CN101926284B - 一种川附子组织培养及快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种川附子组织培养及快速繁殖方法，包括：外植体的选择与消毒灭菌、接种诱导愈伤组织、诱导丛生芽、诱导生根、炼苗移栽等主要步骤，通过以川附子茎尖、叶片、根、茎段、叶柄和种子等为外植体进行组织培养、诱导植株再生快速繁殖川附子种苗，其诱导率、分化率及生根率较高，移入栽培土后成活率高；可有效解决川附子生产中现行品种的抗病性差、产量低而不稳、品种混杂等问题，通过茎尖脱毒及利用组织培养手段等实现品种的提纯复壮，提供川附子优良品种，为川附子GAP基地等所需大量优质种苗的工厂化、规模化生产奠定良好的基础。

Description

一种川附子组织培养及快速繁殖方法

技术领域

本发明属于药材栽培技术领域，特别涉及一种川附子组织培养及快速繁殖的方法。

背景技术

附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)是毛茛科植物乌头Aconitumcarmichaeli Debx.的子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效；用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳痿、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿、阳虚外感、寒湿痹痛、阴疽疮疡等。

附子是四川传统道地中药材之一，具有重要的药用和经济价值。四川省江油市作为附子的道地产区，有1400多年的种植历史，2006年江油附子取得地理标志产品保护(2006年第41号公告)，是国家附子生产商品基地，产品行销全国和出口。但近年来在江油附子生产中出现了一些问题，附子种植面积日益萎缩，药农经济效益逐年下降，附子产业前景堪忧。主要原因有以下两点：其一，附子的频繁换种并缺乏统一管理，栽培品种存在不同程度的混乱和混杂现象，严重影响了附子的产品质量及其药用价值。其二，附子生产长期采用无性繁殖，病害累积，其中霜霉病、白绢病、根腐病等病害频繁发生，导致附子产量降低，生产成本增加，严重影响和制约着附子生产的发展。

目前乌头的人工栽培主要靠子根繁殖，耗种量大，而且由于病毒感染等原因造成种性退化，产量和品质降低，每年需在高山留种换种，难以适应规模化和标准化生产的需要，通过组织培养实现种苗脱毒生产是解决上述问题的主要途径之一。

组织培养特别是药用植物的组织培养存在种群差异，甚至同一植株的不同组织、不同器官在组织培养时都可能存在较大差异。胡延玉(植物生理学通讯，1985，16(2)：37-40)利用茎尖和带腋芽茎段培养获得再生植株，但所用培养基成分复杂，生长周期长。林静等(贵州科学，1998，16(2)：120)利用贵州乌头叶片和幼茎进行培养，叶片只诱导出愈伤组织阶段而未分化出芽。关文灵等(中草药，2003，34(6)：561-563)以云南乌头试管苗的叶片为外植体，通过直接诱导不定芽的途径得到再生苗。王跃华等(中国中药杂志，2005，30(15)：1197-1199)以叶柄为外植体得到再生苗。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述附子生产中存在的问题，提供一种川附子组织培养及快速繁殖方法，主要解决川附子生产中现行品种的抗病性差、产量低而不稳、品种混杂等问题，为川附子GAP生产奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种川附子组织培养及快速繁殖方法，包括下述主要步骤：

第一步：外植体的选择与消毒

三月份选取一年生健壮川附子(乌头)植株的茎尖、叶片、根、茎段、带腋芽的茎段、叶柄、或者上一年收取的种子等(以茎尖、叶片、茎段、带腋芽的茎段为佳)为外植体(作为接种材料)，低温4℃处理3天；用自来水冲洗干净，用70～75％酒精处理15～20s，0.1％升汞液浸泡10～12min，倒去升汞液，用无菌水换洗4～5次；将茎尖剥离后切成0.2mm长，根、茎段、带腋芽的茎段及叶柄切成1.5cm左右(可为1.3～1.7cm)，叶片切成1cm×1cm方块(种子不需切)，待用；

