CN112106664B

CN112106664B - 一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法

Info

Publication number: CN112106664B
Application number: CN202011165325.7A
Authority: CN
Inventors: 罗桂芬; 孙卫邦; 葛佳; 陶丽丹; 蔡磊
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2040-10-27
Also published as: CN112106664A

Abstract

本发明提供了一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，属于植物组培技术领域。本发明以壮丽含笑成熟种子为外植体，通过外植体消毒、种子无菌萌发、增殖与生根培养步骤，为壮丽含笑的人工繁殖、引种驯化、迁地保护、近地保护、就地保护等提供材料，而且有效避免了壮丽含笑野生资源自然消失与灭亡、扩大自然界中种群数量及其在园林园艺景观上开发利用等方面的问题。本发明提供的方法，种子10天开始萌发，种子无菌萌发率83％，繁殖周期60天，增殖系数为5.1，生根率为93％，移栽成活率96％，极大地提高了壮丽含笑的繁殖数量与生长速率，为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产供了技术支撑。

Description

一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法。

背景技术

壮丽含笑(Michelia lacei)隶属于木兰科含笑属，壮丽含笑为中国云南特有物种，分布区域狭窄，目前发现的少数野生居群主要分布于云南。壮丽含笑具有较高的观赏、经济价值。近年来，由于人类采食其种子、开荒、放牧等活动的干扰导致居群自然更新复壮缓慢，种群持续衰退，几近灭绝。壮丽含笑结果量少，种子量不多，并存在结果大小年的情况，自然繁殖和更新都较为困难。

迄今为止，现有技术没有关于壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖和相关的生物技术方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，解决壮丽含笑在野外分布区域狭窄、种群数量稀少、种子苗量不足的问题。

本发明提供了一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的壮丽含笑成熟的带红色假种皮的种子接种于萌发培养基中萌发培养，得到萌发的种子苗；所述萌发培养基为1/4MS固体培养基、1/3MS固体培养基、1/2MS固体培养基或纯琼脂培养基；pH值5.8；

2)将所述萌发节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖苗；所述增殖与继代培养基为含0.1～1.5mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8；

3)将所述增殖苗接种至壮苗与生根培养基上生根培养，得到生根植株；

所述壮苗与生根培养基为含0.1～1.2mg/L IBA、0.1～1.2mg/L IAA、30g/L蔗糖、5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8；

4)将所述生根植株进行瓶苗移栽，培养，得到壮丽含笑植株。

优选的，所述萌发培养为暗培养，所述萌发培养的时间为30d。

优选的，所述增殖与继代培养基为含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8。

优选的，所述壮苗与生根培养基为含1.0mg/L IBA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8。

优选的，所述增殖继代培养或所述壮苗生根培养的条件如下：

温度为23～28℃；

光暗周期为10:14；光照强度为1300～1700Lux；

所述增殖继代培养的时间为58～62d；所述壮苗生根培养的时间为28～32d。

优选的，所述瓶苗移栽前，预先提前一周将生根植株置放于大棚炼苗。

优选的，瓶苗移栽用基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；

所述混合物中，珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。

优选的，所述基质用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。

优选的，所述培养的大棚温度为20～30℃，空气湿度为70％～80％，基质湿度为40％～50％。

本发明提供了一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，具有以下有益效果：

1)本发明建立了有效的壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，解决了其分布狭窄、种群数量极少等问题，填补了壮丽含笑在生物技术上的研发空白。

2)本发明通过壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，成苗容易，繁殖步骤简化，有效繁殖速率高，为保存和扩大壮丽含笑种群，意义重大。

3)本发明通过壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，高度保持了壮丽含笑的遗传稳定性和一致性，为壮丽含笑全面的开发和持续利用奠定了基础。

4)本发明的壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法繁育的壮丽含笑，30天后种子萌发率83％，在60天内增殖系数为5.1，生根率为93％，移栽成活率为96％，极大地提高了壮丽含笑的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。

附图说明

图1为本发明壮丽含笑萌发情况；

图2为本发明壮丽含笑组培繁殖情况；

图3为本发明壮丽含笑组培生根情况。

具体实施方式

1)将消毒后的壮丽含笑成熟的带红色假种皮的种子接种于萌发培养基中萌发培养，得到萌发节芽；所述萌发培养基为1/4MS固体培养基、1/3MS固体培养基、1/2MS固体培养基或纯琼脂培养基，pH值为5.8；

所述壮苗与生根培养基为含0.1～1.2mg/L IBA、0.1～1.2mg/L IAA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8；

本发明将消毒后的壮丽含笑成熟的带红色假种皮的种子接种于萌发培养基中萌发培养，得到萌发芽；所述萌发培养基为1/4MS固体培养基、1/3MS固体培养基、1/2MS固体培养基或纯琼脂培养基，pH值均为5.8。

