CN110214694B

CN110214694B - 浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法

Info

Publication number: CN110214694B
Application number: CN201910581808.6A
Authority: CN
Inventors: 姜维梅; 姚健; 何晨琪; 邱英雄; 雷祖培; 郑方东
Original assignee: Zhejiang Wuyanling National Nature Reserve Management Center; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang Wuyanling National Nature Reserve Management Center; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-30
Filing date: 2019-06-30
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-06-30
Also published as: CN110214694A

Abstract

本发明公开了一种浙江雪胆的组培快速繁殖方法，利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，还包括以下步骤：茎段的消毒、腋芽的启动培养、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养、生根培养、移栽。本发明成功实现了浙江雪胆雌、雄株的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量已知性别的试管苗，为该极小种群的恢复提供一条切实可行的繁殖方式，同时也为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

Description

浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法。

背景技术

植物是药物的天然宝库之一。植物产生的用于自身防御的一些化合物被人类开发利用来防病治病。由于生境的破坏和掠夺式的采挖，导致很多中药资源蕴含量下降，甚至耗竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦,2001)。植物组织培养技术在植物快速繁殖、保护和增强有用的次生代谢产物的水平和含量，以满足药物的需求并减少原位采收等方面拥有巨大的潜力(Bapat等，2008)。该技术在药用植物资源，特别是对濒危药用植物资源保护方面的应用，对中国有着特殊的意义，因为中国是世界上使用和出口药用植物原料最多的国家(高文远&肖培根，2008)。

雪胆属(Hemsleya)植物为葫芦科(Cucurbitaceae)多年生草质藤本植物。该属植物主产于亚洲的热带和亚热带地区，约27种，我国有25种，其中21种为我国特有(Flora ofChina Editorial Committee，2011)。

该属植物常以块茎入药，其主要成分是葫芦烷型化合物及其糖甙类和齐墩果烷型化合物及其糖甙类，具有抗菌、抗炎、溶血、抗癌等活性(聂瑞麟和陈宗莲，1986；白敏,等，2012)。其中葫芦烷型化合物如雪胆素(雪胆甲素、雪胆乙素)是重要的中药原料药，是生产雪胆素片、雪胆素胶囊的原料药，主要用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等症(曾祥飞等，2016；中国科学院中国植物志编辑委员会，1986；李德珠，1993)。随着雪胆复方制剂或粗提物广泛应用于临床，雪胆资源不断得到开发利用，野生资源遭到过度采挖，部分区域雪胆资源已濒危或完全绝种，因此开展人工驯化栽培，缓解资源紧缺势在必行(陈翠等，2016)。

浙江雪胆(H.zhejiangensis C.Z.Zheng)为郑朝宗1985年发表的雪胆属一新种(郑朝宗，1985)，分布于浙江泰顺乌岩岭、龙游等海拔800m以下的山谷灌丛和竹林下。浙江雪胆野生个体数量少，分布范围狭窄，由于其本身的生物学原因(雌雄异株、雌花先开，雄花后开)导致其自然条件下授粉困难、果实产生少、果实易腐烂、种子萌发困难等(王蒙蒙等，2008；雷祖培等，2010)，因此，2017年该物种被浙江省林业厅列为极小种群保护物种，因此迫切需要对浙江雪胆的野生资源进行复壮、迁地保护及建立组培快繁体系进行大面积人工栽培的研究。

传统上雪胆的繁殖主要通过块茎切块进行，由于块茎本身供应不足以及这种繁殖容易传播病菌，所以这种繁殖方式受到限制。地上茎的扦插繁殖一方面不容易成活，另一方面也很容易传播疾病(杨王伟，2014)。郭乔仪等(2016)的研究也表明大籽雪胆采用块茎分离繁殖、压蔓繁殖的繁殖率低，在实际生产中无实用价值。用种子进行繁殖，由于种子的休眠和不可预测的性别比是两个与种子繁殖有关的主要问题。雌雄异株植物，雄株在自然界中占主导地位，只有当植物开花时才能确定性别。由于雌株与结实相关，因此高比例的雌/雄比对于繁殖是极其重要的。