第二步：接种、诱导愈伤组织

以MS为基本培养基，在基本培养基中附加NAA(α-萘乙酸)0.1～0.2mg/L+6-BA(6-苄基腺嘌呤)1.0～4.0mg/L作为诱导愈伤组织的培养基，将上述第一步处理好的外植体按常规方法接种进行愈伤组织诱导，黑暗培养28～32天左右，得到愈伤组织；

第三步：诱导丛生芽

在MS基本培养基中附加NAA 0.1～0.2mg/L+6-BA 2.0～2.5mg/L作为分化培养基诱导丛生芽，将上述第二步获得的愈伤组织转接到该分化培养基上，进行丛生芽诱导，光照培养28～32天左右，诱导出丛生芽；

第四步：诱导生根

在MS基本培养基中附加IBA(吲哚丁酸)1.0mg/L+AC(活性碳)3.0g/L⁺PVP(聚乙烯吡咯烷酮)3.0g/L作为生根培养基，将上述第三步长至3～5cm的丛生芽转接到该生根培养基上诱导根的形成，培养时间为20～25天左右，得到生根的试管苗；

第五步：炼苗移栽

待上述第四步的试管苗在生根培养基上培养至根长4～5cm、植株6～7cm后，选择健壮幼苗打开瓶盖进行炼苗，室温炼苗2～3天后，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至用0.1％多菌灵处理过的腐质土与珍珠岩混合基质中(腐质土与珍珠岩以体积比为2∶1为佳)，置于温度22±1℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx的生长室内，薄膜覆盖，保持环境湿润，一周后去掉薄膜转入大田栽培。

上述MS基本培养基，优选下述经过改良的MS培养基：其中主要在原有MS培养基的基础上增加了KH₂PO₄(磷酸二氢钾)的用量，原MS培养基中用量为170mg/L；现增加为200mg/L。此外，蔗糖3％、琼脂粉0.4％；pH为5.8等参数均同原MS培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过长期大量的试验研究及分析总结，建立起通过以川附子茎尖、叶片、根、茎段、叶柄和种子等为外植体进行组织培养、建立川附子的快速繁殖体系，其诱导率、分化率及生根率较高，移入大田栽培后存活率高；可有效解决川附子生产中现行品种的抗病性差、产量低而不稳、品种混杂等问题，通过茎尖脱毒及利用组织培养手段等实现品种的提纯复壮，为提供川附子优良品种及附子GAP基地等所需大量优质种苗的工厂化、规模化生产奠定良好的基础。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

发明人以选自四川平武附子种源基地的川附子植株为材料(分别选取植株的茎尖、叶片、根、茎段、带腋芽的茎段、叶柄、和上一年收取的种子等为外植体)，采用不同激素配比的培养基，通过组织培养诱导愈伤组织进行快速繁殖，观察不同外植体的发育情况，为选育川附子优良品种提供理论和试验依据；以下所述为其中部分试验情况。

各实施例中所述的诱导率和分化率分别通过下述公式计算而得：

诱导率＝有愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100％；

分化率＝出芽愈伤数/接种愈伤数×100％。

下述实施例中所用的MS基本培养基，均是指经过改良的MS培养基：其中KH₂PO₄(磷酸二氢钾)的用量为200mg/L；另含蔗糖3％、琼脂粉0.4％等；pH为5.8。

实施例1

本实施例选取四川平武附子种源基地的川附子植株的茎尖为外植体，通过组织培养诱导愈伤组织进行快速繁殖，包括下述主要步骤：

第一步：外植体的选择与消毒

在四川平武附子种源基地，于三月份选取一年生健壮乌头植株的茎尖为外植体(作为接种材料)，低温4℃处理3天；用自来水冲洗干净，用75％酒精处理15～20s，0.1％升汞液浸泡10～12min，倒去升汞液，用无菌水换洗4～5次；将茎尖剥离后切成0.2mm长，待用；

第二步：接种、诱导愈伤组织

以MS为基本培养基，在基本培养基中附加NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L作为诱导愈伤组织的培养基，将上述第一步处理好的外植体按常规方法接种进行愈伤组织诱导，每个处理接种15只试管，每只试管1个外植体，三次重复，黑暗培养30天左右，得到愈伤组织；

