CN112243860B - 一种云南梧桐组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种云南梧桐组培快繁方法，属于植物组培技术领域。本发明以云南梧桐幼嫩的顶芽或侧芽为外植体，通过外植体消毒以及在特定培养基上依次经诱导、分化、增殖与生根一系列培养，有效解决了云南梧桐组培快繁、引种驯化、保护及其科研、园林绿化上的开发利用问题，同时有效避免野生资源自然消失与灭亡和过度利用所造成的自然植株量减少与自然植被区破坏，特别是在保持特殊性状的稳定性方面具有积极作用。本发明提供的方法诱导分化率78％，繁殖周期60天，增殖系数为3，生根率为91％，移栽成活率为95％以上，极大地提高了云南梧桐的繁殖数量与生长速率，为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产供了技术支撑。

Description

一种云南梧桐组培快繁方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种云南梧桐组培快繁方法。

背景技术

云南梧桐(Firmiana major)隶属于梧桐科(Sterculiaceae)梧桐属(Firmiana)，落叶乔木，高可达15米左右，中国特有种，主要分布于云南中部、南部和四川西昌、攀枝花等地区海拔1600～3000米的山地或坡地。云南梧桐为阳性树种，枝叶茂盛，树冠伞状，树形优美，具有较高的观赏价值，同时对多种有毒气体有较强的抗性，可用于园林绿化或植作行道树；又因其野生居群多分布于金沙江干热河谷土壤贫瘠的悬崖峭壁上，具有较强的耐旱性，因此可开发、驯化作为中国干热河谷绿化造林的先锋树种；云南梧桐种子可食用、入药、榨油；树皮可制绳索；木材常用于制作箱匣、乐器等。

1984年公布的“第一批中国珍稀濒危保护植物名录”中，就将其定为国家二级重点保护植物。2017年被列入《中国高等植物受威胁物种名录》濒危[EN]种类。云南梧桐野生居群分布极其稀少，一度被认为已经灭绝，2004年，四川省攀枝花苏铁国家级自然保护区发现了一个200余株的小居群；2017年在云南省宁蒗县、元谋县金沙江流域发现两个野生居群，但均分布于悬崖峭壁的薄壤之上。

造成云南梧桐濒危的主要原因有：采食种子导致其野外自然更新受阻；放牧、开荒等人为活动严重破坏了居群的生态群落结构；加之全球气候变化的干扰等因素使得野外分布区域狭窄，居群自然更新复壮缓慢。尤其是干热河谷地区，自然环境恶劣，云南梧桐自然更新能力更低。

目前，生物技术中的组培快繁已成为中药材、花卉、濒危物种、经济林果等种苗生产的重要手段。迄今为止，现有技术没有关于云南梧桐组培快繁和相关的生物技术方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种云南梧桐组培快繁方法，能成功繁殖出云南梧桐植株，解决云南梧桐在野外分布区域狭窄，种群退化严重的问题。

本发明提供了一种云南梧桐组培快繁的方法，包括以下步骤：

1)将消毒的云南梧桐幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；

所述诱导与分化培养基为包含0.1～2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0.1～1.2mg/L6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～1.0mg/L IBA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到云南梧桐植株。

优选的，所述诱导与分化培养基为包含1.0mg/L6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

优选的，所述增殖与继代培养基为包含0.8mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

优选的，所述壮苗与生根培养基为包含0.3mg/L IBA、0.3mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

优选的，所述诱导分化培养、增殖继代培养或壮苗生根培养的条件如下：温度为23～30℃；培养周期为60d；

在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux。

优选的，步骤1)中所述消毒前先用洗涤液浸泡，经流水冲洗干净后进行外植体消毒；

所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒10～15s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡8min，无菌水清洗3～5次。

优选的，在所述瓶苗移栽前，包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。

优选的，移栽基质预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。

优选的，所述大棚的温度为20～30℃，空气湿度为80％～85％，基质湿度为40％～50％。

优选的，所述移栽基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；

在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。

本发明提供了一种云南梧桐组培快繁的方法，具有以下有益效果：

1)本发明建立了有效的云南梧桐组培快繁方法，解决了其分布狭窄、种群退化严重等问题，填补了云南梧桐在生物技术上的研发空白。

2)本发明通过云南梧桐组培快繁方法，成苗容易，繁殖步骤简化，有效繁殖速率高，为保存和扩大云南梧桐种群，意义重大。

3)本发明通过云南梧桐组培快繁方法，高度保持了云南梧桐的遗传稳定性和一致性，为云南梧桐全面的开发和持续利用奠定了基础。

4)本发明的云南梧桐组培快繁方法繁育的云南梧桐，60天诱导分化率78％，在60天内增殖系数为3，生根率为91％，移栽成活率为95％，极大地提高了云南梧桐的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。