鉴于浙江雪胆传统繁殖方法的局限性，建立有效的繁殖体系是大规模人工栽培的前提，尤其是对雌雄异株的植物，繁殖尽可能多的雌性个体对于结实非常重要。前人关于浙江雪胆组培的研究表明：利用茎段的腋芽进行增殖或者先诱导愈伤组织，再诱导愈伤组织分化不定芽是两种有效的繁殖方式(王蒙蒙等，2009：雷祖培等，2011)。上述现有利用茎段的腋芽快速扩增，其培养基为MS+BA1mg/l+NAA0.02～0.05mg/l。另外一种茎段产生愈伤组织的培养基为MS+BA3mg/l+NAA 1mg/l，不定芽分化的培养基为MS+BA3mg/l+NAA0.5mg/l，生根培养基为MS+NAA1.0mg/l。浙江雪胆的叶片、叶柄容易诱导出愈伤组织，但愈伤组织容易呈现黄褐色，难以分化不定芽(杨王伟，2014)。上述研究为浙江雪胆种群规模的扩大提供了一定的基础。但发明人在研究中发现，前人报道的方法还存在一些不足，如浙江雪胆组培苗在MS培养基上容易黄化，并且上述研究都不知道植株的性别。因此，研究一种适合浙江雪胆雌、雄株既能快速增殖，同时又能克服植株黄化的培养基非常紧迫和必要。并且可以根据需要，有目的地繁殖雌、雄株，以便在野外回归时以适当的雌、雄比例种植，以增加结实率，这对于该极小种群的保护具有重大意义。

参考文献：

Bapat V A,Yadav SR,Dixit GB.Rescue of endangered plants throughbiotechnological applications[J].National Academy Science Letters,2008,31(7&8):201-211(Bapat V A,Yadav SR,Dixit GB.通过生物技术拯救濒危植物[J].国家科学院科学通讯,2008,31(7&8):201-211)；

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中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第73卷)第1册[M].北京：科学出版社,1986。

文中所提及的缩写字母见如下缩略词表：

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种浙江雪胆的组培快速繁殖方法，利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，依次进行以下步骤：

1)、取材：

于5～6月开花期，分别选择浙江雪胆的雌株和雄株的块茎进行种植，直至块茎上抽出新的茎段；

说明：于上述开花期，选择浙江雪胆的雌株和雄株，将地上部分的茎叶去除，取块茎进行种植；

2)、茎段的消毒：

当步骤1)所得的茎段为只带有1～2个节的短茎段时，直接取用该短茎段；

当步骤1)所得的茎段为带有＞2个节的长茎段时，将长茎段分割成带有1～2个节的短茎段；

将所述短茎段进行清洗和灭菌，得消毒后茎段；

3)、腋芽的启动培养：

将消毒后茎段按照形态学的上端朝上、下端朝下插入到启动培养基上，进行腋芽的诱导；

所述启动培养基为MS+BA 0.5～2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9～7.0g/L,pH 5.8～6.0；诱导培养条件为：于22～26℃进行光/暗交替培养；

当启动培养基上的茎段的腋芽萌发伸长至4～6cm时(一般为3～5个节)，结束启动培养；

4)、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增：

将步骤3)所得的腋芽切成带1～2个节的茎段，转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为改良MS+BA 0.5～1mg/l+NAA 0～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH为5.8～6.0；

增殖培养条件为：于22～26℃进行光/暗交替培养；

待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节(即，腋芽萌发伸长生长约为4～6cm)，且节上具有鸟足状复叶(每个复叶一般具有5～7个小叶)时，结束培养，得无菌苗；

5)、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养：

取步骤4)所得的鸟足状复叶，在鸟足状复叶的每个小叶片的主脉及叶柄上间隔3～5mm切割一次(切割深度要求不切断叶脉、叶柄)，然后接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基上进行诱导；