计算诱导率，结果为90.0％；

第三步：诱导丛生芽

在MS基本培养基中附加NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L作为分化培养基诱导丛生芽，将上述第二步获得的愈伤组织转接到该分化培养基上，进行丛生芽诱导，光照培养30天左右，得到丛生芽；

计算分化率，结果为83.3％；

第四步：诱导生根

在MS基本培养基中附加IBA 1.0mg/L+AC 3.0g/L⁺PVP 3.0g/L作为生根培养基，将上述第三步长至3～5cm的丛生芽转接到该生根培养基上诱导根的形成，培养时间为20天左右，得到生根的试管苗；

生根率达到95％；

第五步：炼苗移栽

待上述第四步的试管苗在生根培养基上培养至根长4cm左右、植株6cm左右，打开瓶盖，室温炼苗2～3天后，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至用0.1％多菌灵处理过的腐质土与珍珠岩混合基质中(腐质土与珍珠岩体积比为2∶1)，置于温度22±1℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx的生长室内，薄膜覆盖，保持环境湿润，一周后转入大田栽培，每天浇水一次；

成活率达96％以上。

实施例2

本实施例选取四川平武附子种源基地的川附子植株叶片为外植体，通过组织培养进行快速繁殖，包括下述主要步骤：

第一步：外植体的选择与消毒

在四川平武附子种源基地，于三月份选取一年生健壮乌头植株的叶片为外植体(作为接种材料)，低温4℃处理3天；用自来水冲洗干净，用70％酒精处理15～20s，0.1％升汞液浸泡10～12min，倒去升汞液，用无菌水换洗4～5次；将叶片切成1cm×1cm方块，待用；

第二步：诱导愈伤组织

以MS为基本培养基，在基本培养基中附加NAA 0.2mg/L+6-BA 4.0mg/L作为诱导愈伤组织的培养基，将上述第一步处理好的外植体按常规方法接种进行愈伤组织诱导，每个处理接种15只试管，每只试管1个外植体，三次重复，黑暗培养32天左右，得到愈伤组织；

计算诱导率，结果为90.0％；

第三步：接种、诱导丛生芽

在MS基本培养基中附加NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L作为分化培养基诱导丛生芽，将上述第二步获得的愈伤组织转接到该分化培养基上，进行丛生芽诱导，光照培养32天左右，得到丛生芽；

计算分化率，结果为80.8％；

第四步：诱导生根

在MS基本培养基中附加IBA 1.0mg/L+AC 3.0g/L⁺PVP 3.0g/L作为生根培养基，将上述第三步长至3～5cm的丛生芽转接到该生根培养基上诱导根的形成，培养时间为20天左右，得到生根的试管苗；

生根率达到95％；

第五步：炼苗移栽

待上述第四步的试管苗在生根培养基上培养至根长4cm左右、植株6cm左右，打开瓶盖，室温炼苗2～3天后，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至用0.1％多菌灵处理过的腐质土与珍珠岩混合基质中(腐质土与珍珠岩体积比为2∶1)，置于温度22±1℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx的生长室内，薄膜覆盖，保持环境湿润，一周后转入大田栽培，每天浇水一次；

成活率达90％以上。

实施例3

本实施例选取四川平武附子种源基地的川附子植株的茎段及带腋芽的茎段为外植体，通过组织培养诱导愈伤组织进行快速繁殖，包括下述主要步骤：

第一步：外植体的选择与消毒

在四川平武附子种源基地，于三月份分别选取一年生健壮川附子植株的茎段及带腋芽的茎段为外植体(作为接种材料)，低温4℃处理3天；用自来水冲洗干净，用70％酒精处理15～20s，0.1％升汞液浸泡10～12min，倒去升汞液，用无菌水换洗4～5次；将茎段及带腋芽的茎段切成1.5cm左右，待用；

第二步：接种、诱导愈伤组织

以MS为基本培养基，在基本培养基中附加NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L作为诱导愈伤组织的培养基，将上述第一步处理好的外植体按常规方法接种进行愈伤组织诱导，每个处理接种15只试管，每只试管1个外植体，三次重复，黑暗培养28天左右，得到愈伤组织；

