CN113331055A

CN113331055A - 一种无刺花椒组培苗的切割方法

Info

Publication number: CN113331055A
Application number: CN202110603511.2A
Authority: CN
Inventors: 陈泽雄; 唐宁; 娄娟; 许锋; 刘霞
Original assignee: Yangtze University; Chongqing University of Arts and Sciences
Current assignee: Yangtze University; Chongqing University of Arts and Sciences
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-09-03
Also published as: NL2027681A; CN111280056A; NL2027681B1; WO2021174933A1

Abstract

本发明公开了一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，属于经济作物无性繁殖技术领域。本发明提供了一种无刺花椒组培苗的切割方法，包括以下步骤：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段。本发明利用特殊的切割工艺，大大减少继代增殖培养的代数，从而达到快速繁殖无刺花椒树苗的目的，在无刺花椒繁育生产中具有极大的实用价值。

Description

一种无刺花椒组培苗的切割方法

本申请是申请号为“202010136322.4”、发明名称为“一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法”、申请日为2020.03.02的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于经济作物无性繁殖技术领域，具体涉及一种无刺花椒组培苗的切割方法。

背景技术

花椒是芸香科花椒属(Zanthoxylum Linn.)的一种香料植物，在我国有悠久的栽培历史，既是香料植物也是传统的药用植物，栽培花椒兼具很高的经济价值和水土保持效益。花椒在我国分布于黄河、长江、珠江流域各省及云南、贵州和西藏等地，按照商品类型可区分为北方红花椒、南方青花椒及产于山东的香花椒。

我国现已栽种花椒约200万hm²，年总产值约600亿元，花椒已成为支撑我国5000多万山区农民经济来源的支柱型经济树种。然而，由于花椒树干、枝、叶具刺，导致采收困难、成本极高。2011年花椒的采收成本约占销售收入的1/2～2/3，全国200万hm²花椒的年采收成本达300～400亿元。因此，花椒采收难已是花椒生产中亟待解决的关键问题，若能以无刺花椒品种替代有刺花椒，将会大幅度的提高采收效率、节约采收成本。

20世纪50年代以来，我国先后进行花椒品种改良，并断断续续进行了无刺花椒品种发掘和培育研究。20世纪80年代初，我国从日本引进了“日本无刺花椒”，试栽于河北、河南等地，1994年日本在四川实施援助项目时也将其引入四川，2010年又自河北引入陕西凤县；由于“日本无刺花椒”与我国的花椒有本质的不同，其麻香味不足、产量不高、果面腺点深陷口状、抗寒性弱，我国南方的青花椒、北方的红花椒麻香味浓烈、高产、果面腺点泡状鼓出，因而一直未能在我国花椒生产中推广栽培。

目前，无刺花椒树的繁育方法主要为嫁接繁殖，但是嫁接周期比较长，受外界环境条件和病虫害影响大，使得嫁接无刺花椒的苗木质量差、成活率低，从而影响了花椒的质量和产量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法。以解决无刺花椒采用嫁接繁殖的成活率低和产量低的问题。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，包括以下步骤：

S1、初代培养：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天，再置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；

S2、切割：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段；

S3、第二代培养：将S2中切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天后，及时置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；

所述初代培养和第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)为0.1mg·L^-1、卡拉胶为6.0g·L^-1、蔗糖为30g·L^-1和植物组培抗菌剂为(PPM)0.1％；

S4、重复S2和S3步骤进行继代增殖培养，直至培养基中PPM用量为0时结束，且继代增殖培养代数不少于4代；

所述继代增殖培养的培养基成分组成为：MS基础培养基、ZT为1.0～2.0mg·L^-1、NAA为0.1mg·L^-1、卡拉胶为6.0g·L^-1、蔗糖30g·L^-1和PPM为0～0.05％；

所述继代增殖培养代数每增加1～2次，PPM用量降低0.01％。

其中，无刺花椒萌芽茎段材料为无刺花椒树苗上切取的2～3cm的茎段，在培养基中培养30～40d后生长出的萌芽茎段。

无刺花椒萌芽茎段在培养过程中，开始采用黑暗条件培养的目的之一为避免新切割的茎段切口处发生褐变，且黑暗条件培养有利于茎段芽的生长，目的之二为防止新切割的茎段生长过快和老化，目的之三为无刺花椒本体是从有刺花椒嫁接而成，在黑暗条件培养可防止茎段生长出带刺腋芽。经过一段时间的黑暗条件培养之后，逐渐增加光照培养强度，使得茎段逐渐适应光照的条件，当茎段适应外界条件之后，再置于更强的光照条件下，使得茎段快速生长和老化。

优选的，所述S4中，第三代培养和第四代培养的培养基成分中ZT用量均为2.0mg·L^-1。

优选的，所述S4中，继代增殖培养代数超过4代后，培养基成分中ZT用量需根据增殖的腋芽茎段节间长度和腋芽数量进行调整，当腋芽茎段密集且腋芽丛生时，ZT用量为1.0～1.25mg·L^-1，当腋芽茎段节间长且腋芽萌发较少时，ZT用量为1.25～1.5mg·L^-1。