所述愈伤组织诱导/不定芽分化培养基为以下任一：

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ为含B5有机物的MS+NAA 0.75mg/l+BA0.45mg/l+30g/l蔗糖+琼脂6.9～7.0g/l,pH 5.8～6.0；

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ为含B5有机物的MS+BA 1mg/L+ZT 0.5mg/L+GA₃ 0.5mg/l+30g/l蔗糖+琼脂6.9～7.0g/l,pH 5.8～6.0；

所述诱导条件为：先于22～24℃暗培养2周然后转入22～26℃的光/暗交替培养；小叶片切口处形成愈伤组织(为颗粒状愈伤组织)，当此愈伤组织上分化获得高度为4～6cm的不定芽时，结束诱导培养；

说明：在此培养基上不需要进行转接培养，愈伤组织上能够直接形成不定芽；

6)、生根培养：

将步骤4)所得的无菌苗，或者步骤5)所得的不定芽转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为先于22～24℃暗培养2～3天，然后转入22～26℃的光/暗交替培养；当无菌苗/不定芽的基部产生长度≥3cm的6～10条根时结束生根培养；

所述生根培养基为以下任意一种：

改良MS+IBA 0.2～0.4mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0，

改良MS+NAA 0.02～0.04mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0；

7)、移栽(生根植株的移栽)：

将步骤6)所得的生根幼苗取出后，进行移栽。

作为本发明的浙江雪胆的组培快速繁殖方法的改进：

所述光/暗交替培养为：光照培养时，光照强度为35～40μmol.m^-2.s^-1，时间为16小时，温度为24～26℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为22～24℃；上述光照和黑暗培养交替进行。

作为本发明的浙江雪胆的组培快速繁殖方法的进一步改进：

含B5有机物的MS为在每1L的MS基本培养基加入烟酸1.0mg、盐酸吡哆醇1.0mg、和盐酸硫铵素10mg。

作为本发明的浙江雪胆的组培快速繁殖方法的进一步改进：

所述步骤4)中，待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节时，将其切成带1～2个节的茎段，重复进行步骤4)；从而实现茎段的快速扩增。

作为本发明的浙江雪胆的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤7)为：将装有步骤6)所得生根幼苗的培养容器置锻炼5～7天(于自然温度、光照的环境下锻炼)，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将幼苗基部的琼脂洗净后移栽到混合基质培养3～4周，开始的1～2周温度为22～24℃，相对湿度为70～80％；而后为自然温度和自然湿度。

混合基质由河沙：泥炭土：蛭石＝1：1：1的质量比混合而得。

在本发明中：

启动培养基的制备方法为：以MS基本培养基为基础，分别加入蔗糖、琼脂、BA，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HC1调节pH为5.8～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.5～2mg BA、30g蔗糖，6.9～7.0g琼脂。

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ的制备方法为：在1L的MS基本培养基加入烟酸1.0mg、盐酸吡哆醇1.0mg、和盐酸硫铵素10mg，得含B5有机物的MS；然后加入NAA 0.75mg、BA0.45mg、蔗糖30g+琼脂6.9～7.0g，均匀混合后调节pH为5.8～6.0。

其余培养基上文中告知的配方相应制备而得。

改良MS培养基为硝酸铵(NH₄NO₃)825mg/l，硝酸钾(KNO₃)950mg/l，氯化钙(CaCl₂.2H₂O)440mg/l，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)340mg/l，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)370mg/l，硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)55.6mg/l，乙二胺四乙酸二钠(Na₂.EDTA)74.6mg/l，碘化钾(KI)0.83mg/l，硼酸(H₃BO₃)6.2mg/l，硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)22.3mg/l，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/l，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/l，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/l，氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025mg/l，肌醇100mg/l，烟酸1.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，盐酸硫铵素10mg/l。余量为去离子水。