计算诱导率，结果为90.0％；

第三步：诱导丛生芽

在MS基本培养基中附加NAA 0.1mg/L+6-BA 2.5mg/L作为分化培养基诱导丛生芽，将上述第二步获得的愈伤组织转接到该分化培养基上，进行丛生芽诱导，光照培养28天左右，得到丛生芽；

计算分化率，结果为89.0％；

第四步：诱导生根

在MS基本培养基中附加IBA 1.0mg/L+AC 3.0g/L⁺PVP 3.0g/L作为生根培养基，将上述第三步长至3～5cm的丛生芽转接到该生根培养基上诱导根的形成，培养时间为25天左右，得到生根的试管苗；

生根率达到95％；

第五步：炼苗移栽

待上述第四步的试管苗在生根培养基上培养至根长4cm左右、植株6cm左右，打开瓶盖，室温炼苗2～3天后，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至用0.1％多菌灵处理过的腐质土与珍珠岩混合基质中(腐质土与珍珠岩体积比为2∶1)，置于温度22±1℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx的生长室内，薄膜覆盖，保持环境湿润，一周后转入大田栽培，每天浇水一次；

成活率达96％以上。

发明人还选取四川平武附子种源基地的川附子植株的根、叶柄、种子等为外植体，进行了上述组织培养及快速繁殖的试验研究，获得了不同程度的诱导率、分化率及生根率等。

Claims (4)

1.一种川附子组织培养及快速繁殖方法，其特征在于： 

第一步：外植体的选择与消毒 

三月份选取一年生健壮川附子植株的茎尖、叶片、根、茎段、叶柄、或者上一年收取的种子为外植体，低温4℃处理3天；用自来水冲洗干净，用70～75%酒精处理15～20s，0.1%升汞液浸泡10～12min，倒去升汞液，用无菌水换洗4～5次；将茎尖剥离后切成0.2mm长，根、茎段及叶柄切成1.3～1.7cm，叶片切成1cm×1cm大小，待用； 

第二步：接种、诱导愈伤组织 

以MS为基本培养基，在基本培养基中附加NAA 0.1～0.2 mg/L+6-BA 1.0～4.0 mg/L作为诱导愈伤组织的培养基，将上述第一步处理好的外植体按常规方法接种进行愈伤组织诱导，黑暗培养28～32天，得到愈伤组织； 

第三步：诱导丛生芽 

在MS基本培养基中附加 NAA 0.1～0.2 mg/L+6-BA 2.0～2.5 mg/L作为分化培养基诱导丛生芽，将上述第二步获得的愈伤组织转接到该分化培养基上，进行丛生芽诱导，光照培养28～32天，诱导出丛生芽； 

第四步：诱导生根 

在MS基本培养基中附加IBA 1.0 mg/L＋AC 3.0 g/L＋PVP 3.0g/L作为生根培养基，将上述第三步长至3～5cm的丛生芽转接到该生根培养基上诱导根的形成，培养时间为20～25天，得到生根的试管苗；

第五步：炼苗移栽 

待上述第四步的试管苗在生根培养基上培养至根长4～5cm、植株6～7cm，选择健壮幼苗打开瓶盖进行炼苗，室温炼苗2～3天后，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至用0.1%多菌灵处理过的腐殖土和珍珠岩混合基质中，置于温度22±1℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx的生长室内，薄膜覆盖，保持环境湿润，一周后去掉薄膜转入大田栽培；

上述各步中的MS基本培养基是指经过改良的MS培养基，其中KH₂PO₄的用量为：200mg/L。

2.根据权利要求1所述的川附子组织培养及快速繁殖方法，其特征在于： 所述的第一步中的外植体选自一年生健壮无病害的川附子植株的茎尖、叶片、茎段，经低温4℃处理3天后用于消毒、接种、诱导。

3.根据权利要求1所述的川附子组织培养及快速繁殖方法，其特征在于： 所述的第五步中的腐殖土和珍珠岩混合基质，为腐殖土与珍珠岩以体积比为2:1的混合基质。

4.根据权利要求1、2或3所述的川附子组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述茎段为带腋芽的茎段。