优选的，所述S4中，继代增殖培养过程中，PPM用量随着继代次数的增加每次减少0.01％。

其中，继代增殖培养3～4代后，增殖的腋芽茎段逐渐适应了离体环境，同时体内的内生真菌已经得到了抑制，体内激素水平逐渐积累，此时需要根据情况适当调整继代增殖培养基成分组成，在原来MS基本培养基的基础上，随着继代增殖次数的不断增加，逐渐降低细胞分裂数和生长素的比例，同时逐渐减少PPM的用量，直至到0。

优选的，所述S2中，无刺花椒苗在切割过程中，顶芽切成1～2cm长，带2～4片叶的茎段。

优选的，所述S2中，无刺花椒苗在切割过程中，除靠近培养基水渍状、黄花的老叶片需切除外，其余所有叶片均需保留。

其中，切割工艺是无刺花椒能否高效继代增殖的关键因素之一。同样的材料，采用不同的切割方法，后续的增殖差异很大。因此，无刺花椒继代增殖的切割工艺重点包括以下四点：1)将待切割的材料置于超净工作台上的无菌接种盘中，首先用灭菌好的工具将茎段基部(插入培养基的一端)的老组织切除，露出新鲜的组织；2)按照腋芽微型增殖的方式进行切割。即是将3～4cm的茎段材料切成带1～3片叶的茎段，具体根据茎段腋芽的萌发情况而定。若茎段节间较长，且腋芽萌发较好，则可切割成1叶1芽的茎段；若茎段节间较紧密，且腋芽萌发不够长，则可选择切成2～3片的茎段；3)茎段顶芽一般切成1～2cm长，带2～4片叶的茎段；4)除靠近培养基水渍状、黄花的老叶片需要切除外，其余所有叶片均需要完整保留下来。

在切割过程中，如果不切除无刺花椒萌芽茎段的基部以及靠近培养基水渍状、黄花的老叶片，会造成茎段继代增殖培养过程中基部和老叶吸收营养，使得新茎段增殖缓慢，同时还会造成部分生长弱的茎段枯萎。

优选的，在整个继代增殖培养期间，每天的光照培养时间为10h，温度为23～27℃。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，采用先黑暗培养再逐渐增强光照强度，可使组培苗内部的激素逐渐趋于稳定，采用特殊的切割工艺，可大大减少继代增殖培养的代数，从而达到快速繁殖无刺花椒树苗的目的；

2)本发明的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，通过对培养条件的优化，根据继代培养的次数适当调整培养基成分组成，以及特殊切割工艺等因素的综合研究，建立了无刺花椒组培种苗继代培养的技术体系，使得无刺花椒初代培养的茎段快速稳定的实现继代增殖，从而在短时间内实现大规模的繁育，在无刺花椒繁育生产中具有极大的实用价值；

3)本发明的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，不受外界病虫害的影响，繁育方法简单，快捷，同时还可节约无刺花椒因嫁接带来的人力和物力的成本，苗的质量和数量能得到有效的保证，在后续种植和花椒结果过程中可大大提高花椒的产量。

附图说明

图1为本实施例1中经过初代培养后的无刺花椒苗图；

图2为本实施例1中经过切割后的茎段图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

一种无刺花椒组培苗的继代繁育方法，包括以下步骤：

S1、初代培养：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养8～9天，再置于光照强1000lux条件下培养7～8天，然后将光照强度增加至2000lux培养13～14天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个，培养成的无刺花椒萌芽茎段苗如图1所示；

S2、切割：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后将顶芽切成1～2cm长，带2～4片叶的茎段，剩余切成1～3片叶茎段，如图2所示；

S3、第二代培养：将S2中切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养8～9天后，及时置于光照强度为1000lux条件下培养7～8天，然后将光照强度增加至2000lux培养13～14天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；

其中，初代培养和第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、ZT用量为2.0mg·L^-1、NAA用量为0.1mg·L^-1、卡拉胶用量为6.0g·L^-1、蔗糖用量为30g·L^-1和PPM用量为0.1％；

S4、重复S2和S3步骤进行继代增殖培养，继代增殖培养的培养基成分组成为：MS基础培养基，ZT用量在第三代和第四代培养基中均为2.0mg·L^-1，在第五代至第七代中均为1.20mg·L^-1，NAA用量为0.1mg·L^-1、卡拉胶用量为6.0g·L^-1、蔗糖用量为30g·L^-1和PPM为0～0.05％，继代增殖培养第三代培养基中PPM用量为0.05％，后续每增加1次，PPM用量降低0.01％，最后继代增殖培养代数为七代；