在本发明中：

因为浙江雪胆是雌、雄异株植物，野生状态，雄株多，雌株少，因为雌株与结实有关，所以需要知道植株的雌、雄性别。

步骤2)的清洗和灭菌为：将短茎段用自来水(1L自来水加入2～3滴洗洁精)充分洗涤后，置于流水中冲洗10min。然后在超净台上操作，先用75％酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％的升汞溶液灭菌5～6min，无菌水冲洗3～5次。

步骤5)、鸟足状复叶转移到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基上，暗中培养2周，在叶片主脉以及叶柄的切割处会形成黄绿色颗粒状的愈伤组织；然后转移到光/暗交替继续培养2～3周后，愈伤组织上会产生3～5个不定芽，不定芽的高度能达到4～6cm。

所述步骤6)中，一般光/暗交替培养3～4周，每个幼苗能产生6～10条根，根的长度≥3cm。

本发明将雌、雄株的茎段(带1～2个节)，长度约0.5～1cm长，消毒后放置于启动培养基上，约4～5周，腋芽发育成无菌幼苗；将幼苗的茎段再切成带有1～2个节的茎段转接于增殖培养基上进行增殖培养：约培养4～5周，可见茎段基部形成丛生芽，并发育成长的茎段。将丛生茎段在无菌条件下取出，用解剖刀分开，置于上述增殖培养基中培养，在4～5周的时间内，各茎段又可再生出新芽。

在本发明中：一种方式是通过已知性别的植株茎段的腋芽快速扩增来实现；另外一种繁殖方式是通过已知性别的无菌苗的叶片诱导愈伤组织，然后诱导愈伤组织进行不定芽的分化。包括已知性别块茎茎段的萌发,茎段的消毒，茎段腋芽的萌发，无菌苗茎段的切割与快速扩增，无菌苗叶片愈伤组织的诱导，愈伤组织不定芽的分化，生根培养及试管苗的移栽等。

本发明中利用已知性别的茎段进行快速扩增，此过程是芽生芽的途径，不经过愈伤组织阶段，能保持试管苗的遗传稳定性。

本发明中已知性别的无菌苗叶片能在一种培养基上实现叶片愈伤组织诱导以及愈伤组织上不定芽的分化。此操作减少了培养步骤，省时、省力(常规的培养是叶片先形成愈伤组织，愈伤组织再转入芽分化培养基上进行分化培养)。采用本发明提供的叶片愈伤组织诱导、芽分化培养的方法，为通过基因工程改良该植物，提高该植物次生代谢产物的含量提供了基础。

本发明利用已知性别的植株茎段进行快速繁殖，可以有目的地繁殖所需性别的植株；这是目前现有技术所没有涉及的。本发明初代启动培养采用MS培养基，在后续继代增殖培养时使用改良MS培养基，解决了植株连续在MS培养基上生长出现的黄化现象，BA的使用浓度也较低(0.5mg/l)。而现有的技术是使用MS培养基，添加BA 1mg/l+NAA 0.02-0.05mg/l。本发明生根培养时也采用改良MS培养基，所使用的生长素浓度很低(NAA 0.02mg/l，IBA0.2mg/l)，而现有技术使用MS培养基，NAA的浓度为1mg/l。本发明使用无菌苗的叶片作为外植体，在一种培养基上既能进行愈伤组织的诱导，同时又能使愈伤组织分化不定芽，而现有技术是叶片只能诱导出愈伤组织，愈伤组织容易黄化，不能分化形成不定芽。

本发明具有如下的技术优势：

(1)选用已知雌、雄的浙江雪胆块茎上萌发的茎段作为外植体；

浙江雪胆的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约。

(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便干工厂化生产。

(3)该技术方法解决了浙江雪胆快速繁殖过程中植株容易黄化、生长缓慢的难点，达到技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产。

(4)使用本发明提供的组培快繁技术得到的浙江雪胆幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的雪胆块茎成品，可以为临床应用提供品质稳定的原材料。

