短期内可获得大量的丛生芽。

附图说明

图1为愈伤分化培养基效果图；

图2为8号培养基中效果；

图3为叶腋诱导丛芽培养基效果图；

图4为Z5培养基丛芽效果图；

图5为生根培养基效果图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

1材料与方法

1.1材料

从湖南省衡山市南岳自然保护区广济寺附近(北纬27°17′55.26″；东经114°42′15.59″；海拔950m)摘取的绒毛皂荚原生种当年成熟种子若干，带回实验室经搓揉、剥壳，种子洗净、水选、分选、自然风干后置室内阴凉干燥处保存备用。

1.2方法

1.2.1外植体消毒及无菌苗的培养

将采集的绒毛皂荚种子于超净工作台70％酒精处理30s，再用0.1％升汞消毒30min，无菌水清洗5次备用。将消毒后的种子接种在MS培养基上,室温(20℃)左右，进行发芽试验，待培养10d左右无菌苗长至5-7cm时，进行下一步研究。1.2.2愈伤组织的诱导

取种子无菌苗子叶，将子叶切成1cm²左右大小，接种在添加了不同浓度的6-BA(1.0、2.0、3.0mg/L)、KT(0.2、0.4、0.6mg/L)、IAA(0.1、0.2、0.3mg/L)的MS培养基上中，3种植物激素配合使用，采用L₉(3³)正交表进行正交设计，每个设计组织9次试验，每个处理接种10皿，每皿4个外植体，三次重复。其中蔗糖为3％，琼脂为0.5％，pH值为5.90-5.95，每日补充光照12h，光照强度为2000～2500lx，组培室温度22±2℃。每隔5天记录一次，40d左右统计数据并进行分析。

1.2.3不定芽的增殖

待幼苗长至1～2cm时，接种于添加了不同浓度6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)、IBA(0.1、0.3、0.5mg/L)、NAA(0.2、0.4、0.6mg/L)的1/2MS培养基中进行增殖培养，植物激素采用L₉(3³)正交表进行正交设计，每个设计组织9次试验，每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体，三次重复。培养条件同上，每隔5天观察一次，20d左右统计不定芽增殖情况。

1.2.4不定芽生根培养和驯化移栽

待不定芽长至2.0～4.0cm时，接种到MS+IAA 0.25mg/L+NAA 0.5mg/L生根培养基上。培养室温度控制在(24±2)℃，光照12h/d，光强约为2000lx左右。每个处理接种50个芽，重复3次。每隔5天观察一次，20后统计生根状况。将已经生根的苗置于炼苗室炼苗，炼苗床基质配比为园土与椰糠泥沙体积比为1:2:1(均已消毒)，30天后统计存活率。

2结果与分析

2.1愈伤组织与不定芽的诱导

1-9号培养基均能诱导愈伤组织(图1-1--1-9)产生，接种后约5d左右，叶片的切口处开始膨大，有瘤状突起，10d左右开始出现小块团状乳白色组织，15d左右愈伤组织加速扩展。

由表1可以看出，IAA不同浓度诱导率的极差最大(R＝16.5)，其次为KT(R＝7.3)和6-BA(R＝7.1)，说明添加的3种植物生长调节物质中，IAA是绒毛皂荚愈伤组织诱导的主要因素。根据观察2号、3号、4号、7号、8号培养基诱导愈伤率效果较好都达到90.0％以上。方差分析结果表明，9种不同培养基分别对绒毛皂荚愈伤率的影响达到极显著水平(P<0.01)。多重比较结果显示3、8号培养基与2、4、9培养基之间差异显著，且愈伤率都超过90.0％。

继续培养25d左右，愈伤组织边缘开始出现绿色芽点，35d左右芽点伸长，40d左右，开始分化出茎叶，逐渐伸长，不定芽的数量不断增加。4、5、6号培养基一般只能分化出单株继代苗(图1-4--1-6)，7、8、9号培养基可分化出丛芽，8号培养基分化丛芽生长状态良好，且愈伤组织活性强(图2)。