整个增殖培养期间，每天的光照培养时间为10h，温度为23～25℃。

通过本实施例繁育方法，最后培养得到的无刺花椒苗，整个过程需要30～40天时间，移栽后的成活率达95％以上。

生根培养：

(1)切取继代增殖获得的芽苗接种到生根培养基中，芽苗高≥2.0cm、茎粗≥2.0mm，插入到培养基的深度为3.0～4.0mm；

(2)培养基配方：1/2MS+IBA0.5mg·L^-1+AC(活性炭)50mg·L^-1+卡拉胶6.0g·L^-1+蔗糖20g·L^-1；

(3)培养条件：接种后置于暗环境培养7d，后转移到光照环境中继续培养7-14d，光照培养时间为10h/d。整个生根培养过程中温度为23～25℃，光照强度为2000lux；

(4)培养14～21d后，选取根系数量≥2条，根长≥2.0cm，叶片正常的生根苗移栽。

驯化移栽：

(1)驯化：移栽前，先将无刺花椒瓶苗放置于遮光率为65％～80％的温室大棚中，松开培养瓶盖，常温炼苗10d左右，使生根苗叶片变浓，加厚。

(2)移栽：用清水冲洗干净炼苗完后的生根苗培养基，然后置于2000倍的多菌灵溶液中浸泡1～2min，栽种到事先准备好的基质穴盘中，移栽基质比例泥炭：珍珠岩(V:V＝7:3)，栽种好后浇灌定根水，薄膜覆盖保温保湿，置于温室大棚中培养，移栽培养过程中注意早晚通风，10d后用0.5％复合肥(N:P:K＝15:15:15)喷雾，每隔7d一次，15d左右后去薄膜，30～45d后即可出圃。

综上所述，本发明的无刺花椒组培苗的继代繁育方法，通过对优选培养条件，根据继代培养的次数适当调整培养基成分组成，以及特殊切割工艺等因素的综合研究，建立了无刺花椒组培种苗继代培养的技术体系，使得无刺花椒初代培养的茎段快速稳定的实现继代增殖，从而在短时间内实现大规模的繁育，在无刺花椒繁育生产中具有极大的实用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种无刺花椒组培苗的切割方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过初代培养的无刺花椒萌芽茎段置于超净工作台上的无菌接种盘中，用灭菌的工具将无刺花椒萌芽茎段的基部即浸入培养基的一端的组织切除，露出新鲜组织，然后切成1～3片叶茎段。

2.根据权利要求1所述的切割方法，其特征在于，所述无刺花椒萌芽茎段在切割过程中，顶芽切成1～2cm长，带2～4片叶的茎段。

3.根据权利要求1或2所述的切割方法，其特征在于，所述无刺花椒萌芽茎段在切割过程中，除靠近培养基水渍状、黄花的老叶片需切除外，其余所有叶片均需保留。

4.根据权利要求1所述的切割方法，其特征在于，所述初代培养，包括：将无刺花椒萌芽茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天，再置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至无刺花椒萌芽茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；所述初代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)为0.1mg·L^-1、卡拉胶为6.0g·L^-1、蔗糖为30g·L^-1和植物组培抗菌剂为(PPM)0.1％。

5.根据权利要求1或4所述的切割方法，其特征在于，所述继代增殖培养的方法，包括以下步骤：将经过初代培养且利用权利要求1～3任一项所述方法进行切割后的进行第二代培养：将切割好的茎段置于培养基中，并在黑暗环境中培养5～9天后，及时置于光照强度为900～1100lux条件下培养6～8天，然后将光照强度增加至1900～2100lux培养12～16天，直至茎段生长至高度3～4cm，3～4个节间，且腋芽萌发数量不少于2个；

所述第二代培养过程中的培养基成分组成为：MS基础培养基、玉米素(ZT)为2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)为0.1mg·L^-1、卡拉胶为6.0g·L^-1、蔗糖为30g·L^-1和植物组培抗菌剂为(PPM)0.1％；

重复切割和第二代培养进行继代增殖培养，直至培养基中PPM用量为0时结束，且继代增殖培养代数不少于4代；

所述继代增殖培养代数每增加1～2次，PPM用量降低0.01％。

6.根据权利要求5所述的切割方法，其特征在于，在重复切割和第二代培养时，第三代培养和第四代培养的培养基成分中ZT用量均为2.0mg·L^-1。

7.根据权利要求5所述的切割方法，其特征在于，所述继代增殖培养代数超过4代后，培养基成分中ZT用量需根据增殖的腋芽茎段节间长度和腋芽数量进行调整，当腋芽茎段密集且腋芽丛生时，ZT用量为1.0～1.25mg·L^-1，当腋芽茎段节间长且腋芽萌发较少时，ZT用量为1.25～1.5mg·L^-1。

8.根据权利要求5所述的切割方法，其特征在于，所述继代增殖培养过程中，PPM用量随着继代次数的增加每次减少0.01％。

9.根据权利要求5所述的切割方法，其特征在于，在整个继代增殖培养期间，每天的光照培养时间为10h，温度为23～27℃。