(5)可以保存浙江雪胆的种质资源，减少对自然资源的破坏。

综上所述，本发明通过大量试验，摸索出一套成熟的方法，成功实现了浙江雪胆雌、雄株的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量已知性别的试管苗，为该极小种群的恢复提供一条切实可行的繁殖方式，同时也为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为浙江雪胆的组培快繁图；

A.采自泰顺乌岩岭的浙江雪胆块茎上新萌发的茎段；

B.茎段的腋芽在MS+BA 2mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8的启动培养基上萌发；

C.萌发的无菌苗，将茎段再切成带有1～2个节的切段，去除叶片，在改良MS+BA0.5mg/l+蔗糖30g/L+琼脂7.3g/l,pH 5.8的培养上进行增殖培养；

D.长度为3～4cm的植株放在改良MS+NAA 0.02mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.3g/l，pH5.8的培养基上生根培养；

E.无菌苗叶片；

F.无菌苗叶片在(MS+B5有机物)+NAA 0.75mg/L+BA 0.45mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8的培养基上生长2周后形成的愈伤组织；

G.愈伤组织继续在(MS+B5有机物)+NAA 0.75mg/L+BA 0.45mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8的培养基上形成的不定芽；

H.无菌苗叶片在MS+B5有机物+BA 1mg/l+ZT 0.5mg/l+GA₃ 0.5mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8的培养基上形成的愈伤组织及其愈伤组织上分化的不定芽。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下案例中，黑暗培养(24小时全部黑暗培养)的温度为22～24℃；光/暗交替培养(22～26℃)时：光照培养时，光照强度为35～40μmol.m^-2.s^-1，时间为16小时，温度为24～26℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为22～24℃；上述光照和黑暗培养交替进行。

实施例1、一种浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：

(1)、取材：

在浙江雪胆的开花期(5～6月)，分别选择浙江雪胆的雌株和雄株，将地上部分的茎叶去除，将块茎挖出种在花盆中，待块茎上抽出新的茎段后，取材。

具体为：将块茎埋入河沙：泥炭土：蛭石(1：1：1的重量比)的基质中，等已知性别的块茎上重新发出幼嫩茎段，茎段长度达到50～100cm时，取此长茎段作为外植体。

(2)、茎段的消毒：

当步骤(1)所得的茎段为只带有1～2个节的短茎段时，直接取用该短茎段；

当步骤(1)所得的茎段为带有＞2个节的长茎段时，将长茎段分割成带有1～2个节的短茎段；

将短茎段用自来水(1L自来水加入2～3滴洗洁精)充分洗涤后，置于流水中冲洗10min。然后在超净台上操作，先用75％(体积％)酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％(质量％)的升汞溶液灭菌5～6min，无菌水冲洗3～5次；得消毒后茎段。

(3)、腋芽的启动培养：

所述启动培养基为MS+BA 0.5～2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9～7.0g/L,pH 5.8～6.0；

诱导培养条件为：光/暗交替培养。

当启动培养基上的茎段的腋芽萌发伸长至4～6cm时(一般为3～5个节)，结束启动培养。

(4)无菌苗茎段的快速扩增：

将步骤(3)所得的腋芽切成带1～2个节的茎段，且去除叶片，转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为改良MS+BA 0.5～1mg/l+NAA 0～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH为5.8～6.0；

增殖培养条件为：于22～26℃进行光/暗交替培养；

上述腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节时，将其切成带1～2个节的茎段，重复进行步骤4)；从而实现茎段的快速扩增。

(5)叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养：

取步骤4)所得的鸟足状复叶(无菌苗的叶片)，将鸟足状复叶的每个小叶片的主脉及叶柄可先作适当修剪(将叶片边缘及叶柄两端切去约1mm宽度)，然后间隔3～5mm切割一次(切割深度要求不切断叶脉、叶柄)，然后接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ或者接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ上进行诱导；