附图说明

图1为云南梧桐繁殖情况；

图2为云南梧桐生根情况。

具体实施方式

本发明提供了一种云南梧桐组培快繁的方法，包括以下步骤：

1)将消毒的云南梧桐幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；

所述诱导与分化培养基为包含0.1～2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0.1～1.2mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～1.0mg/L IBA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到云南梧桐植株。

本发明将消毒的云南梧桐幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；所述诱导与分化培养基为包含0.1～2.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。

在本发明中，所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒10～15s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡8min，无菌水清洗3～5次。所述消毒前先用洗涤液浸泡，以去除污物，经流水冲洗干净后进行外植体消毒。本发明对所述洗涤液的种类不做特殊限制，采用本领域所熟知的洗涤液即可，例如肥皂水溶液或洗洁精溶液等。所述浸泡的时间优选为10～12min。

在本发明中，所述诱导与分化培养基优选为包含0.1～1.0mg/L 6-BA、0.5mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，更优选为包含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述诱导分化培养的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为25～28℃，最优选为25℃；培养周期为58～62d，更优选为60d；在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。本发明以顶芽或侧芽为材料进行诱导分化培养，在所述诱导与分化培养基上培养后，诱导一周后，顶芽或侧芽开始萌发，经过一个培养周期得到萌发的节芽。实验证明，与不同含量的生长调节剂制备的培养基相比，所述诱导与分化培养基诱导分化培养效果好，诱导率达78％以上。所述接种优选将一个带节小茎段接种至一个培养瓶中。

得到萌发的节芽后，本发明将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0.1～1.2mg/L 6-BA、0.5mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。

在本发明中，所述增殖与继代培养基优选为包含0.1～0.8mg/L 6-BA、0.5mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，更优选为包含0.8mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述增殖继代培养的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为24～28℃，最优选为25℃；培养周期为58～62d，更优选为60d。在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。实验表明，与其他浓度的细胞分裂素和生长素制备的培养基相比，在所述增殖与继代培养基上增殖继代培养，生长速度最快，植株叶片伸展，培养60天后株高5.1cm，增殖系数为3，显著高于其他组。

得到增殖继代材料后，本发明将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～1.0mg/LIBA、0.1～1.0mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。

在本发明中，所述壮苗与生根培养基优选为包含0.3～0.8mg/L IBA、0.3～0.8mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，更优选为包含0.3mg/L IBA、0.3mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述壮苗生根培养的条件的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为24～28℃，最优选为25℃；培养周期为28～32d，更优选为30d。在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。实验表明，与其他浓度IBA和IAA相比，经所述壮苗与生根培养基进行壮苗生根30天，具有显著优势，生根率达91％。

得到壮苗生根材料后，本发明将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到云南梧桐植株。

在本发明中，在所述瓶苗移栽前，优选包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。移栽基质优选预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。所述大棚的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；空气湿度优选为80～85％，更优选85％；土壤湿度优选为40％～50％，更优选50％。

在本发明中，所述瓶苗移栽的基质优选为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。30天后移栽成活率达到95％。

本发明提供的一种云南梧桐组培快繁的方法，极大地提高了云南梧桐的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。

下面结合实施例对本发明提供的一种云南梧桐组培快繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

诱导与分化培养基筛选方法

取云南梧桐的幼嫩顶芽和侧芽为外植体，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，剪成带单个节的茎段，用75％的酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％升汞溶液进行表面消毒8min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的云南梧桐诱导培养基中，每瓶1个节。

将消毒处理后的茎段分别接种在MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L IAA培养基上，同时培养基还包括蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH值5.8。每天光照时间10小时，光照强度为1500Lux，温度为26±3℃，培养周期为60d，得到节芽。统计诱导率情况如下表1。

表1云南梧桐茎段诱导培养基筛选

对云南梧桐茎段诱导培养基进行筛选，结果表明，MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA培养基诱导效果最佳，诱导率达到78％。

实施例2

将实施例1中得到的节芽接种至增殖与继代培养基上，以含蔗糖30g/L+琼脂5g/L的MS培养基为增殖与继代激素筛选的基本培养基，细胞分裂素均为6-BA，浓度范围为0.1mg/L，0.2mg/L，0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L，1.2mg/L(6个浓度梯度)，生长素IAA，浓度均为0.5mg/L，采用均匀设计法进行。每天光照时间10小时，光照强度为1500Lux，温度为26±3℃，培养周期为60d，得到繁殖苗。

