CN115812600B - 一种陀螺果离体快繁技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种陀螺果离体快繁技术方法，包括以下步骤：（1）外植体取材：早春3‑4月，选取健壮，无病虫害的母株，切取新发的幼嫩茎段作为外植体；（2）消毒灭菌；（3）启动培养：将消毒灭菌后的茎段切分为含有1‑2个节的小茎段，将其启动培养；（4）增殖培养：初代培养50d后，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽进行增殖培养；（5）生根培养：继代培养50d后取无根试管苗，接入生根培养基进行生根培养；（6）炼苗移栽。本发明首次构建了高效的陀螺果离体快繁技术，该技术条件下，试管苗增殖率4.7、生根率87.23%、移栽成活率88.33%，这将为陀螺果产业化推广提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养技术，具体涉及一种陀螺果离体快繁技术方法。
背景技术
陀螺果（Melliodendron xylocarpum），又名水冬瓜、冬瓜木、鸦头梨等，是安息香科陀螺果属、中国特有的落叶乔木，主要分布于我国西南与华南各省份的南岭山区，生存在相对狭小的区域。研究表明陀螺果的天然更新能力差，在生境逐渐遭到破坏的情况下，已经处于濒危的状态。
陀螺果树形美丽，树干通直，先花后叶，早春开花，盛开时繁花如雪是极佳的庭院观赏树和行道树；其果实含油量极高，种子富含油脂，主要产油部位为种仁，含油量高达约50%且可食用，种子内还含有大量多种化合物（如皂苷）；陀螺果木材黄白色且木材结构均匀质地紧密，是良好的用材树种，可制作家具工具；此外，陀螺果的枝叶苦、微寒，具有清热和杀虫功效，内含成分对预防皮肤衰老具有较好的药用价值。综上所述，陀螺果是一种集观赏、油用、材用和药用于一体的经济树种，具备极佳的开发利用价值。如何实现快速大量繁殖是陀螺果资源开发利用面临的重要问题，目前该树种主要是采用传统的播种和扦插繁殖。
陀螺果种子具有高度木质化的厚实果皮，且种子具有休眠特性，这严重阻碍了陀螺果种子的萌发。为了解决以上问题，前人研究主要从种子机械处理、休眠解除以及播种条件控制这三个方面进行播种技术的探索：（1）陀螺果的内、外果皮皆含有萌发抑制物，将种子剥离果实后再播种可以将种子萌发率提高约20%，且萌发时间提前约2周；（2）低温沙藏和赤霉素处理作为常用的打破种子休眠的技术措施，其对陀螺果种子萌发无显著促进作用；（3）播种基质和时间对于种子萌发皆存在显著影响，以土壤作为基质播种基质（萌发率58.7%）显著优于沙子（萌发率1.3%），且2-3月份播种效果最佳，种子萌发率可达62.3%。
扦插是植物快速繁殖的重要方法，前人研究主要从插穗类型、插穗处理、生长调节剂处理以及扦插基质这四个方面进行陀螺果扦插技术的探索：（1）插穗类型对生根效果具有显著影响，嫩枝扦插的生根效果（生根率75%）显著优于硬枝扦插（生根率46%）；（2）插穗剪叶处理对硬质扦插效果没有显著影响，但对嫩枝扦插生根率具有一定的促进作用，但生根时间较未剪叶处理更晚；（3）适宜的植物生长调节剂处理对扦插生根具有显著的促进作用，最佳处理为1000mg/L的IAA+IBA+NAA（1：1：1）处理30min；（4）前人比较了珍珠岩和土壤的扦插效果，发现与土壤相比，珍珠岩扦插生根率更高约为25.9%。
综上可见，传统的播种和扦插繁殖效率低、周期长，这不仅限制了陀螺果资源的开发利用，更是导致其野生资源濒危的根本原因。离体快繁是实现植物快速大量繁殖的重要技术手段，但目前陀螺果的离体快繁技术研究研究仍处于空白。