所述诱导条件为：先于22～24℃暗培养2周然后转入22～26℃的光/暗交替培养；暗培养2周后小叶片切口处会形成愈伤组织(为颗粒状愈伤组织)，然后进行光/暗交替培养，愈伤组织上分化获得高度为4～6cm的不定芽时，结束诱导培养；

说明：在此培养基上不需要进行转接培养，即，愈伤组织继续在上述培养基中培养能够直接形成不定芽。

(6)生根培养：

将步骤(4)所得的无菌苗，或者步骤(5)所得的不定芽转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为：先于22～24℃暗培养2～3天，然后转入22～26℃的光/暗交替培养；当无菌苗/不定芽的基部产生长度≥3cm的6～10条根时结束生根培养；

所述生根培养基为以下任意一种：

改良MS+IBA 0.2～0.4mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0，

改良MS+NAA 0.02～0.04mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.2～7.3g/l，pH 5.8～6.0。

(7)移栽：

将步骤(6)已生根的植株取出，栽培于河沙：泥炭土：蛭石(1：1：1)的混合基质上进行移栽。

具体为：已生根植株的培养瓶转移到自然温度、阴凉干燥的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水(液面高度约1～2mm)，再放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到河沙：泥炭土：蛭石(1：1：1)的混合基质上培养3～4周，开始1～2周温度为22～24℃，相对湿度为70～80％。随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。

按照实施例1所述方法进行如下实验：6月份采自浙江乌岩岭自然保护区的浙江雪胆雌、雄株(此时雄株在开花，雌株上已经有未成熟的果实，容易辨认植株的性别)，将植株的块茎带回实验室，去除地上部分，待块茎上萌发出新芽，以新萌发的茎段作为外植体。

实验1、

茎段腋芽启动的培养基为MS+BA 2mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8；生长4周，腋芽萌发伸长至平均高度为5.4cm(无菌苗的高度平均为5.4cm)。

增殖培养基为改良MS+BA 0.5mg/l+蔗糖30g/L+琼脂7.3g/l,pH 5.8。

每个节部位能产生3～4个芽，芽发育成无菌苗，平均长度达到5.8cm。将产生的无菌苗茎段又可以重复进行增殖培养。此方法的增殖倍数为12。

增殖倍数的计算公式为：每个节产生的不定芽的数目*芽伸长后节的数目。

选用步骤4)所得的无菌苗进行生根培养；

生根培养基为改良MS+IBA 0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.3g/l,pH 5.8。

3～4周可生根，生根率达到100％，植株平均高度为5.6cm，一个月后移栽到林下，成活率可达96.2％。

成活率的计算公式为移栽成活的植株数目/总的移栽植株的数目。

实验2、

茎段启动培养基为MS+BA 0.5mg/l+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/l,pH 5.8，

增殖培养基为改良MS+BA 0.5mg/l+NAA 0.05mg/l+蔗糖30g/L+琼脂7.3g/l,pH5.8增殖倍数为8。

选用步骤4)所得的无菌苗进行生根培养；

生根培养基为改良MS+NAA 0.02mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.3g/l，pH 5.8。

经过3～4周培养，生根率可达100％，植株平均高度达到6.0cm。炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达93.2％。

实验3、

步骤1)～步骤4)同实验1；

步骤5)中选用愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ，含B5有机物的MS+NAA 0.75mg/l+BA 0.45mg/l+30g/l蔗糖++琼脂6.9g/l,pH 5.8；

前2周置于暗中培养，愈伤组织从叶片边缘以及叶子主脉切割处形成，愈伤组织诱导率为86％。

再经过2～3周光/暗交替培养培养，在愈伤组织上能形成不定芽，不定芽的发生频率为45％。再继续光/暗交替培养2～3周，此愈伤组织上分化获得高度为4～6cm的不定芽；

将不定芽沿着基部切下，转移到生根培养基，

生根培养基的配方为改良MS+IBA 0.4mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.3g/l，pH 5.8。