综合愈伤组织的诱导与不定芽分化的效果，8号培养基为最优的激素组合。

表1不同浓度的激素组合对绒毛皂荚愈伤组织和不定芽诱导的影响

2.2不定芽的增殖培养

培养5天后开始有点状凸起，第10天时，叶腋处开始出芽，可见两片叶分化，增殖芽呈线状或团状组合，丛芽数数目1-5不等，第15天时丛生芽幼叶展开，第20天时丛生芽可生长至2cm。在Z1-Z3培养基中，平均增殖倍数为分别为1.5、1.0、2.0，增殖芽瘦小，黄化，易脱落，外植体生长不良(图3)；在Z4-Z6培养基中，平均增值倍数分别为3.0、4.0、3.5，增殖芽生长良好，芽生长至2cm时，可接入相同培养基中继续增殖培养，在Z7-Z9培养基中，平均增值倍数分别为2.0、2.0、2.5，增殖芽较粗壮，茎节较短，增殖芽不黄化。

分析表2数据可知，6-BA不同浓度诱导增殖倍数的极差最大(R＝2.0)，其次为IBA(R＝0.7)和NAA(R＝0.5)，说明添加的3种植物生长调节物质中，6-BA是影响绒毛皂荚不定芽增殖的主要因素。当6-BA浓度<1.0mg/L时，外植体愈伤化明显，植株生长不良，叶腋芽生长后容易脱落；当6-BA浓度1.0-1.5mg/L时，外植体生长正常，有利于诱导不定芽增殖；当6-BA浓度>1.5mg/L时，丛芽分化，丛芽生长较慢，较矮壮，生长较慢。方差分析结果表明，9种不同培养基分别对绒毛皂荚芽增殖的影响达到极显著水平(P<0.01)。多重比较结果显示Z2号培养基与Z5培养基之间差异显著，Z5培养基平均增殖倍数最高。

综合以上，可知Z5对绒毛皂荚芽增殖效果最好，是最优的激素组合。

表2不同浓度的激素组合对绒毛皂荚不定芽增殖的影响

2.3生根与驯化移栽

外植体在培养基中生根较快，平均生根7条，20天后根系长约6-7cm，生根率达100％。把生根苗放置炼苗室中，存活率高达90％。绒毛皂荚试管苗移栽于温室30天左右，生长良好，存活率90％。

Claims

1.绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外植体消毒及无菌苗的培养

2)愈伤组织的诱导

3)不定芽的增殖

4)不定芽生根培养和驯化移栽

待不定芽长至2.0～4.0cm时，接种到MS+IAA 0.25mg/L+NAA 0.5mg/L生根培养基上，温度控制在24±2℃，光照12h/d，光强2000lx。

2.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤1)所述的外植体消毒过程如下：将采集的绒毛皂荚种子于超净工作台70％酒精处理30s，再用0.1％升汞消毒30min，无菌水清洗5次备用；所述的无菌苗的培养过程如下：将消毒后的种子接种在MS培养基上,18-22℃进行发芽试验，待培养至无菌苗长至5-7cm时用于步骤2)。

3.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤2)取种子无菌苗子叶，将子叶切成1cm²大小，用于接种，步骤2)的MS培养基中蔗糖为3％，琼脂为0.5％，pH值为5.90-5.95。

4.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤3)中待不定芽的幼苗长至1～2cm时接种于培养基中进行增殖培养。

5.根据权利要求1或3或4所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤2)和3)培养时每日补充光照12h，光照强度为2000-2500lx，温度22±2℃。

6.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤4)将已经生根的苗置于炼苗室炼苗，炼苗床基质配比为园土与椰糠、泥沙体积比为1:2:1。

7.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤2)将绒毛皂荚子叶在MS+6-BA3.0mg/L+KT0.4mg/L+IAA0.3mg/L培养基上同步诱导出愈伤和芽。

8.根据权利要求1所述的绒毛皂荚组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤3)中不定芽增殖的培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+NAA0.2mg/L。