同时现有技术中还存在以下缺点：（1）传统繁殖操作受季节限制：陀螺果最佳播种时间为2-3月份，最佳扦插时间为春秋季，无法实现周年生产；（2）播种和扦插繁殖周期长：陀螺果种子从播种到萌发大约需2个月，再从幼苗到成年植株大约需2-3年；扦插生根速度较慢，大约需3个月；（3）播种和扦插繁殖率低：陀螺果种子存在休眠特性，萌发速度慢，萌发率较低（最高仅为58.7%）；扦插需消耗大量的插穗，且生根率较低（最高仅为75%）。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种陀螺果离体快繁方法，为实现陀螺果的快速大量繁殖提供技术支撑。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种陀螺果离体快繁方法，包括以下步骤：
（1）外植体取材：早春3-4月，选取健壮，无病虫害的母株，切取新发的幼嫩茎段作为外植体；
（2）消毒灭菌：将茎段用流水冲洗30-60min，然后洗涤剂浸泡15-20min，再用流水冲洗20-30min；随后，将材料转至超净工作台用75%酒精灭菌25-35s，然后用3-5%次氯酸钠灭菌10min-15min，最后无菌水冲洗3-4次作为接种材料；
（3）启动培养：将消毒灭菌后的茎段切分为含有1-2个节的小茎段，将其启动培养；
（4）增殖培养：初代培养50d后，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽进行增殖培养；
（5）生根培养：继代培养50d后取无根试管苗，接入生根培养基进行生根培养；
（6）炼苗移栽：将生根的陀螺果试管苗在20000 lx强光下炼苗5天后，移栽入混合基质，浇水定根；于驯化室内培养，培养温度25±1℃，光照条件1800lx，光周期14h光照/10h黑暗，空气湿度60士10%。
优选地，启动培养的培养基包含：培养基WPM + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9。
优选地，增殖培养的培养基包含：培养基为WPM + 1.0-1.5 mg/L BA +30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9。
优选地，生根培养的培养基包含：培养基为WPM + 1.0-2.0 mg/L IAA +30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9。
优选地，启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：培养温度25±1℃，光照条件1800lx，光周期14h光照/10h黑暗。
优选地，混合基质为：泥炭:蛭石:珍珠岩=1:1:1（v/v/v）。
本发明的有益效果：
（1）首次构建了高效的陀螺果离体快繁技术，该技术条件下，试管苗增殖率4.7、生根率87.23%、移栽成活率88.33%，这将为陀螺果产业化推广提供技术支撑。
（2）与陀螺果的传统繁殖方法（播种、扦插）相比，该技术属于试管内无菌培养，繁殖过程不受时间限制，能够实现周年生产。
附图说明
图1为陀螺果离体快繁技术；A. 灭菌后的陀螺果外植体；B. 启动培养50天后的陀螺果外植体；C.增殖培养50天后的陀螺果试管苗；D.生根的陀螺果试管苗；E.陀螺果试管苗移栽；F.陀螺果试管苗移栽30天后新叶萌发。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
（1）试验材料
于2020年4月初，自南京林业大学树木园采集陀螺果新发幼嫩枝。将嫩枝切除叶片后置于广口瓶中，用纱布包好瓶口，于自来水冲洗1h，加入洗洁精溶液浸泡20min，再流水冲洗20min，吸干水分放置于超净工作台，先用75%酒精消毒25s左右，3-5%NaClO溶液处理10-15min，最后无菌水冲洗3次后，将嫩枝切分为含1-2个节的小茎段作为试验材料。
（2）试验方法
1）启动培养
将消毒灭菌后的茎段接种于WPM培养基，附加1.0 mg/L BA、0.2 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6.8 g/L琼脂，pH 5.9。培养温度25±1℃，光周期14h·d-1，光强1800lx（后续培养无特殊说明，培养条件同此）。启动培养50d后，统计外植体的真菌污染率、细菌污染率、增殖率、叶片数、茎长和株高。