经过3～4周培养，生根率可达100％，植株高度平均为5.6cm。炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达92.8％。

实验4、

步骤1)～步骤4)同实验1；

步骤5)中选用愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ，含B5有机物的MS+BA 1mg/L+ZT0.5mg/L+GA₃ 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6.9g/l,pH 5.8。

前2周置于暗中培养，愈伤组织从叶片边缘以及叶子主脉切割处形成，愈伤组织诱导率为83％。

再经过2～3周光/暗交替培养培养，在愈伤组织上能形成不定芽，不定芽发生的频率为58％，再继续光/暗交替培养培养1～2周，此愈伤组织上分化获得高度为4～6cm的不定芽；

将不定芽沿着基部切下，转移到生根培养基，生根培养基的配方为改良MS+NAA0.04mg/l+蔗糖20g/l+琼脂7.3g/l，pH 5.8。

经过3～4周培养，生根率可达100％，植株平均高度达到6.3cm。炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达94.5％。

对比例1-1、将实验1的增殖培养基中的改良MS改为MS，其余等同于实验1，则植株叶片颜色发黄，生长不良。最终所得的结果为增殖倍数6，移栽成活率为82.5％。

注：实验1的叶片没有出现发黄现象。

对比例1-2将实验1的增殖培养基中BA的浓度由0.5mg/l改为1.5mg/L，其余等同于实验1，由于BA浓度太高，植株产生矮化，植株基部产生不定芽的数量在4～6个，芽矮小并且有一定程度的玻璃化，不利于进一步增殖。

对比例1-3，取消实验1的生根培养基中IBA的使用，即，IBA浓度改为0mg/l，其余等同于实验1，经过3～4周培养，生根率为75％，且根短，细，数量少，移栽成活率为80％。

对比例2-1、将实验2中的增殖培养基中细胞分裂素由BA 0.5mg/L改为KT 0.5mg/L，其余等同于实验2，植株生长较缓慢。最终所得的结果：增殖倍数为3.3，移栽成活率为90.5％。

对比例2-2、将实验2生根培养基中NAA的浓度由0.02mg/l改成0.1mg/l，其余等同于实验2，经过3～4周培养，生根率为100％，根多，密集，数量多，但植株基部有较大的愈伤组织，移栽成活率为82.5％。

对比例2-3，将实验2步骤4)增殖培养中的“光/暗交替培”改成24小时的光培养；结果茎段的增殖倍数为4.8，部分植株出现黄化，移栽成活率为84％。

对比例3-1，将实验3步骤5)中的“前2周置于暗中培养”改成“前2周也是光/暗交替培养”，其余等同于实验3。

结果为愈伤组织上不定芽的分化率仅为35.3％，每一块愈伤组织上的不定芽的数量平均有2.1个，不定芽的平均高度为2.8cm。

对比例3-2，将实验3的愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ中的“NAA 0.75mg/l”改为“2,4-D 0.75mg/l”；其余等同于实验3。

愈伤组织的诱导率由86％增加到93％，但愈伤组织上不定芽的发生频率仅为21.5％。

对比例4-1，取消实验4中的愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ中ZT使用，即ZT浓度由0.5mg/l改为0，其余等同于实验4。

愈伤组织的诱导率为81％，但愈伤组织上不定芽的发生频率为31.5％。

对比例4-2，将实验4中的愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ中含B5有机物的MS改成改良MS，其余等同于实验4。

愈伤组织的诱导率为78％，愈伤组织上不定芽的发生频率为37.8％。

最后还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容，直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.浙江雪胆的组培快速繁殖方法，其特征在于利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，依次进行以下步骤：

1）、取材：

2）、茎段的消毒：

当步骤1）所得的茎段为只带有1～2个节的短茎段时，直接取用该短茎段；

当步骤1）所得的茎段为带有＞2个节的长茎段时，将长茎段分割成带有1～2个节的短茎段；

将所述短茎段进行清洗和灭菌，得消毒后茎段；

3）、腋芽的启动培养：

所述启动培养基为MS+ BA 0.5～2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.9～7.0 g/L，pH5.8～6.0；