在本发明中，所述消毒优选为在无菌条件下，用体积浓度75％酒精对未裂开的聚合果进行表面消毒，晾干水分后，用无菌的镊子和刀片取出带红色假种皮的种子。

在本发明中，所述萌发培养优选为暗培养，培养温度优选为23～28℃，更优选为25～28℃。所述接种优选每瓶接种一粒种子。所述萌发培养基的pH值优选为5.8。所述萌发培养基优选为1/2MS固体培养基。由于种子自带营养物，萌发培养时培养基不添加激素，添加了反而抑制萌发。所述萌发培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。培养10天后，种子开始萌发。

得到萌发芽后，本发明将所述萌发节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖苗；所述增殖与继代培养基为含0.1～1.5mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8。

在本发明中，所述增殖与继代培养基优选为含0.5～1.2mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/LIAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，更优选为含1.0mg/L6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8。所述增殖继代培养的条件优选如下：温度为23～28℃，更优选为25～28℃；所述光暗周期为10:14；光照强度优选为1300～1700Lux，更优选为1500Lux。所述增殖继代培养的时间优选为58～62d，更优选为60d。

在本发明中，在所述增殖与继代培养基上增殖培养，是以节芽方式进行繁殖，生长迅速，60天生长高度达4.7cm，平均繁殖倍数5.1。

得到增殖苗后，本发明将所述增殖苗接种至壮苗与生根培养基上生根培养，得到生根植株；所述壮苗与生根培养基为含0.1～1.2mg/L IBA、0.1～1.2mg/LIAA、30g/L蔗糖、5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8。

在本发明中，所述壮苗与生根培养基优选为含0.5～1.0mg/L IBA、0.5～1.0mg/LIAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8，更优选为含1.0mg/L IBA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8。所述壮苗生根培养的条件优选如下：温度为23～28℃，更优选为25～28℃；光暗周期为10:14；光照强度为1300～1700Lux，更优选为1500Lux；所述壮苗生根培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。

在本发明中，所述瓶苗移栽前，优选预先提前一周将生根植株置于大棚炼苗。所述大棚的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；空气湿度优选为70％～80％，更优选为75％；基质湿度优选为40％～50％，更优选为45％。瓶苗移栽用基质优选为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；所述混合物中，珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比优选为1：1：2。所述基质用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。

在本发明中，所述方法能成功培育壮丽含笑完整植株，且本发明提供的方法较大程度提高生根率和成活率，实验表明，生根率为93％，移栽成活率为96％，极大地提高了壮丽含笑的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。

下面结合实施例对本发明提供的一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种壮丽含笑种子无菌萌发的方法，包括以下步骤：

选择壮丽含笑成熟的未裂开的聚合果，在超净台上，用75％酒精进行表面消毒，置于无菌滤纸上，晾干表面的水分，用无菌的镊子和刀片取出带红色假种皮的种子为外植体。

将带红色假种皮的种子接种至萌发培养基上进行萌发培养，培养基分别为MS+无激素；1/2MS+无激素；1/3MS+无激素；1/4MS+无激素；纯琼脂+无激素，pH值均为5.8。每瓶接种一粒种子，每个处理共接种10粒种子，重复3次。

表1壮丽含笑种子萌发培养基的筛选

在无光照、温度为23～30℃条件下培养，10天后，种子开始萌发，培养周期为30天，适宜的萌发培养基为1/2MS+无激素，萌发率为83％。

实施例2

一种壮丽含笑种子快速繁殖的方法，包括以下步骤：

将萌发节芽接种至增殖与继代培养基上进行增殖继代培养，每个处理共接种10个萌发节芽，重复3次。以MS培养基为增殖与继代激素筛选的基本培养基，细胞分裂素均为6-BA，浓度范围为(0.1mg/L，0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L，1.2mg/L，1.5mg/L，6个浓度梯度)，生长素浓度分别为(0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，3个浓度梯度)，采用均匀设计法进行，结果见表2。

表2增殖培养基激素筛选

所述增殖与继代培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为23～28℃，培养60天后，增殖苗生长高度达4.7cm，平均繁殖倍数5.1。

实施例3

一种壮丽含笑种子快速繁殖的方法，包括以下步骤：

将实施例2制备的增殖苗接种至生根培养基上，生根培养基配方见表3中4种配方，进行生根培养基筛选。

表3生根培养基激素筛选结果

结果见表3。MS培养基+1.0mg/L IAA+1.0mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L、pH值5.8的配方最佳，培养周期30天，与其他配方相比具有显著优势，生根率达93％。

实施例4

将实施例3制备的生根苗接种至表4中4种栽培基质中进行栽培基质的筛选。

表4栽培基质的筛选实验结果

结果见表4。实验④中三种基质配合，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供足够的营养，同时红土为土层深部土壤，带菌量较少，有利于无菌苗的生长。30天后移栽成活率达到96％。