2）增殖培养
以启动培养获得的丛生芽为材料，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽接入WPM增殖培养基，附加30 g/L蔗糖、6.8 g/L琼脂，pH 5.9，并设置植物生长调节剂处理：BA、meta-Topolin（mT）单独处理，浓度0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L；/>1.0 mg/L BA、mT分别与不同浓度NAA结合处理，NAA浓度0.1、0.3、0.5mg/L。培养温度25±1℃，光周期14h·d-1，光强1800lx。每个处理设3次重复，每个重复15株。增殖培养50d后，统计增殖率（增殖后芽数/原芽数）、茎长、株高、叶片数和芽的质量等级。
3）生根培养
以增殖培养获得的丛生芽为材料，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽接入WPM生根培养基，附加30 g/L蔗糖、6.8 g/L琼脂，pH 5.9，并设置不同浓度IBA、IAA、NAA处理，浓度0，0.5，1.0，2.0，3.0 mg/L。每个处理设3次重复，每个重复15株。生根培养35d后，观察统计各处理的生根率和生根状况。
4）炼苗移栽
将不同生长素处理获得的生根苗在强光（20000 lx）下炼苗5天后，分别移栽入混合基质，即泥炭:蛭石:珍珠岩=1:1:1（v/v/v）中，浇水定根。将移栽苗置于驯化室内培养，培养温度25±1℃，光周期14h·d-1，光照条件1800lx，空气湿度60士10%。移栽30天后，统计移栽成活率、叶片数、株高和茎长。
（3）结果与分析
1）启动培养
启动培养50天后，对试管苗的真菌污染率、细菌污染率、增殖率、叶片数、茎长和株高进行统计。本研究中陀螺果的试管苗真菌污染率32.85%、细菌污染率8.57%、平均增殖率4.60、单株叶片数8.11、平均茎长4.50cm、平均株高5.51cm。
）植物生长调节剂对试管苗增殖的影响
将初代培养50d后获得的健壮腋芽（茎长≥1.0cm）接入增殖培养基，发现植物生长调节剂对试管苗的增殖和生长存在显著影响（表1）。BA单独使用时，增殖率随BA浓度的增加呈先上升后下降趋势，其中1.0-1.5mg/L BA处理的增殖率高达4.47-4.80，试管苗生长状况良好，且子代腋芽质量最佳（+++）。1.0mg/L BA与不同浓度NAA结合使用时，虽然各处理的增殖率与1.0mg/LBA处理无显著差异，但试管苗基部形成大量愈伤组织、且子代腋芽质量较差（++）。/> mT单独使用时，增殖率随mT浓度的增加呈逐渐上升趋势，其中1.5-2.0mg/LmT处理的增殖率高达4.44-4.57，与1.0-1.5mg/L BA处理无显著差异，但试管苗基部形成大量愈伤组织、且子代腋芽质量较差（++）。此外，1.0mg/LmT与NAA结合使用效果不佳，各处理的增殖率显著低于1.0mg/LmT单独处理。
因此，综合考虑增殖率、单株叶片数、平均茎长株高、基部愈伤组织和芽质量这六个因素，陀螺果增殖的最佳处理为1.0-1.5mg/L BA，该处理条件下试管苗增殖率为4.53-4.70、单株叶片数6.17-6.72、平均茎长3.86-4.19cm、平均株高4.42-4.75cm，且试管苗基部愈伤组织较少（等级2），子代腋芽质量最佳（+++）。
表1 植物生长调节剂对陀螺果试管苗增殖和生长的影响
注：表中数据为均值±标准差，同列不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著。1.愈伤组织极少；2.基部膨大，有少数愈伤组织出现；3.基部严重愈伤化。+++，茎深绿、粗壮，叶片伸展；++，茎中绿、健壮，叶片细长；+，茎浅绿、细弱，叶片细小。
）生长素对陀螺果试管苗生根和移栽的影响