诱导培养条件为：于22~26℃进行光/暗交替培养；

当启动培养基上的茎段的腋芽萌发伸长至4～6 cm时，结束启动培养；

4）、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增：

将步骤3）所得的腋芽切成带1~2个节的茎段，转接于增殖培养基上进行培养，

增殖培养基为改良MS+BA 0.5 mg/L +蔗糖 30 g/L+琼脂7.2～7.3 g/L，pH为5.8～6.0；

或者，增殖培养基为改良MS+ BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖 30 g/L+琼脂7.2～7.3 g/L，pH为5.8～6.0；

增殖培养条件为：于22~26℃进行光/暗交替培养；

待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节，且节上具有鸟足状复叶时，结束培养，得无菌苗；

5）、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养：

取步骤4）所得的鸟足状复叶，在鸟足状复叶的每个小叶片的主脉及叶柄上间隔3～5mm 切割一次，然后接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基上进行诱导；

所述愈伤组织诱导/不定芽分化培养基为以下任一：

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ为含B5有机物的MS+NAA 0.75 mg/L+ BA 0.45 mg/L+ 30 g/L 蔗糖+ 琼脂6.9～7.0 g/L , pH 5.8～6.0；

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ为含B5有机物的MS+BA 1 mg/L + ZT 0.5 mg/L +GA₃ 0.5 mg/L+ 30g/L 蔗糖+ 琼脂6.9～7.0 g/L, pH 5.8～6.0；

含B5有机物的MS为在1 L的MS基本培养基加入烟酸 1.0 mg、盐酸吡哆醇 1.0 mg、和盐酸硫铵素10 mg

诱导条件为：先于22～24℃暗培养2周，然后转入22~26℃进行光/暗交替培养；小叶片切口处形成愈伤组织，当此愈伤组织上分化获得高度为4～6 cm的不定芽时，结束诱导培养；

6）、生根培养：

将步骤4）所得的无菌苗，或者步骤5）所得的不定芽转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为：先于22～24℃暗培养2～3天，然后转入22~26℃进行光/暗交替培养；当无菌苗/不定芽的基部产生长度≥3cm的6～10条根时结束生根培养；

所述生根培养基为以下任意一种：

改良MS+ IBA 0.2～0.4 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂7.2～7.3 g/L，pH 5.8～6.0，

改良MS+ NAA 0.02～0.04 mg/L+蔗糖 20 g/L+ 琼脂7.2～7.3 g/L，pH 5.8～6.0；

7）、移栽：

将步骤6）所得的生根幼苗取出后，进行移栽；

改良MS培养基为：硝酸铵825 mg/L，硝酸钾950 mg/L ，氯化钙440 mg/L，磷酸二氢钾340 mg/L，硫酸镁370 mg/L，硫酸亚铁55.6 mg/L，乙二胺四乙酸二钠74.6 mg/L ，碘化钾0.83 mg/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸锰22.3 mg/L，硫酸锌8.6 mg/L，钼酸钠0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025 mg/L，肌醇 100 mg/L，烟酸 1.0 mg/L，盐酸吡哆醇 1.0 mg/L，盐酸硫铵素10 mg/L；余量为去离子水。

2.根据权利要求1所述的浙江雪胆的组培快速繁殖方法，其特征在于：

所述光/暗交替培养为：光照培养时，光照强度为35～40 µmol·m^-2·s^-1，时间为16小时，温度为24～26℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为22～24℃；上述光照和黑暗培养交替进行。

3.根据权利要求1或2所述的浙江雪胆的组培快速繁殖方法，其特征在于：

所述步骤4）中，待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节时，将其切成带1~2个节的茎段，重复进行步骤4）；从而实现茎段的快速扩增。