实施例5

一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖的方法，包括以下步骤：

将带红色假种皮的种子接种至萌发培养基上进行萌发培养，每瓶接种一颗种子，共接种10粒种子，得到萌发节芽。适宜种子萌发培养基为1/2MS+5g/L琼脂，pH值5.8；在无光照、温度为23～30℃的条件下培养，10天后，种子开始萌发，培养周期为30天，萌发率为81％。

将萌发节芽接种至增殖与继代培养基上进行增殖继代培养，共接种30个萌发节芽，得到增殖苗。所述适宜的增殖与继代培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为23～30℃培养60天后，增殖苗生长高度达4.7cm，平均繁殖倍数5.1。

将增殖苗接种至壮苗与生根培养基上进行壮苗生根培养，所述适宜的壮苗与生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为26℃，培养周期30天，生根率达93％。

将所得生根苗提前移至遮光率为85％大棚炼苗一周，准备移栽基质，所述移栽基质为体积比为1：1：2的珍珠岩、腐殖土和生红土，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8，开瓶轻轻取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为20～30℃，遮光度在85％，空气湿度80～85％，基质湿度40～50％，移栽30天后成活率96％。

实施例6

将带红色假种皮的种子接种至萌发培养基上进行萌发培养，每瓶接种一颗种子，共接种10粒种子，得到种子苗。适宜种子萌发的培养基为1/2MS+5g/L琼脂，pH值5.8；在无光照、温度为25℃的条件下培养，10天后，种子开始萌发，培养周期为30天，萌发率为83％。

将萌发节芽接种至增殖与继代培养基上进行增殖继代培养，共接种10个萌发节芽，得到增殖苗。所述适宜的增殖与继代培养基为MS+1.2mg/L6-BA+0.4mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为25℃培养60天后，增殖苗生长高度达4.7cm，平均繁殖倍数5.1。

将增殖苗接种至壮苗与生根培养基上进行壮苗生根培养，所述适宜的壮苗与生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为25℃，培养周期30天，生根率达93％。

将所得生根苗提前移至遮光率为80％大棚炼苗一周，准备移栽基质，所述移栽基质为体积比为1：1：2的珍珠岩、腐殖土和生红土，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8，开瓶轻轻取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为20～30℃，遮光度在80％，空气湿度70～80％，基质湿度40～50％，移栽30天后成活率93％。

实施例7

将带红色假种皮的种子接种至萌发培养基上进行萌发培养，每瓶接种一颗种子，共接种10粒种子，得到萌发节芽。适宜种子萌发培养基为1/2MS+5g/L琼脂，pH值5.8；在无光照、温度为23～30℃的条件下培养，10天后，种子开始萌发，培养周期为30天，萌发率为82.5％。

将增殖苗接种至壮苗与生根培养基上进行壮苗生根培养，所述适宜的壮苗与生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，光暗周期为10:14，光照强度为1500Lux，温度为23～30℃，培养周期30天，生根率达93％。

将所得生根苗提前移至遮光率为85％大棚炼苗一周，准备移栽基质，所述移栽基质为体积比为1：1：2的珍珠岩、腐殖土和生红土，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8，开瓶轻轻取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为30℃，遮光度在85％，空气湿度70～80％，基质湿度40～50％，移栽30天后成活率96％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将消毒后的壮丽含笑成熟的带红色假种皮的种子接种于萌发培养基中萌发培养，得到萌发节芽；所述萌发培养基为1/4MS固体培养基、1/3MS固体培养基或1/2MS固体培养基，pH值为5.8；

2)将所述萌发节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖苗；所述增殖与继代培养基为仅含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/LIAA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8；

所述壮苗与生根培养基为仅含0.5～1.2mg/L IBA、0.5～1.2mg/LIAA、30g/L蔗糖、5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值5.8；

2.根据权利要求1所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述萌发培养为暗培养，所述萌发培养的时间为28～32d。

3.根据权利要求1所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述壮苗与生根培养基为仅含1.0mg/L IBA、1.0mg/LIAA、蔗糖30g/L、琼脂5g/L的MS培养基，pH值5.8。

4.根据权利要求1所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述增殖继代培养或所述生根培养的条件如下：

培养温度为23～30℃；

光暗周期为10:14；光照强度为1300～1700Lux；

所述增殖继代培养的时间为58～62d；所述生根培养的时间为28～32d。

5.根据权利要求1～4任意一项所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述瓶苗移栽前，预先提前一周将生根植株置于大棚炼苗。

6.根据权利要求5所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，瓶苗移栽用基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；

7.根据权利要求6所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述基质用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。

8.根据权利要求7所述壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤4)中培养的大棚温度为20～30℃，空气湿度为70％～80％，基质湿度为40％～50％。