植物生长调节剂处理对试管苗生根存在显著影响，NAA和IBA处理的试管苗生根效果优于IAA处理，而对照组生根率极低（5.55%）（表2）。NAA处理试管苗生根率随着处理浓度的升高呈下降趋势，0.5mg/L NAA处理的生根率高达100.00%，且基部愈伤组织较少，发根点数量在5之上。IBA处理处理试管苗生根率呈先上升后下降趋势，1.0-2.0mg/L IBA处理试管苗生根率最高（97.23%-100.00%），且基部愈伤组织较少，发根点数量在5之上。与NAA和IBA相比，IAA处理整体生根率较低，0.5-2.0 mg/L IAA处理间生根率无显著差异（86.03%-87.23%），后续随着浓度增加试管苗生根率显著下降。
将生根的陀螺果试管苗进行移栽，研究发现生根阶段的生长素处理对试管苗后续移栽成活具有显著影响（表3）。移栽后30天后，对照与IBA处理移栽后的幼苗大量死亡，IAA与NAA处理的幼苗移栽成活率较好，分别为88.33%、73.33%，但不同处理的陀螺果幼苗整体的叶片数、茎长与株高无显著差异。
为了筛选最佳处理，本研究基于生根率和移栽成活率计算得到不同生长素处理的成苗率，研究发现成苗率大小为1.0-2.0 mg/L IAA＞0.5 mg/L IAA＞2.0 mg/L IBA＞对照（表3）。因此，1.0-2.0mg/L IAA为陀螺果试管苗的最佳生根处理，其生根率为87.23%，移栽成活率为88.33%，成苗率为77.05%。
表2 生长素处理对陀螺果试管苗生根的影响
注：表中数据为均值±标准差，同列不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著。1.愈伤组织极少；2.基部膨大，有少数愈伤组织出现；3.基部严重愈伤化。+++，发根点达5及以上，幼根突出明显；++，发根点在2至4之间、幼根稍突出；+，发根点不、幼根基本不突出。
表3 生根阶段生长素处理对试管苗后续移栽的影响
注： 表中数据为均值±标准差，同列不同小写字母表示在P≤0.05水平上差异显著；成苗率=最佳生根率×移栽成活率。
Claims (1)
1.一种陀螺果离体快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体取材：早春3-4月，选取健壮，无病虫害的母株，切取新发的幼嫩茎段作为外植体；
（2）消毒灭菌：将茎段用流水冲洗30-60min，然后洗涤剂浸泡15-20min，再用流水冲洗20-30min；随后，将材料转至超净工作台用75%酒精灭菌25-35s，然后用3-5%次氯酸钠灭菌10min-15min，最后无菌水冲洗3-4次作为接种材料；
（3）启动培养：将消毒灭菌后的茎段切分为含有1-2个节的小茎段，将其启动培养，启动培养的培养基为WPM + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9；
（4）增殖培养：初代培养50d后，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽进行增殖培养，增殖培养的培养基为WPM + 1.0-1.5 mg/L BA +30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9；
（5）生根培养：继代培养50d后取无根试管苗，接入生根培养基进行生根培养，生根培养的培养基为WPM + 1.0-2.0 mg/L IAA +30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.9；
（6）炼苗移栽：将生根的陀螺果试管苗在20000 lx强光下炼苗5天后，移栽入混合基质，混合基质为：泥炭:蛭石:珍珠岩体积比1:1:1，浇水定根；于驯化室内培养，培养温度25±1℃，光照条件1800lx，光周期14h光照/10h黑暗，空气湿度60士10%；
启动培养、增殖培养、生根培养的条件均为：培养温度25±1℃，光照条件1800lx，光周期14h光照/10h黑暗。
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