结果见表2。

表2增殖与继代培养基激素筛选

由表2可知，MS培养基+0.8mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，培养周期60天，光照强度为1500Lux，温度为23～30℃。芽节数量(包含顶芽)3.0，增殖系数3，植株叶片伸展，生长速度最快，得到株高5.1cm，茎粗2mm的繁殖苗。

实施例3

将实施例2制备的增殖苗接种至壮苗与生根培养基上，壮苗与生根培养基是以含蔗糖30g/L+琼脂5g/L的MS培养基为基础，IAA的浓度范围为0.1mg/L，0.2mg/L，0.3mg/L，0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L(6个浓度梯度)，IBA的浓度范围为0.1mg/L，0.2mg/L，0.3mg/L，0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L。每天光照时间10小时，光照强度为1500Lux，温度为26℃，培养周期为60d，得到生根苗。统计生根率。

结果见表3。

表3壮苗与生根培养基激素筛选结果

由表3可知，MS培养基+0.3mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.3mg/L IAA(吲哚乙酸)+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH值5.8，培养周期30天，生根率达91％。

实施例4

将实施例3制备的生根苗接种至栽培基质上，筛选基质为生红土、珍珠岩、腐殖土或其结合。将所述基质用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。开瓶轻轻取出生根苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为23～30℃，遮光度在80％，空气湿度82.5±2.5％，基质湿度45％±5％，培养30d，统计成活率。

结果见表4。

表4栽培基质的筛选实验结果

由表4可知，实验④中三种基质配合，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供足够的营养，同时红土为土层深部土壤，带菌量较少，有利于无菌苗的生长。60天后移栽成活率达到95％。

实施例5

一种云南梧桐组培快繁的方法

取云南梧桐的幼嫩顶芽为外植体，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，去叶，剪成长度1cm大小的带节小茎段，用75％的酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍后，再用0.1％升汞溶液消毒8min，无菌水清洗5次，得到消毒后的带节小茎段。

将消毒后的带节小茎段接种于准备好的诱导与分化培养基中进行诱导分化培养，每瓶插1个节芽；诱导与分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，每天光照10小时，光照强度为1500Lux，温度为25±5℃，诱导一周后，顶芽开始萌发，诱导60d，得到萌发的芽节(见图1)。诱导率达到78％。

将萌发的芽节接种至增殖与继代培养基上进行增殖继代培养，增殖与继代培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，温度为25±5℃，每天光照10小时，光强度为1500Lux，培养60天，得到增殖继代材料，增殖系数为3，植株高度5.1cm。

将制备的增殖继代材料接种至壮苗与生根培养基上进行壮苗生根培养，壮苗与生根培养基为MS+0.3mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.3mg/L IAA(吲哚乙酸)+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，培养期间每天光照10h，光照强度为1500Lux，温度为23～30℃，培养周期30天，得到云南梧桐生根瓶苗。统计生根率为91％。

将培养30天后的云南梧桐生根瓶苗先移至遮光率为80％大棚炼苗一周，基质为珍珠岩：腐殖土：生红土为1：1：2(体积比)的混合物，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8，开瓶轻轻取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为25±5℃，遮光度在80％，空气湿度82.5％±2.5％，基质湿度45％±5％。经统计移栽30天后，云南梧桐植株成活率为95％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种云南梧桐组培快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将消毒的云南梧桐幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；

所述诱导与分化培养基为包含0.1～1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0.1～1.2mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；

3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～1.0mg/L IBA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.7～5.9；

4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到云南梧桐植株。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导与分化培养基为包含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述增殖与继代培养基为包含0.8mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述壮苗与生根培养基为包含0.3mg/L IBA、0.3mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导分化培养、增殖继代培养或壮苗生根培养的条件如下：温度为23～30℃；培养周期为60d；

在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux。

6.根据权利要求1～5任意一项所述方法，其特征在于，步骤1) 中所述消毒前先用洗涤液浸泡，经流水冲洗干净后进行外植体消毒；

所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒10～15s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡8min，无菌水清洗3～5次。

7.根据权利要求1～5任意一项所述方法，其特征在于，在所述瓶苗移栽前，包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，移栽基质预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH值至5.8。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述大棚的温度为20～30℃，空气湿度为80％～85％，基质湿度为40％～50％。

10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述移栽基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；

在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。

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